Gambar 1. Struktur Imunoglobulin (williams 2007)

Transkripsi

1 9 II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 IMUNOGLOBULIN G Menurut Webster dictionary (2002), Imunoglobulin G yang disingkat sebagai IgG adalah kelas terbesar dari kelompok imunoglobulin yang ditemukan dalam darah, termasuk antibodi, yang paling umum ditemukan dalam sirkulasi darah sebagai gamma globulin. Fungsi biologis dari imunoglobulin dalam susu sapi dan kolostrum adalah untuk mencegah kelenjar mamae dari bakteri patogen dan untuk memberikan suatu imunitas anak sapi terhadap patogen. Menurut Hurley (2001), Imunoglobulin atau antibodi yang terkandung dalam kolostrum atau susu sama seperti didalam darah atau sekresi mukosal. Imunogobulin adalah sekelompok glikoprotein yang terdapat dalam serum atau cairan tubuh pada hampir semua mamalia. Imunoglobulin termasuk dalam glikoprotein yang mempunyai struktur dasar sama, komponen polipeptida membawa sifat biologik molekul antibodi tersebut. Struktur immunoglobulin tercantum pada Gambar 1. Gambar 1. Struktur Imunoglobulin (williams 2007)

2 10 Bila dibandingkan dengan protein dari susu atau kolostrum lainnya maka imunoglobulin relatif lebih resisten terhadap digesti gastrointestinal. Namun bersifat termolabil terutama bila terpapar suhu tinggi, misalnya bila terpapar pada suhu 75 C selama 5 menit akan menurun konsentrasinya hingga 40% dan pada suhu 95 C selama 15 detik menurun hingga 100%. Antibodi mempunyai dua fungsi yaitu mengikat antigen secara spesifik dan memulai reaksi fiksasi komplemen serta pelepasan histamin dari sel mast. Imunoglobulin terbagi atas 5 kelas immunoglobulin yaitu IgM, IgA, IgG, IgE, dan IgD. Tiap kelas mempunyai perbedaan sifat fisik, tetapi pada semua kelas terdapat tempat ikatan antigen spesifik dan aktivitas biologik berlainan. Susunan imunoglobulin ini merupakan penyusunan daerah simetris rangkaian asam amino yang dikenal sebagai daerah domain, yaitu bagian dari rantai H atau rantai L yang diapit oleh ikatan disulfid interchain, sedangkan ikatan antara 2 rantai dihubungkan oleh ikatan disulfid interchain. Rantai L mempunyai 2 tipe yaitu kappa dan lambda, sedangkan rantai H terdiri dari 5 kelas, yaitu rantai G (γ), rantai A (α), rantai M (µ), rantai E (ε) dan rantai D (δ). Setiap rantai mempunyai jumlah domain berbeda. Rantai pendek L mempunyai 2 domain; sedang rantai G, A dan D masing-masing 4 domain, dan rantai M dan E masing-masing 5 domain. Imunoglobulin G (IgG) adalah jenis imunoglobulin yang utama dalam kolostrum dan susu sapi. IgG terdiri dari beberapa subkelas diantaranya IgG1 dan IgG2 dan merupakan imunoglobulin terbesar dalam serum. IgG mempunyai berat molekul: 150,000 dengan tipe rantai H: gamma dan konsentrasi serum mg/ml, dan total IgG dalam serum 75%, glikosilasi 3%, dan terdistribusi pada intra-ektsravaskular. IgG mempunyai multifungsi seperti opsonisasi, complement fixation, pencegahan adesi mikroba patogen ke dalam serum dalam endothelial lining, inhibisi

3 11 metabolisme bakterial dengan membloking enzim, aglutinasi bakteri dan netralisasi toksin dan virus (Marnila dan Korhonen dalam Mehra 1992). Sejak tahun 1980 sejumlah metode dikembangkan untuk mengisolasi dan memurnikan imunoglobulin dari kolostral dan cheese whey, metode yang digunakan berdasarkan pada ultrafiltrasi (UF) atau kombinasi antara UF dan kromatografi (Korhonen 2000). Beberapa literatur telah menyebutkan beberapa metode yang digunakan untuk isolasi, ekstraksi, konsentrasi dan purifikasi imunoglobulin G dari susu/kolostrum. Tetapi tidak semua metode dilaporkan hanya beberapa metode yang sesuai dengan produksi secara masal yang diterbitkan. Pada abad keduapuluh dan kemajuan yang begitu cepat dari pemisahan menggunakan teknologi kromatografi, maka sangat memungkinkan untuk mengisolasi individual protein dalam skala besar (Korhonen 2004). Untuk produksi crude imunoglobulin dengan pendekatan yang sangat efektif adalah menggunakan kombinasi dari teknologi membran yang berbeda. Tetapi untuk meningkatkan recovery rate imunoglobulin dari whey dan meningkatkan konsentrasinya dalam produk akhir maka masih diperlukan teknik kromatografi yang spesifik. 2.2 SUSU BUBUK SKIM Susu adalah cairan berwarna putih yang dihasilkan oleh kelenjar susu baik mamalia maupun manusia dan mengandung banyak vitamin dan protein (Spreer 1998). Umumnya yang disebut dengan susu adalah susu sapi, sedangkan untuk susu dari hewan lainnya, secara spesifik akan disebutkan dari mana asalnya seperti susu kambing, susu domba dan sebagainya. Umumnya Susu merupakan bahan makanan bernilai gizi tinggi, kandungan gizinya lengkap dengan sifat gizi yang mudah dicerna dan diserap oleh tubuh dipandang dari segi gizinya, susu merupakan makanan yang hampir sempurna dan merupakan salah satu makanan tertua dan pada waktu yang bersamaan merupakan salah satu makanan yang sangat penting.

