Lampiran 1. Prosedur uji zona hidrolisis kasein

Transkripsi

1 Lampiran 1. Prosedur uji zona hidrolisis kasein Media kultur agar yang mengandung kasein 2% disiapkan di dalam cawan petri. Wilayah agar dibagi menjadi 4 bagian (kuadran) yang sama, dan empat buah kertas cakram ditempatkan di bagian tengah setiap kuadran. Sebanyak 0.1 ml kultur cair isolat yang akan diuji dipipet dan diteteskan di satu kertas cakram, sehingga satu cawan petri dapat digunakan untuk 4 isolat yang berbeda. Biakan diinkubasi pada suhu 29 o C selama 24 sampai 48 jam. Jika terjadi proses hidrolisis protein, maka daerah bening akan terlihat di sekeliling koloni mikrob, sebaliknya bila tidak terjadi hidrolisis daerah sekitar koloni tetap berwarna keruh. Diameter wilayah yang dihidrolisis (daerah bening) diukur. lxvii

2 Lampiran 2. Prosedur analisis aktivitas enzim protease (Bergmeyer dan Graβ1, 1986). Pereaksi Blanko (µl) Standar (µl) Sampel (µl) 1. Buffer phosphat 0.05 M ph Substrat kasein 2% (b/v) ph Enzim protease Tirosin standar 5 mmol/l Aquadest Di-vortex, kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 10 menit. 6. TCA 0,1 M Aquadest Enzim protease Di-vortex, kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 10 menit lalu disentrifus 6000 g selama 10 menit dengan suhu 4 o C. Absorbansi diukur dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280 nm. Aktivitas enzim dihitung dengan rumus : U = (Abs Sample Abs blanko) x konsentrasi tirosin (mm) x 181 (Abs standar Abs blanko) x waktu inkubasi (menit) x vol. enzim (ml) Di mana : U = aktivitas enzim dalam µg/ (menit.ml) atau unit Abs = absorbansi T = waktu inkubasi (menit) lxviii

3 Lampiran 3. Prosedur analisis proksimat (kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, dan kadar serat kasar) mengikuti metode Takeuchi (1988). a. Prosedur analisis kadar air - Cawan dipanaskan pada suhu 110 o C selama 1 jam, kemudian didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang (A). - Sampel ditimbang sebanyak 1 gram dan dimasukkan ke dalam cawan, kemudian ditimbang (B). - Cawan dan sampel dipanaskan tanpa penutup pada suhu 110 o C selama 2 jam, kemudian didinginkan dalam desikator sampai suhu ruang dan timbang. Proses tersebut diulang sampai beratnya konstan (C). - Kadar air (%) = (B-C) x 100 (B-A) b. Prosedur analisis kadar abu - Cawan porselin dipanaskan pada suhu 600 o C selama 1 jam di dalam muffle furnase, kemudian dibiarkan suhu muffle furnase turun sampai 110 o C, selanjutnya cawan porselin dikeluarkan dan didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang (A). - Sampel ditimbang sebanyak 1 sampai 2 gram dan dimasukkan ke dalam cawan, kemudian ditimbang (B). - Cawan porselin dan sample dipanaskan di dalam muffle furnase pada suhu 600 o C selama 1 jam, kemudian dibiarkan sampai samalam. - Cawan porselin + sample dikeluarkan dan didinginkan dalam desikator selama 30 menit, kemudian ditimbang (C). - Kadar abu (%) = C x 100 (B-A) c. Prosedur analisis protein c.1. Tahap Oksidasi - Sampel ditimbang sebanyak 0,5 gram dan dimasukkan ke dalam labu Kjehldahl, salah satu dari labu digunakan sebagai blanko dan tidak diisi dengan sample. - Tiga gram katalis (K 2 SO 4 + Cu SO 4.H 2 O dengan rasio 9:1) dan 10 ml H 2 SO 4 pekat ditambahkan. - Labu Kjeldahl dipanaskan pada suhu 400 o C selama 0,5 sampai satu jam, kemudian pemanasan dilanjutkan lagi selama 3 sampai 4 jam sehingga terjadi perubahan warna menjadi hijau bening. - Larutan ditambah dengan 20 ml air destilata dan didinginkan. - Setelah dingin diencerkan dengan air destilata sampai 100 ml. lxix

