IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN APO VERY LOW DENSITY LIPOPROTEIN-II (ApoVLDL-II SfcI) PADA AYAM LOKAL DENGAN METODE PCR-RFLP ADY MULYANA

Transkripsi

1 IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN APO VERY LOW DENSITY LIPOPROTEIN-II (ApoVLDL-II SfcI) PADA AYAM LOKAL DENGAN METODE PCR-RFLP ADY MULYANA DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

2

3 PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Keragaman Gen Apo Very Low Density Lipoprotein-II (ApoVLDL-II SfcI) pada Ayam Lokal dengan Metode PCR-RFLP adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, September 2016 Ady Mulyana NIM D

4 ABSTRAK ADY MULYANA. Identifikasi Keragaman Gen Apo Very Low Density Lipoprotein-II (ApoVLDL-II SfcI) pada Ayam Lokal dengan Metode PCR-RFLP. Dibimbing oleh RINI HERLINA MULYONO dan CECE SUMANTRI. Gen Apo Very Low Density Lipoprotein-II (ApoVLDL-II) adalah gen yang berperan penting dalam transpor lipid. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen ApoVLDL-II pada Ayam Lokal Indonesia dengan menggunakan metode PCR-RFLP dan enzim retriksi SfcI. Sampel yang digunakan sebanyak 199 ekor ayam lokal Indonesia yang terdiri atas 70 ekor ayam kampung ciawi, 56 ekor ayam kampung sukabumi, 25 ekor ayam merawang, 25 ekor ayam sentul, dan 23 ekor ayam pelung. Panjang produk hasil PCR gen ApoVLDL-II adalah 489 pb. Hasil genotyping terdapat 3 genotipe yaitu AA (489 pb), AG (489 pb, 396 dan 93 pb) dan GG (396 pb dan 93 pb). Frekuensi genotipe tertinggi adalah GG. Frekuensi alel G pada semua populasi lebih tinggi daripada frekuensi alel A. Populasi semua ayam lokal berada pada keseimbangan Hardy- Weinberg (X 2 hitung < X 2 tabel) kecuali ayam kampung ciawi. Nilai heterozigositas harapan (He) ayam kampung ciawi dan sukabumi lebih besar dari nilai heterozigositas pengamatan (Ho), sedangkan ayam merawang, sentul dan pelung sebaliknya. Gen ApoVLDL-II pada ayam lokal Indonesia ditemukan beragam. Kata kunci : ApoVLDL-II, ayam lokal, keragaman, PCR-RFLP ABSTRACT ADY MULYANA. Identification of Apo Very Low Density Lipoprotein-II (ApoVLDL-II SfcI) Gene Polymorphism in Local Chicken With PCR-RFLP Method. Supervised by RINI HERLINA MULYONO and CECE SUMANTRI. Apo Very Low Density Lipoprotein-II (ApoVLDL-II) has an important roles in lipid transportation. This aim of this study was to identify of ApoVLDL-II gene on the Indonesian Local Chicken using PCR-RFLP methods and restriction enzyme SfcI. Total of 199 samples local chickens consisting of 70 kampung chicken from ciawi, 56 kampung chicken from sukabumi, merawang chicken 25, sentul chicken 25, and pelung chicken 23 were used. The long of PCR products ApoVLDL-II gene was 489 bp. While the results of genotyping was found 3 genotypes AA (489 bp), AG (489 bp, 396 bp and 93 bp) and GG (396 bp and 93 bp). Genotype GG frequency was higher. The frequency of G allele in all populations was higher than the frequency of allele A. The population of all local chicken were in Hardy-Weinberg equilibrium (X 2 count < X 2 table) except kampung chicken from ciawi. Value expectation of heterozygosity (He) ciawi and sukabumi chicken greater than the value observation of heterozygosity (Ho), whereas in chicken merawang, sentul and pelung vice versa. ApoVLDL-II Gene in local chicken Indonesia detected polymorphism. Key words: ApoVLDL-II, local chicken, PCR-RFLP, polymorphism

5 IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN APO VERY LOW DENSITY LIPOPROTEIN-II (ApoVLDL-II SfcI) PADA AYAM LOKAL DENGAN METODE PCR-RFLP ADY MULYANA Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