4 12 Menurut Spreer (1998) susu adalah suatu sekresi yang komposisinya sangat berbeda dari komposisi darah yang merupakan asal susu. Misalnya lemak susu, kasein, laktosa yang disintesa oleh alveoli dalam ambing, tidak terdapat ditempat lain mana pun dalam tubuh sapi. Sejumlah besar darah harus mengalir melalui alveoli dalam pembuatan susu yaitu sekitar 50 kg darah butuhkan untuk menghasilkan 30 liter susu. Komposisi susu sangat beragam tergantung pada beberapa factor. Menurut Buckle (1985) angka rata rata komposisi susu untuk semua jenis sapi adalah sebagai berikut : lemak 3%, protein 3,4%, laktosa 4,8%, abu 0,72%, dan air 87,10%, disamping itu juga mengandung bahan bahan lain dalam jumlah sedikit seperti sitrat, enzim enzim, fosfolipid, vitamin A, vitaminb dan vitamin C. Komposisi susu dari hewan lain selain sapi dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel1. Komposisi beberapa jenis susu pada mamalia dan manusia Jenis Materia kering (%) Lemak (%) Total prot. (%) Kase in (%) Whey prot. (%) Laktosa (%) Abu (%) Manusia Sapi Kambing , Domba Keledai Kuda Kerbau Unta Lama Yak 17,3 6,5 5, ,6 0,9 Rusa 21,5 10,0 8, ,8 1,5 Rusa kutub Sumber : Buckle (1985) 33,1 16,9 11, ,8 -

5 13 Susu bubuk skim adalah bagian susu yang tertinggal sesudah krim diambil sebagian atau seluruhnya. Susu skim mengandung semua zat makanan dari susu kecuali lemak dan vitamin yang larut dalam lemak. Menurut Codex (2007) komposisi susu bubuk skim terdiri dari lemak susu maksimum 1,5%, air maksimum 5% dan protein susu dalam padatan susu non fat minimum 34% (Buckle 1985). Definisi susu skim yang tercantum dalam kategori pangan yang dikeluarkan oleh Badan POM (2006) adalah produk susu yang sebagian besar lemaknya telah dihilangkan dan dipasteurisasi atau disterilisasi atau diproses dengan UHT dan persyaratan minimum kadar lemak susu tidak lebih dari 0,15% dan kadar protein tidak kurang dari 3%. Susu skim dapat digunakan oleh orang yang menginginkan nilai kalori rendah di dalam makanannya, karena susu hanya mengandung 55% dari seluruh energi susu, dan susu skim juga digunakan dalam pembuatan keju dengan lemak rendah dan yoghurt (Buckle 1985). Mattila (2003) mengkategorikan produk susu atas 3 kategori, 1. basic product (susu, susu fermentasi, keju, es krim, dll). 2. Added value product, dimana komposisi susu telah berubah misalnya produk rendah laktosa atau bebas laktosa, formula hipoalergenik dengan protein terhidrolisa untuk bayi yang hipersensitif terhadap susu, produk susu diperkaya dengan mineral atau vitamin sehingga produk ini dimaksudkan untuk kelompok konsumen dengan target tertentu. 3. produk susu yang secara fungsional untuk meningkatkan kesehatan, produk susu diperkaya dengan komponen fungsional ataupun ingredien dari susu. Walaupun susu merupakan makanan dan pada dasarnya adalah pangan yang mengandung zat gizi dan protein, namun untuk meningkatkan fungsinya sebagai pangan dengan klaim kesehatan dapat meningkatkan imunitas masih diperkaya dengan IgG. Pada pemasarannya dapat dilihat klaim dari produsen bahwa susu bubuk skim yang mengandung IgG adalah susu bubuk skim yang mengandung kolostrum. Di Amerika dan Australia susu