4 c.2.tahap Destilasi - Beberapa tetes H 2 SO 4 ditambahkan ke dalam botol A yang sebelumnya telah diisi setengah bagian dengan air destilata untuk menghindari amoniak lingkungan, kemudian dididihkan selama 10 menit. - Botol erlenmeyer (F) yang berisi 10 ml H 2 SO 4 0,05 N ditetesi 2 sampai 3 tetes indikator (methyl red / methyl blue), disiapkan untuk menampung NH 3 yang dibebaskan. - 5 ml larutan sampel dimasukkan ke botol D melalui corong C, kemudian corong C dicuci dengan air destilata ml larutan NaOH 30% ditambahkan melalui corong C dan corong C dicuci kembali dengan air destilata, kemudian antara corong C dan botol D ditutup dengan cara dijepit. - Campuran alkalin dalam botol destilasi dipanaskan dengan uap selama minimum 10 menit estela kondensasi terlihat pada kondensor. - Larutan dalam erlenmeyer dititrasi dengan larutan NaOH 0,05 N dan catat hasilnya. - Prosedur titrasi yang sama juga dilakukan pada blanko. - Kadar protein (%) = 0,0007 *1 x (Vb Vs) x F x 6,25 *2 x 20 x 100 S Di mana : Vs = volume NaOH 0,05 N untuk sampel F = faktor koreksi untuk larutan standar NaOH 0,05 N S = berat sampel (g) *1 = setiap ml NaOH 0,05 N equivalent dengan 0,0007 g nitrogen *2 = faktor nitrogen, protein diasumsikan pada 16% nitrogen, faktor 6,25 (100/16) digunakan untuk mengkonversi total nitrogen ke total protein. d. Prosedur Analisis Lemak - Labu ekstraksi dipanaskan pada suhu 110 o C selama 1 jam, setelah itu didinginkan selama 30 menit dalam desikator. Labu dipanaskan kembali selama 30 menit dan dinginkan, kemudian ditimbang. Proses tersebut diulang sampai tidak ada perbedaan bobot labu (lebih kecil dari dari 0,3 mg). Bobot labu ekstraksi (A). - Sampel ditimbang sebanyak 1 sampai 2 gram dan dimasukkan ke dalam tabung filter kemudian ditutup dengan lapisan tipis dari katon absorbent dan dikeringkan dalam oven pada suhu 90 sampai 100 o C selama 2 sampai 3 jam. - Tabung filter ditempatkan di dalam ruang ekstraksi dari alat soxhlet dan dihubungkan dengan kondensor labu ekstraksi yang telah diisi dengan 100 ml petrolium ether, sebelumnya ether dipanaskan terlebih dahulu pada labu ekstraksi dalam water bath pada suhu 60 sampai 70 o C selama 16 jam. - Labu ekstraksi dipanaskan pada suhu 100 o C, kemudian ditimbang (B) - Kadar lemak (%) = (B-A) x 100 Berat sampel lxx