6

7

8

9 PRAKATA Penulis panjatkan puji dan syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-nya. Salawat serta salam semoga senantiasa tercurah kepada Baginda Rasulullah SAW, keluarga, para sahabat, serta pengikutnya sampai akhir zaman. Alhamdulillah penulis telah menyelesaikan skripsi dengan judul Identifikasi Keragaman Gen apo very low density lipoprotein-ii (ApoVLDL-II SfcI) pada Ayam Lokal dengan Metode PCR-RFLP sebagai syarat memperoleh gelar sarjana peternakan di Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ir Rini Herlina Mulyono, MSi sebagai komisi pembimbing skripsi utama dan Prof Dr Ir Cece Sumantri, MSc sebagai komisi pembimbing skripsi anggota serta sebagai pembimbing akademik. Terima kasih atas segala ilmu, waktu, motivasi, dan semangat yang diberikan selama ini. Penulis juga ucapkan terima kasih kepada Mochammad Sriduresta Soenarno, SPt, MSi sebagai dosen pembahas seminar proposal, Dr Ir Widya Hermana, MSi dan Windi Al Zahra SPt, MSi sebagai dosen penguji sidang skripsi. Terima kasih atas segala nasihat, motivasi dan koreksi yang diberikan. Ungkapan terima kasih penulis juga sampaikan kepada Ayahanda (Satim) dan Ibunda (Mustanginah) serta adik (Luzaen Ativiani) atas segala doa, kasih sayang, serta dukungan moral dan materil sampai saat ini. Terima kasih kepada keluarga besar Laboratorium Genetika dan Molekuler Ternak khususnya ka Shelvi, Furqon, Isyana, dan Shaleh atas bimbingan dan bantuanya selama penulis melaksanakan penelitian, serta rekan-rekan seperjuangan (Herdian, Ade, Candra, Hafidh, Desi, Tari, Ana, Nurma, Ajin, Mela, dan Audrian) yang telah membantu dalam penelitian dan penyelesaian skripsi. Penulis menyadari dalam dalam penulisan karya ilmiah ini masih banyak kekurangan. Akhir kata semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, September 2016 Ady Mulyana

10

11 DAFTAR ISI DAFTAR ISI viii DAFTAR TABEL ix DAFTAR GAMBAR ix PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Tujuan Penelitian 2 Ruang Lingkup Penelitian 2 METODE 2 Lokasi dan Waktu 2 Bahan 2 Alat 3 Prosedur 3 Analisis Data 5 HASIL DAN PEMBAHASAN 6 Amplifikasi Gen ApoVLDL-II SfcI 6 Keragaman Gen ApoVLDL-II SfcI 7 Frekuensi Genotipe dan Alel Gen ApoVLDL-II SfcI 8 Keseimbangan Hardy-Weinberg pada Gen ApoVLDL-II SfcI 9 Pendugaan Nilai Heterozigositas Gen ApoVLDL-II SfcI 9 SIMPULAN DAN SARAN 10 DAFTAR PUSTAKA 11 LAMPIRAN 12 RIWAYAT HIDUP 14

12 DAFTAR TABEL 1 Primer gen ApoVLDL-II 2 2 Genotipe dan panjang produk hasil PCR-RFLP 5 3 Nilai frekuensi genotipe dan frekuensi alel gen ApoVLDL-II SfcI pada populasi ayam lokal. 8 4 Keseimbangan Hardy-Weinberg gen ApoVLDL-II SfcI berdasarkan uji X Pendugaan nilai heterozigositas gen ApoVLDL-II SfcI. 10 DAFTAR GAMBAR 1 Posisi penempelan primer (garis bawah) dan titik potong (tebal) gen ApoVLDL-II SfcI (Ensemble nomor akses: ENSGALG ). 4 2 Rekonstruksi gen ApoVLDL-II dan titik potong enzim SfcI pada intron 1 basa ke Hasil amplifikasi gen ApoVLDL-II SfcI pada gel agarosa 1.5% 7 4 Hasil RFLP gen ApoVLDL-II SfcI pada gel agarosa 2%. 8 DAFTAR LAMPIRAN 1 Sekuen gen ApoVLDL-II (Ensembl Nomor akses: ENSGALG ). ( Alat-alat yang digunakan dalam penelitian 13