6 14 yang diperkaya dengan IgG sudah dipasarkan sejak tahun 1998 dengan bahan aktif yang disebut ekstrak kolostrum (Mattila 2005). 2.3 ENZYME LINK IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) Imunologi merupakan ilmu yang relatif baru dikembangkan pada masa sekarang, dan immnuoassay adalah salah satu dari pengembangan metode dari cabang ilmu ini. Perkembangan immunoassay semakin luas dan digunakan untuk metode standar pada analisis pangan karena spesifisitas, sensitivitas dan simplisitasnya. Immunoassay juga digunakan untuk menganalisa residu dalam pangan, identifikasi bakteri dan virus, serta deteksi protein (Sporns 2004). Ada beberapa jenis immunoassay diantaranya Radial Immunodifusion (RID), Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Nephelometry, Turbidometry, dan Rocket Electro-Phoresis (RIEP). Enzyme Link Immunosorbent Assay, disingkat ELISA, telah berkembang sampai pada tingkatan untuk kemampuan kinerja dengan berbagai konfigurasi (Burgess 1995). Beberapa Kit untuk immuno Assays secara komersial sudah tersedia (RID and ELISA). Metode ELISA telah banyak mengalami perubahan sejak teknik ini pertama kali dipublikasikan, ciri utamanya adalah menggunakan indikator enzim untuk reaksi imunologi. Banyak pilihan untuk konfigurasi metode ELISA sehingga peneliti dapat menggunakan konfigurasi uji yang identik penampilan atau kinerjanya. Bila ingin menggunakan teknik ELISA dapat memulainya dengan konfigurasi yang relatif sederhana dan menggunakannya untuk menjajagi pilihan yang lain. Konfigurasi sederhana ini dapat digunakan untuk membakukan serangkaian reagen yang kemudian dapat digunakan untuk mengembangkan teknik tersebut lebih lanjut. Konfigurasi yang paling sederhana adalah ELISA langsung (Gambar 2), antigen secara langsung diadsorbsikan ke suatu substrat padat. Permukaan substrat dicuci dengan antibodi yang ditempeli enzim digunakan untuk

7 15 menunjukkan adanya antigen dan hasilnya akan terlihat bila ditambahkan substra dan antiserum harus dikonjugasikan pada enzim. Keterbatasan konfigurasi ini berkaitan dengan sifat pengikatan substrat padat dan kualitas antibodi indikator. Teknik ini kurang fleksibel, dan konfigurasi ini biasanya digunakan pada uji untuk mengenali suatu antigen. Gambar 2. ELISA langsung (Burgess 1995) Konfigurasi kedua adalah ELISA tidak langsung, umumnya digunakan untuk mengukur antibodi (Gambar 3). Antigen teradsorbsi pada substrat padat, antibodi primer tidak berlabel dan dapat diperoleh dari serum atau cairan tubuh lain. Antibodi sekunder terikat pada enzim yang sesuai dan antibodi ini biasanya disebut konjugat serta hasil akan terlihat bila ditambahkan substrat. Antigen dan antibodi sekunder biasanya dibuat konstan dan yang berubah adalah antibodi primer. Kelemahan utama konfigurasi ini terletak pada tidak adanya spesifisitas karena sebagai akibat bereaksi dengan antigen yang tidak murni. Ketidakmurnian disebabkan sampel kemungkinan masih mengandung antigen dalam jumlah yang sangat kecil atau dari antiserum yang ditambahkan sehingga reaksi tidak spesifik.

8 16 Gambar 3. ELISA tidak langsung (Burgess 1995) Konfigurasi ketiga adalah ELISA penangkap antigen atau Sandwich ELISA, dimana pada konfigurasi ini menggunakan antibodi yang terikat pada fase padat untuk menangkap antigen secara spesifik (Gambar 4). Antibodi penangkap, antigen dan sistem indikator dibuat konstan dan yang berubah adalah titer antibodi primer untuk antigen spesifik. Bila digunakan antibodi dari berbagai spesies, maka hanya reaksi spesifik yang diinginkan saja yang diamati, karenanya jika mungkin perlu dipilih antibodi yang dimurnikan berdasar afinitas. Sebagai alternatif adsorbsi berdasar afinitas adalah menambahkan imunoglobulin knde dalam pengencer. Gambar 4. Sandwich ELISA (Burgess 1995)