5 e. Prosedur analisis serat kasar - Kertas filter dipanaskan dalam oven pada suhu 110 o C, kemudian didinginkan dalam desikator selama 15 menit. Dipanaskan kembali selama 30 menit dan dinginkan, kemudian ditimbang. Proses tersebut diulang sampai tidak ada perbedaan bobot (lebih kecil dari 0,3 mg). - Cawan porselin dipanaskan pada suhu 550 o C selama 1 jam di dalam muffle furnase, kemudian dibiarkan suhu muffle furnase turun sampai 110 o C, selanjutnya cawan porselin dikeluarkan dan didinginkan dalam desikator selama 30 menit. - Sampel sebanyak 1 sampai 2 gram ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer, (kalau kandungan lemak sampel > 1% dilakukan ekstraksi dengan larutan ether untuk memindahkan lemak), tambahkan 200 ml H 2 SO 4 1,25% panas dan 1 ml iso-amyl alkohol sebagai agen antifoam. - Labu dihubungkan dengan kondensor dan dididihkan selama 30 menit, labu diputar secara periodik agar bahan tidak mengendap. - Labu dipindah dan cairan disaring melalui filter fiber nilon dalam sebuah corong, kemudian dicuci sebanyak 3 kali berturut-turut dengan 40 sampai 50 ml air panas. - Residu yang terdapat dalam filter dipindahkan ke dalam labu original yang berisi sedikit air panas dan ditambahkan dengan 50 ml NaOH 5% panas dan 1 ml iso-amyl alkohol, kemudian diencerkan dengan 200 ml air panas. - Selanjutnya labu dididihkan dan cairan disaring kembali dengan filter fiber nilon, kemudian dicuci sebanyak 5 kali berturut-turut dengan 40 sampai 50 ml air panas. - Residu yang terdapat pada filter dipindahkan dalam kertas filter dan dicuci dengan air, tambahkan 15 ml alkohol dan 10 ml ether. Selanjutnya dikeringkan pada suhu 110 o C sampai tercapai bobot konstan. - Kertas saring dimasukkan ke dalam cawan porselin dipanaskan dalam muffle furnace pada suhu 550 o C selama 1 jam atau sampai beratnya konstan, kemudian didinginkan. - Kadar serat kasar (%) = Berat yang hilang selama pembakaran x 100 Berat sampel lxxi

6 Lampiran 4. Komposisi pakan buatan untuk ikan nila Komposisi Bahan Prosentase (% bobot kering) Komposisi Proksimat Pakan Formulasi (%) Nutrien Basah Kering Tepung ikan Kadar Protein TBK Kadar Lemak Tp darah 6.13 Kadar Serat Kasar Dedak Kadar Abu Polard Kadar BETN Minyak ikan 2.12 Kadar Air Minyak jagung 2.12 C/P (kkal/g protein) 9.14 Premix 2.97 DE (kkal/kg) CMC 1.48 Total Keterangan : total energi tercerna (DE) dihitung berdasarkan : protein 3.5 kkal; lemak 8.1 kkal, BETN 2.5 kkal (NRC 1977). Lampiran 5. Hasil analisis proksimat pakan percobaan (% bobot basah) Perlakuan Protein Lemak Abu Serat Kasar BETN Air A B C D E F G (% bobot kering) Perlakuan Protein Lemak Abu Serat Kasar BETN Air A B C D E F G lxxii

7 Lampiran 6. Prosedur pengukuran derajat hidrolisis pakan Pakan sebanyak gram dihidrolisis dengan enzim A1 atau L1 dengan dosis sesuai perlakuan. Pakan sebanyak 0.5 gram yang telah terhidrolisis oleh enzim protease ditambah 3 ml Tris HCl ph 6.5 dan disentrifus dengan kecepatan rpm selama 20 menit. Supernatan diambil, dan endapan yang dihasilkan digunakan untuk analisis kadar protein total dengan metode Kjehldahl mengikuti metode Takeuchi (1988). Pengukuran kadar protein total juga dilakukan pada sampel yang tidak dihidrolisis. DHP = P0 Pt x 100% P0 Di mana : DHP = derajat hidrolisis protein P 0 = kadar protein pakan pada waktu awal P t = kadar protein pakan yang tidak dihidrolisis lxxiii