13 PENDAHULUAN Latar Belakang Ayam lokal mempunyai peranan besar dalam penyediaan pangan terutama protein hewani asal unggas. Ayam lokal secara umum banyak dipelihara masyarakat pedesaan karena beberapa keunggulan seperti daya tahan terhadap penyakit dan adaptasi lingkungan yang baik di berbagai wilayah Indonesia. Ayam lokal mempunyai beberapa kekurangan seperti pertumbuhan yang lambat dan nilai konversi pakan yang tinggi. Penyebaran ayam lokal merata di seluruh pelosok Indonesia dan telah menyatu dengan kehidupan masyarakat setempat. Ayam lokal dapat digolongkan dalam beberapa tipe menurut fungsinya yaitu tipe pedaging, petelur, dwiguna, tipe petarung dan hias (Nataamijaya 2010). Contoh ayam lokal yang sering dipelihara masyarakat adalah ayam pelung, sentul, merawang dan kampung. Peningkatan jumlah penduduk setiap tahun berkorelasi positif dengan peningkatan permintaan produk ayam lokal seperti daging dan telur. Kendala yang dihadapi peternak maupun pemerintah adalah produktivitas ternak ayam lokal yang masih rendah. Hal ini disebabkan sifat genetik ayam lokal yang masih beragam dan belum mengalami pemuliaan yang terarah serta manajemen lingkungan yang masih minim terutama peternakan ektensif oleh masyarakat pedesaan. Upaya yang dapat dilakukan untuk meningkatkan produktivitas ayam lokal yaitu melalui seleksi. Menurut Noor (2008) seleksi merupakan tindakan membiarkan ternak tertentu bereproduksi, sedangkan ternak lainya tidak diberi kesempatan bereproduksi. Ayam lokal masih memiliki variasi genetik yang sangat beragam, sehingga seleksi diperlukan untuk sifat produksi tertentu. Kemajuan teknologi di bidang genetika molekuler sampai saat ini mampu melakukan seleksi sifat pada tingkat gen. Salah satu kandidat gen yang digunakan dalam seleksi sifat pertumbuhan dan komposisi tubuh unggas adalah gen ApoVLDL-II (Seyedabadi et al. 2010). Gen ApoVLDL-II berperan dalam transpor lipid pada tubuh unggas. Li et al. (2005) menemukan mutasi pada basa 634 dari G menjadi A (GenBank nomor akses: V00448) pada ruas intron 1 gen ApoVLDL-II. Penelitian Seyedabadi et al. (2010) menjelaskan bahwa SNP (single nucleotide polymorphism) pada ruas intron 1 gen ApoVLDL-II berpengaruh signifikan terhadap bobot hidup, karkas, otot dada dan paha ayam. Musa et al. (2008) menyatakan bahwa hasil SNP gen ApoVLDL-II berpengaruh signifikan terhadap konsentrasi trigliserida dan VLDL (very low density lipoprotein). Langkah awal dalam seleksi molekuler untuk mendapatkan sifat produksi yang sesuai dengan keinginan adalah dengan menentukan keragaman suatu gen pada ternak. Salah satu teknik yang biasa digunakan untuk mengidentifikasi keragaman genetik adalah metode PCR-RFLP (Polymorphism Chain Reaction- Restriction Fragment Length Polymorphism).

14 2 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi keragaman gen apo very low density lipoprotein-ii (ApoVLDL-II SfcI) pada ayam lokal dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). Ruang Lingkup Penelitian Identifikasi keragaman gen apo very low density lipoprotein-ii (ApoVLDL- II) pada ruas intron 1. Identifikasi dilakukan dengan metode PCR-RFLP dan menggunakan enzim restriksi SfcI. METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian Pemuliaan dan Genetika, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian berlangsung dari bulan April 2016 Juni Bahan Sampel darah yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari 199 ekor ayam yang terdiri atas ayam kampung dari Ciawi sebanyak 70 ekor, ayam kampung dari Sukabumi sebanyak 56 ekor, ayam pelung sebanyak 23 ekor, ayam merawang sebanyak 25 ekor, dan ayam sentul sebanyak 25 ekor. Bahan-bahan yang digunakan dalam pengambilan sampel darah yaitu alkohol 70%, serbuk EDTA, dan kapas. Pada tahap ekstraksi DNA, bahan-bahan yang digunakan antara lain DW (destilation water), EtOH absolute 70%, NaCl 0.2%, SDS (sodium dodecylsulphate) 10%, proteinase-k (5 mg/ml), 1xSTE (sodium tris-edta), phenol solution, NaCl 5M, CIAA (chloroform isoamylalcohol) dan TE (tris Elution) 80%. Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen ApoVLDL-II disajikan pada Tabel 1. Gen ApoVLDL-II Posisi Target Intron 1 Tabel 1 Primer gen ApoVLDL-II Sekuens Primer F: 5 - CTC TAT GAC ATG GTT GCC TG 3 R: 5 - GTT TGA CCC TGC TAT GAG TG 3 Keterangan: F= Forward, R= reverse (Seyedabadi et al. 2010) Panjang sekuen 489 pb