9 17 ELISA penangkap antigen mempunyai potensi untuk meningkatkan spesifitas ELISA tidak langsung asalkan antibodi penangkapnya dapat menghindarkan penempelan antigen yang ada dalam jumlah kecil yang dapat mengganggu spesifitas tidak langsung. Penggunaan antibodi monoklonal digabung dengan antigen murni atau antigen yang sudah dimodifikasi dapat memperbaiki spesifitas. Konfigurasi yang keempat adalah ELISA penangkap antibodi, konfigurasi ini menggunakan antiglobulin yang terikat pada substrat padat. Antibodi sampel yang diuji ditangkap dan sistem indikator menempel antigen berlabel. Konfigurasi ini yang paling umum digunakan pada uji yang spesifik terhadap isotipe, misalnya anti-m, diikatkan pada substrat padat (Patterson 1998). Antigen berlabel enzim kemudian ditambahkan, baik yang dilabel secara langsung maupun dilabel lewat ikatan tidak langsung seperti antibodi monoklonal atau biotin/streptavidin dan densitas optik berkaitan dengan kadar IgM spesifik sampel uji. Konfigurasi kelima adalah ELISA kompetitif atau ELISA pemblok, teknik ini dapat digunakan dalam sejumlah konfigurasi dasar, kompetisi dapat terhadap antigen atau terhadap antibodi. Pengujian pada kompetisi antibodi membutuhkan antigen untuk ditangkap antibodi secara langsung maupun lewat antibodi spesifik ke substrat padat. Antibodi yang telah dikenal berkompetisi dengan antibodi yang tidak dikenal untuk mendapatkan tempat penempelan pada antigen. Antibodi yang telah diketahui dapat dilabel atau dapat dideteksi menggunakan antibodi antispesiesnya. Perlu diketahui bahwa untuk konfigurasi ELISA kompetitif harus dibatasi hanya untuk penambahan dua antibodinya dilakukan secara bersamaan. Umumnya konfigurasi ini digunakan untuk mengukur hapten. Prinsip uji dari ELISA berdasarkan pada ikatan spesifik antigen pada antibodi (Ab primer) dengan antibodi sekunder (anti-species Ig) yang dilabel enzim, kemudian target akan diuraikan oleh enzim yang terdapat di dalam

10 18 substrat untuk selanjutnya hasil urai reaksi enzim lebih lanjut akan bereaksi dengan chromogen dan terbentuk warna yang dapat dikuantitasi dan proporsional dengan jumlah antibodi yang ada dalam sampel. Pembacaan densitas optik (OD) dari warna yang terbentuk selanjutnya diukur. Tahapan prosedur uji sandwich ELISA seperti tercantum pada Gambar 5. Gambar 5. Tahapan prosedur Sandwich ELISA ( Pomeranz 2000) Setiap konfigurasi harus diperhatikan, terutama variasi yang ada meliputi substrat padat, antigen, penyangga pelapis, cara pelapisan, jenis antibodi, pengencer, substrat, cara pembacaan hasil dan interpretasi hasil. Setiap konfigurasi harus diperhatikan, terutama variasi yang ada meliputi substrat padat, antigen, penyangga pelapis, cara pelapisan, jenis antibodi, pengencer, substrat, cara pembacaan hasil dan interpretasi hasil. Konfigurasi ELISA yang paling umum menggunakan substrat, pada

11 19 mulanya enggunakan permukaan gelas (Burgess,1995) yang dimaksudkan untuk meningkatkan adsorbsi baik untuk antigen maupun antibodi, sekarang plastik telah hampir secara universal diterima sebagai pilihan untuk substrat padat. Diperkirakan proses yang dilakukan adalah dengan maksud untuk pengikatan gugus hidrofobik dan pencucian dengan larutan deterjen menjamin pengikatan lebih lanjut. Kriteria dalam memilih substrat padat tidak hanya berdasar pada jumlah antigen atau antibodi yang akan mengadsorbsi. Banyaknya adsorbsi harus dapat diulangi dalam microplate, jumah protein yang teradsorbsi pada tiap sumuran harus pada batas tertentu. Apabila merancang suatu pengujian maka sebaiknya pada stadium awal dirancang pemilihan substrat padat yang sesuai (Burgess 1995). Pilihan meliputi membran, plate, tabung, tabung kapiler, batang atau manik manik. Polimer harus merupakan suatu bahan yang akan mengadsorsi sampel yang dikehendaki dalam jumlah banyak namun dengan variasi minimal dari pengujian ke pengujian. Polimer yang digunakan bisa bermacam macam namun dasar pemilihan harus ditentukan sesuai dengan tujuan pengujian. Antigen atau antibodi dapat secara pasif teradsorbsi pada permukaan padat dan keragaman dapat terjadi karena perbedaan ph, kekuatan ion dan komposisi penyangga. Variasi dapat berupa terjadinya pengeringan penyangga pelapis sehingga pelapisan antigen pada plastik tidak terjadi. Selain itu perbedaan suhu akan berpengaruh pada pengikatan antigen, misalnya pada suhu tinggi pengikatan antigen dapat menyebabkan pengaruh pinggir pada microplate. Sebagian besar larutan pencuci mengandung deterjen yang digunakan untuk mengurangi reaksi pengikatan non-spesifik. Deterjen dalam penyangga pelapis dapat menaikkan atau menurunkan pelapisan komponen spesifik. Pemilihan penyangga juga harus diperhatikan karena mempunyai pengaruh yang besar terhadap hasil pengujian, perlu dicari pengaruh berbagai penyangga dan pemblok. Keragaman terbesar dalam