8 Lampiran 7. Prosedur analisis kadar kromium pakan dan feses (Takeuchi 1988) Analisis kadar cromium oksida (Cr 2 O 3 ) Feses ditimbang sebanyak gram (sampel kering) dimasukkan ke dalam labu Kjehldahl. 5 ml asam nitrat 65 % ditambahkan pada sampel. Larutan campuran kemudian dipanaskan pada suhu sekitar 300 o C sampai volume larutan menjadi ± 1 ml, kemudian larutan campuran didinginkan. 3 ml asam perklorat 72% ditambahkan, kemudian larutan dipanaskan kembali hingga terjadi perubahan warna dari hijau menjadi kuning atau jingga. Larutan dipanaskan kembali selama 10 menit dan didinginkan. Larutan dipindahkan dalam wadah 100 ml, akuades ditambahkan hingga 100 ml dan dibaca serapannya pada panjang gelombang 350 nm. Berat Cr 2 O 3 dalam sampel dihitung berdasarkan persamaan: Y = X Dimana : Y = absorbansi X = mg Cr 2 O 3 dalam 100 ml larutan (= dalam sampel yang ditimbang) lxxiv

9 Lampiran 8. Luas zona hidrolisis kasein sepuluh isolat bakteri No Isolat Diameter hidrolisis (mm) 1 A L L L L L L6 8 8 A2 8 9 A L5 5 Lampiran 9. Hasil uji patogenisitas isolat bakteri proteolitik Isolat JNA JNM SR Keterangan uji (ekor) (ekor) (%) A Sehat hingga akhir masa pemantauan L Sehat dan gesit hingga akhir masa pemantauan L Ikan yang masih hidup kurang gesit di akhir masa pengamatan. L Ikan yang masih hidup kurang gesit di akhir masa pengamatan Kontrol Sehat JNA : jumlah nila awal, JNM : jumlah nila mati, SR: survival rate lxxv

10 Lampiran 10. Kerapatan optis isolat bakteri proteolitik A1 dan L1 dalam 4 hari pengamatan No Jam Kerapatan Optis Urut Kultur ke- A1 L lxxvi

11 Lampiran 11. Aktivitas enzim protease (µg/menit.ml) isolat A1 dan L1 dalam 4 hari pengamatan. Absorbansi (λ = 280 nm) Aktivitas enzim (µg/menit ml) No Pengamatan Urut jam ke- Enzim A1 Enzim A1 Enzim A1 Enzim L Absorbansi tirosin standar 5 mm = 0,365 Lampiran 12. Derajat hidrolisis protein pakan oleh enzim A1 dan L1 Dosis Derajat Hidrolisis Protein (%) (ml/kg Enzim A1 Enzim L1 pakan) Ulangan Ulangan 1 2 Rataan SD 1 2 Rataan SD lxxvii

12 Lampiran 13. Perhitungan kecernaan total dan protein Parameter U Perlakuan A B C D E F G Kadar kromium pakan (% bobot kering) Rata-rata Standar Deviasi Kadar kromium feses (% bobot kering) Rata-rata Standar Deviasi Kecernaan total (%) Rata-rata Standar Deviasi Kadar protein pakan (% bobot kering) Rata-rata Standar Deviasi Kadar protein feses (% bobot kering) Rata-rata Standar Deviasi Kecernaan protein (%) Rata-rata Standar Deviasi lxxviii

13 Lampiran 14. Perhitungan jumlah konsumsi pakan, efisiensi pakan, laju pertumbuhan spesifik (LPS) dan kelangsungan hidup ikan nila Parameter U Perlakuan A B C D E F G Bobot Ikan Awal (g) Rata-rata Standar Deviasi Bobot ikan akhir (g) Rata-rata Standar Deviasi Jumlah Ikan Akhir (jumlah awal 10 ekor Per akuarium) Bobot ikan mati (g) Konsumsi Pakan (g) Rata-rata Standar Deviasi Efisiensi Pakan (%) Rata-rata Standar Deviasi LPS (%) Rata-rata Standar Deviasi Kelangsungan Hidup (%) Rata-rata Standar Deviasi lxxix