12 20 merancang ELISA dapat dilihat dalam pemilihan konjugat dan substratnya. Berbagai enzim telah tersedia, enzim secara langsung ke antibodi atau antigen atau secara tak langsung melalui jembatan protein A. Umumnya tiap enzim memerlukan sejumlah substrat, sehingga keuntungan dapat diperoleh dengan membuat kombinasi enzim dan substrat tertentu sehingga diperoleh cara yang optimal. Saat ini sudah dapat diperoleh antiserum komersial dengan kualitas yang baik dan titer tinggi untuk mengikat enzim, sehingga sensitifitas dan spesifisitas makin baik. Umumnya enzim yang digunakan adalah Horseradish peroxydase (HRP), alkaline phosphatase (AP) dan beta galactosidase. Setiap enzim mempunyai fitur yang unik sesuai dengan kondisi dimana enzim tersebut dapat digunakan secara optimum. Menurut Burgess (1995) enzim HRP terlihat lebih sensitif pada immunoassay bila dibandingkan dengan enzim AP. Hal ini terjadi karena daya katalitik enzim HRP lebih cepat, maka lebih banyak produk yang digenerasi dalam waktu inkubasi yang lebih pendek. Sebagai tambahan, hidrogen peroksida, suatu ko-substrat pada suatu reaksi, yang dapat menghasilkan suatu inkubasi linier yang lebih cepat. Sensitivitas dapat ditingkatkan dengan membuat masa inkubasi lebih lama. Faktor lain yang mempengaruhi pemilihan konjugat adalah adanya aktifitas enzim endogen didalam sampel yang akan mempengaruhi pengujian dan background signal. Pada kit ELISA yang digunakan untuk analisis, sumur dalam microplate telah dilapisi dengan poliklonal antibodi bovine IgG dan antibodi tersebut berikatan secara menyeluruh dengan semua subklas dari bovine IgG. Bovine IgG kemudian bereaksi dengan detektor antibodi yang terkonjugasi oleh horseradish peroxydase (conjugated goat anti-bovine IgG peroxydase), dan substrat berisi Tetramethyl Benzidine (TMB).

13 21 Berbagai piranti dengan tingkat kecanggihan yang makin meningkat telah tersedia untuk pembacaan hasil dengan objektif. Perbedaan yang paling jelas dapat diperoleh dengan memilih panjang gelombang yang tepat. Meneliti profil absorbsi substrat yang digunakan merupakan hal yang penting, bila memungkinkan dipilih dua panjang gelombang karena hal ini akan variasi antar sumuran. Panjang gelombang primer harus bertepatan dengan absorbansi puncak sampel. Panjang gelombang sekunder bertepatan dengan dataran yang landai. Hal ini merupakan hal yang penting karena dapat menyebabkan pengamatan yang tidak peka dan tidak spesifik. Disamping itu akurasi dan efisiensi ELISA ditentukan oleh spesifisitas dan kemurnian IgG. Umumnya kisaran kerja sistem ELISA untuk mendeteksi imunoglobulin membutuhkan serum yang sangat encer (1/10000 s/d 1/ untuk serum) sebelum dimasukkan ke dalam sumuran yang dilapisi antibodi penangkap. Ini karena prozona lebar muncul ketika digunakan imunoglobulin dalam jumlah berlebihan pada pengujian (Burgess 1995). Pengenceran tinggi seperti yang sesuai dengan serum tersebut biasanya setara dengan ng/ml. Dengan demikian larutan baku harus sesuai dengan konsentrasi imunoglobulin, yaitu harus dapat mendeteksi batas maksimum dan minimum yang mampu dideteksi oleh ELISA reader.

14 22 Gambar 6. Reaksi pembentukan warna pada proses ELISA Idealnya harus dibuat kurva baku yang menggambarkan hubungan antara absorbansi dan konsentrasi imunoglobulin menggunakan satu seri pengenceran serum atau imunoglobulin yang dimurnikan. Jika digunakan serum sebagai standar, biasanya dilakukan prakalibrasi untuk konsentrasi imunoglobulin yang diselidiki dengan imunoglobulin murni yang diketahui jumlahnya.

15 23 Beberapa pengujian hanya menggunakan dua atau tiga pengenceran serum (atau imunoglobulin yang dimurnikan) untuk menggambarkan bagian linier kurva hubungan antara absorbansi dan konsentrasi imunoglobulin dalam suatu sampel. Namun kurva baku yang dibuat berdasarkan satu seri pengenceran memungkinkan penghitungan konsentrasi imunoglobulin dalam sampel yang berada diluar kisaran liniernya. Perhitungan dapat dilakukan dengan cara manual maupun dengan program komputer grafik yang menghubungkan absorbansi dengan konsentrasi imunoglobulin. Format ELISA yang sangat umum digunakan adalah Sandwich ELISA terutama untuk identifikasi protein. 2.4 VALIDASI METODE ANALISIS Metode analisis yang reliabel dan valid digunakan untuk kesesuaian dengan regulasi nasional dan internasional. Laboratorium harus dapat memperlihatkan bahwa data yang diperoleh dari hasil pengujian bermutu. Maka validasi metode merupakan hal yang sangat esensial untuk menghasilkan metode yang dapat dipercaya dan data yang diperoleh reliabel. Validasi adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang obyektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi (SNI 17025: 2008). Menurut Gunzler (1996), validasi metode adalah menetapkan dengan percobaan laboratorium yang sistimatik, pemenuhan karakteristik unjuk kerja metode terhadap spesifikasi yang dikaitkan dengan penggunaan hasil pengujian yang dimaksudkan. Validasi metode adalah suatu proses untuk mengonfirmasi bahwa suatu metode mempunyai unjuk kerja yang konsisten, sesuai dengan apa yang dikehendaki dalam penerapan metode tersebut (Eurachem 1998).

16 24 Jadi tujuan memvalidasi metode adalah untuk mengetahui sejauh mana penyimpangan suatu metode tidak dapat dihindari pada kondisi normal, dimana seluruh elemen terkait telah dilaksanakan dengan baik dan benar. Dengan memvalidasi metode, tingkat kepercayaan yang dihasilkan oleh suatu metode pengujian dapat diperkirakan dengan pasti ( Hadi 2007) Dengan kata lain validasi merupakan proses mendapatkan informasi penting untuk menilai kemampuan sekaligus keterbatasan suatu metode untuk memperoleh hasil yang dapat dipercaya, menentukan kondisi dimana hasil data uji diperoleh dan menentukan batas suatu metode seperti akurasi, presisi, batas deteksi dan kuantitasi, pengaruh matriks dan parameter lainnya. Validasi metode sangat penting karena menyangkut elemen-elemen yang dapat mempengaruhi seperti personil, peralatan/ instrumentasi, analat, kondisi lingkungan, sampel dan waktu yang semuanya merupakan faktor yang dapat menimbulkan variasi pada suatu pengujian. Menurut Boque (2002), suatu metode analisis dikatakan memuaskan bila memenuhi kriteria kinerja diantaranya: 1. Peka artinya metode harus dapat digunakan untuk menetapkan kadar senyawa dalam kadar yang kecil. 2. Tepat (presisi) artinya metode tersebut menghasilkan suatu hasil analisis yang sama atau hampir sama dalam satu seri pengukuran/ penetapan. 3. Teliti (akurat) artinya metode dapat menghasilkan nilai rata-rata yang sangat dekat dengan nilai sebenarnya (true value), 4. Spesifik, artinya untuk penetapan kadar senyawa tertentu, dan metode tersebut tidak banyak terpengaruh oleh adanya senyawa lain. 5. Praktis artinya metode tersebut mudah dikerjakan serta tidak banyak memerlukan waktu dan biaya.

17 25 Dengan melakukan validasi metode akan diketahui sejauh mana penyimpangan yang tidak dapat dihindari dari suatu metode pada kondisi normal dimana seluruh elemen terkait telah dilaksanakan dengan baik dan benar. Dengan demikian dapat diperhitungkan dengan pasti tingkat kepercayaan yang dihasilkan oleh suatu metode pengujian. Dalam melaksanakan validasi metode ada beberapa faktor-faktor yang harus diperhatikan adalah keseimbangan antara biaya, waktu, risiko dan aspek teknis misalnya ketepatan dan ketelitian yang diinginkan untuk analisis kuantitatif, ketersediaan reagen serta peralatan yang tersedia. Pada waktu dilakukan validasi metode ada beberapa hal yang harus diperhatikan antara lain perbedaan suhu, personil, instrumen, pereaksi yang dipakai dalam metode baku atau metode resmi dengan laboratorium yang akan menggunakannya. Sehingga tujuan validasi adalah untuk memastikan, bahwa laboratorium atau personel/analis dapat menerapkan metode tersebut dengan baik dengan adanya ketersediaan peralatan, fasilitas pereaksi, penguji,yang trampil, dan kompeten. Validasi metode harus dilakukan bila metode tidak baku, metode yang didesain/dikembangkan laboratorium, metode baku yang digunakan diluar lingkup yang dimaksudkan atau metode baku yang dimodifikasi. Validasi ada dua jenis yaitu validasi primer (primary validation) dan validasi sekunder (secondary validation). Validasi primer adalah validasi yang dilakukan untuk metode analisis baru, hasil pengembangan atau metode yang dimodifikasi terhadap suatu metode standar. Validasi sekunder adalah validasi yang dilakukan untuk verifikasi metode analisis yang diadopsi atau metode standar yang telah divalidasi. Parameter uji yang dilakukan untuk validasi metode kuantitatif dan metode kualitatif tercantum pada Tabel 2.