14 Lampiran 15. Perhitungan retensi protein Parameter Perlakuan U A B C D E F G Bobot Ikan Awal (g) Kadar protein ikan awal (% bobot basah) Protein tubuh ikan awal (g) Bobot ikan akhir (g) Kadar protein ikan akhir (% bobot basah) Protein tubuh ikan hidup akhir (g) Bobot ikan mati (g) Protein tubuh ikan mati (g) Deposit protein tubuh (g) Konsumsi pakan (g) Kadar protein pakan (% bobot basah) Protein dikonsumsi (g) Retensi Protein (%) Rata-rata Standar Deviasi lxxx

15 Lampiran 16. Analisis ragam dan uji Duncan laju pertumbuhan spesifik ikan nila selama pemeliharaan. Analisis Ragam SK db JK KT F hitung F tabel 5% (6, 14) Perlakuan Galat Total Uji Duncan Perlakuan Rata2 Selisih Antara Rata-rata Perlakuan 2p 3p 4p 5p 6p 7p D (c) 3.01 F (c) E (c) B (bc) C (abc) G (ab) A (a) r (0,05; p; 14) Rp = r (KTG/r) Lampiran 17. Analisis ragam dan uji Duncan jumlah konsumsi pakan ikan nila selama pemeliharaan Analisis Ragam SK db JK KT F hitung F tabel 5% (6, 14) Perlakuan Galat Total Uji Duncan Perlakuan Rata2 Selisih Antara Rata-rata Perlakuan 2p 3p 4p 5p 6p 7p F (c) D (c) E (bc) B (abc) C (abc) G (ab) A (a) r (0,05; p; 14) Rp = r (KTG/r) lxxxi

16 Lampiran 18. Analisis ragam dan uji Duncan kecernaan total pakan ikan nila selama pemeliharaan Analisis Ragam SK db JK KT F hitung F tabel 5% (6, 14) Perlakuan Galat Total Uji Duncan Perlakuan Rata2 Selisih Antara Rata-rata Perlakuan 2p 3p 4p 5p 6p 7p F (f) C (e) B (d) D (c) E (c) G (b) A (a) r (0,05; p; 14) Rp = r (KTG/r) Lampiran 19. Analisis ragam dan uji Duncan kecernaan protein pakan ikan nila selama pemeliharaan Analisis Ragam SK db JK KT F F tabel 5% (6, 14) hitung Perlakuan Galat Total Uji Duncan Perlakuan Rata2 Selisih Antara Rata-rata Perlakuan 2p 3p 4p 5p 6p 7p F (f) C (e) B (d) D (c) E (b) G (a) A (a) r (0,05; p; 14) Rp = r (KTG/r) lxxxii

17 Lampiran 20. Analisis ragam dan uji Duncan efisiensi pakan ikan nila selama pemeliharaan Analisis Ragam SK db JK KT F hitung F tabel 5% (6, 14) Perlakuan Galat Total Uji Duncan Perlakuan Rata2 Selisih Antara Rata-rata Perlakuan 2p 3p 4p 5p 6p 7p D (c) E (bc) B (bc) F (abc) C (ab) G (a) A (a) r (0,05; p; 14) Rp = r (KTG/r) Lampiran 21. Analisis ragam dan uji Duncan retensi pakan ikan nila selama pemeliharaan Analisis Ragam SK db JK KT F hitung F tabel 5% (6, 14) Perlakuan Galat Total Uji Duncan Perlakuan Rata2 Selisih Antara Rata-rata Perlakuan 2p 3p 4p 5p 6p 7p B (c) C (bc) G (ab) D (a) A (a) E (a) F (a) r (0,05; p; 14) Rp = r (KTG/r) lxxxiii

18 Lampiran 22. Analisis ragam dan uji Duncan tingkat kelangsungan hidup ikan nila selama pemeliharaan Analisis Ragam SK db JK KT F hitung F tabel 5% (6, 14) Perlakuan Galat Total Lampiran 23. Kualitas air media pemeliharaan ikan nila selama penelitian No Parameter Kisaran 1 ph 7 2 DO Alkalinitas Kesadahan NH NO2 lxxxiv