18 26 Tabel 2. Parameter yang diperlukan pada validasi metode analisis untuk uji kualitatif dan kuantitatif Parameter Uji Kualitatif Uji kuantitatif Akurasi Tidak perlu Perlu Presisi Tidak perlu Perlu Spesifisitas Perlu Perlu Limit deteksi Perlu Perlu Limit kuantitasi Tidak perlu Perlu Linearitas Tidak perlu Perlu Rentang Perlu Perlu Keberulangan Perlu Perlu Robustness Perlu Perlu Ruggedness perlu Perlu Beberapa parameter unjuk kerja yang harus diperhatikan ketika melakukan validasi metode yaitu (1) akurasi, (2) presisi, (3) sensitivitas, (4) spesifisitas, (5) limit deteksi (LOD), (6) limit kuantitasi (LOQ), (7) Ruggedness, (8) Robustness, dan (9) linearitas. Menurut USP (2011) tercantum validasi sekunder untuk metode kompendia dan validasi primer untuk metode alternatif. Presisi adalah tingkat kesamaan (degree of agreement) antar hasil uji individual ketika metode tersebut diterapkan secara berulang sampai dengan penggandaan sampling dari suatu sampel homogenat. Presisi dari suatu metode analisis biasanya ditunjukkan dengan simpangan baku relatif (relative standard deviation atau coefficient of variation) dari suatu seri pengukuran. Untuk menganalisis hasil validasi, data presisi dapat dievaluasi menggunakan persen standar deviasi relatif (RSD). Menurut USP (2011) presisi adalah derajat kesesuaian diantara hasil uji individu (berdiri sendiri) jika metode uji dilakukan berulang-ulang terhadap multi sampling dari suatu sampel yang homogen. Presisi biasanya dinyatakan sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi) dari serangkaian pengukuran. Suatu metode analisis dapat diadopsi dalam suatu laboratorium jika nilai RSD < 5%. Menurut Chan (2002) presisi suatu metode khususnya metode ELISA akan memenuhi

19 27 keberterimaan apabila RSD yang diperoleh 20%. Presisi dapat diukur dari tingkat ripitabilitas atau tingkat reprodusibilitas dari metode analisis yang dilakukan dalam kondisi normal. Ripitabilitas adalah mengukur variasi dalam hasil uji independen yang diperoleh dengan metode yang sama terhadap sampel uji yang identik dalam laboratorium yang sama oleh operator (analis) yang sama dengan menggunakan peralatan yang sama dalam interval waktu singkat. Ripitabilitas dapat juga dikatakan penggunaan metode pengujian di dalam satu laboratorium dalam satu periode waktu yang singkat menggunakan personel penguji yang sama, dengan peralatan yang sama di bawah kondisi konstan. Reprodusibilitas adalah mengukur variasi dalam hasil uji independen yang diperoleh dengan metode yang sama terhadap sampel uji yang identik dalam laboratorium yang berbeda dan peralatan berbeda, atau dengan analis dan peralatan berbeda di dalam laboratorium yang sama. Presisi intermediat dilakukan dengan berbagai variasi di dalam laboratorium, seperti pada hari yang berbeda atau personil penguji yang berbeda atau alat yang berbeda dalam laboratorium yang sama. Reprodusibilitas adalah penggunaan metode pengujian dalam berbagai laboratorium yang berbeda seperti dalam uji kolaborasi. Akurasi adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur suatu nilai yang aktual atau sebenarnya dari suatu analat. Apabila suatu analat secara alami digunakan sebagai uji tantang atau uji profisiensi, metode tersebut harus mampu mendeteksi atau memunculkan kembali (rekoveri) analat pada konsentrasi yang benar atau frekuensinya mendekati akurat. Akurasi adalah ukuran ketepatan dari suatu metode pengujian, atau kedekatan antara nilai hasil uji yang diukur dengan nilai benar, atau nilai nilai konvensional atau nilai acuan yang dapat diterima (USP 2011). Menurut Boque (2002) akurasi atau kecermatan adalah kedekatan hasil uji yang diperoleh dengan menggunakan metode yang sedang divalidasi dengan nilai sebenarnya yang terdapat dalam sampel uji. Akurasi

20 28 biasanya dinyatakan sebagai persen rekoveri. Pada analisis direkomendasikan minimal 9 replikasi atau 3 replikasi dengan 3 konsentrasi dengan kriteria kecermatan sangat tergantung kepada konsentrasi analat dalam matriks sampel dan pada keseksamaan metode (RSD). Suatu metode analisis dapat diadopsi jika hasil validasi memperoleh nilai rekoveri sesuai dengan keberterimaan. Akurasi dari suatu metode dapat dilakukan dengan cara menggunakan bahan acuan bersertifikat, membandingkan hasil yang benar-benar telah dikarakterisasi dan akurasinya telah ditetapkan atau dengan cara menghitung persen perolehan kembali/rekoveri terhadap sampel yang sudah di spike (Chan 2004). Kriteria kecermatan dalam persen perolehan kembali sangat tergantung kepada konsentrasi analat dalam matrikss sampel dan pada keseksamaan metode (RSD) (Codex 2009). Persen rekoveri rata-rata untuk tiap level konsentrasi dinilai terhadap rentang persen rekoveri tercantum pada Tabel 3. Penetapan batas terendah dari kisaran hitung (limit deteksi) adalah konsentrasi terendah dari analat dalam sampel yang dapat terdeteksi, akan tetapi tidak perlu terkuantisasi, dibawah kondisi pengujian yang disepakati. Sedang Limit kuantitasi biasa juga disebut sebagai batas pelaporan adalah konsentrasi terendah dari analat yang dapat ditentukan dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima, dibawah kondisi pengujian yang disepakati. Limit deteksi merupakan jumlah terkecil analat dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko. Limit deteksi merupakan parameter uji batas, dan limit kuantitasi diartikan sebagai kuantitas terkecil analat dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Penentuan limit deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak menggunakan instrumen limit tersebut ditentukan dengan mendeteksi analat dalam sampel pada pengenceran bertingkat.

21 29 Tabel 3. Keberterimaan akurasi berdasarkan persen rekoveri No % Analat Rasio Analat Satuan % (100g/100g) % (10g/100g) % (1g/100g) 4 0, ,1% Rentang keberterimaan (% Rekoveri) (1 mg/g) 5 0, ppm , ppm , ppm , ppb , ppb , ppb Pada analisis menggunakan instrumen, limit deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blanko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blanko. limit deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi. Limit deteksi mempunyai nilai ekuivalen dengan rata-rata respon blanko plus 3 kali simpangan baku (SD), dan limit kuantitasi adalah rata-rata blanko plus 10 kali SD (Eurachem 2002). Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang menunjukkan bahwa larutan sampel yang berada dalam rentang konsentrasi memiliki respon analat yang proposional dengan konsentrasi, secara langsung atau melalui transformasi matematika. Linieritas adalah kemampuan untuk menghasilkan hasil uji yang sebanding / berbanding lurus terhadap konsentrasi analat dalam sampel pada kisaran konsentrasi tertentu. Beberapa metode seperti immunoassay tidak menghasilkan suatu kurva yang linier, pada kasus ini respon analisis dapat digambarkan sebagai fungsi yang sesuai

22 30 dengan konsentrasi Rentang yaitu kemampuan untuk memperoleh hasil uji yang kadar analatnya masih linier dengan presisi dan akurasi yang masih dapat diterima analat dalam sampel (USFDA 1996). Ditetapkan bersamaan dengan penetapan linieritas dengan melakukan pengujian terhadap sampel yang kadarnya dibawah dan diatas normal. Rentang metode menjelaskan rentang konsentrasi dimana metode uji diaplikasikan yang dinyatakan dalam presisi, akurasi dan linieritas. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan. Selektivitas menunjukkan kemampuan suatu metode membedakan antara analat yang dituju dan komponen lain / bentuk-bentuk analat lain yang mungkin ada dalam matriks untuk mengukur secara akurat dan spesifik analat dalam matrikss sampel dengan adanya zat pengganggu. Spesifisitas adalah kemampuan metode untuk mendeteksi/mengukur analat secara cermat dan seksama dengan adanya analat asing/bahan/matriks lain. Spesifisitas dapat dihitung menggunakan jumlah sampel positif yang menunjukkan hasil pengujian positif dibagi dengan hasil pengujian positif terhadap kontrol positif dikalikan 100%. Hasil penghitungan menunjukkan nilai perolehan kembali (rekoveri) dari hasil validasi/verifikasi metode analisis. Pada analisis mikrobiologi, idealnya nilai rekoveri 80% tetapi metode analisis dianggap meyakinkan jika nilai rekoveri berkisar 50-95% (AOAC 1999). Menurut DeSilva (2003) idealnya pada metode ELISA, antibodi yang digunakan harus spesifik dengan analat target, tanpa adanya gangguan dari bahan yang strukturnya hampir sama dengan analat yang ada dalam sampel ataupun bahan yang terdapat dalam matriks. Sensitivitas adalah kemampuan metode untuk mendeteksi/mengukur analat target dalam jumlah sekecil mungkin.

23 31 Ruggedness atau kekasaran adalah suatu ukuran dari kapasitasnya, terhadap sisa yang tidak dipengaruhi oleh konsentrasi yang sedikit, namun variasi-variasi yang mungkin terjadi dalam parameter-parameter metode dan memberikan suatu indikasi dari reliablilitasnya selama penggunaan normal (Chan 2004). Robustness atau ketegaran adalah kemampuan untuk memberikan hasil uji yang sama pada sampel yang sama, tetapi keragaman kondisi pengujian berbeda. Bertujuan untuk mengetahui pengaruh faktor eksternal terhadap metode (sampel dan metode sama, tetapi laboratorium, alat, analis dan waktu pengujian berbeda). Evaluasi terhadap robustness harus dilakukan selama masa pengembangan metode analisis.