15 3 Bahan-bahan yang digunakan pada teknik PCR yaitu sampel DNA, DW (destilation water), dntps, MgCl 2, taq polymerase, buffer, dan pasangan primer (forward dan reverse). Primer yang digunakan pada gen ApoVLDL-II menurut Seyedabadi et al. (2010) yaitu (F: 5 - CTCTATGACATGGTTGCCTG -3 ; R: 5 - GTTTGACCCTGCTATGAGTG -3 ). Bahan-bahan yang digunakan pada teknik RFLP adalah produk PCR (amplikon), enzim restriksi SfcI dengan situs potong C TRYAG (R=A/G, Y=C/T), buffer, dan DW. Bahan-bahan yang digunakan dalam elektroforesis terdiri dari atas produk PCR (amplikon), agarose gel 1.5 dan 2%, 0.5 TBE (tris borat-edta), etidium bromida (EtBr) 10%, dan marker 100 pb. Alat Alat-alat yang digunakan pada saat pengambilan sampel darah ayam yaitu, spoit, pipa kapiler haematokrit, tabung eppendorf 1.5 ml, spidol, dan cool box. Pada tahap ekstraksi DNA alat yang digunakan antara lain microsentrifuge berpendingin, tabung eppendorf 1.5 ml, rak tabung eppendorf, pipet, tip, vortex, tilter (rotator), inkubator dan freezer. Alat-alat yang digunakan pada analisis PCR-RFLP terdiri atas mesin PCR thermocycler, tabung eppendorf beserta rak tabung, satu unit mikropipet beserta tip, vortex, microsentrifuge (spin down), inkubator, refrigerator, stirer, microwave, tray pencetak, UV transilluminator, dan komputer untuk menyimpan hasil. Prosedur Pengambilan Sampel Darah Sampel darah yang digunakan dalam penelitian telah disediakan laboratorium. Prosedur pengambilan sampel darah adalah sebagai berikut: sampel darah diambil dengan menggunakan spoit atau pipa kapiler haematokrit pada vena axillaris bagian sayap ayam yang diolesi alkohol terlebih dahulu. Darah diambil sebanyak 1 ml kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 ml yang telah diisi serbuk EDTA untuk membantu proses pelisisan. Sampel darah disimpan dalam refrigerator (suhu sekitar 4 o C) untuk menjaga kualitas sampel. Ekstraksi DNA DNA ektraksi yang digunakan dalam penelitian telah disediakan oleh laboratorium. Prosedur ekstraksi DNA menggunakan metode phenol-chloroform (Sambrook et al. 1989) yang dimodifikasi adalah sebagai berikut: darah ayam sebanyak 50 μl dimasukan ke dalam tabung eppendorf 1.5 ml, lalu ditambahkan μl NaCl 0.2%, kemudian dikocok dengan vortex selama 5 menit. Sampel selanjutnya disentrifius pada kecepatan rpm selama 5 menit kemudian bagian supernatan dibuang. Endapan ditambahkan 40 μl SDS 10%, 10 μl proteinase-k (5 mg/ml) dan 1 STE sampai 350 μl. Selanjutnya campuran diinkubasi pada suhu 55 C selama 2 jam sambil digoyang secara perlahan dengan menggunakan tilter (rotator

16 4 Degradasi bahan organik dilakukan dengan menambahkan 400 μl phenol solution, 400 μl CIAA dan 40 μl NaCl 5M, kemudian campuran digoyang selama 1 jam pada suhu ruang. Presipitasi DNA dilakukan dengan memisahkan molekul DNA dari fenol yang disentrifius pada kecepatan rpm selama 5 menit sehingga terbentuk fase DNA (bening) dan fase fenol. Fase DNA (bening) dipindahkan ke tabung baru sebanyak 400 μl untuk ditambahkan 800 μl EtOH abssolute 70% dan 40 μl NaCl 5M, kemudian campuran tersebut disimpan pada suhu -20 o C sampai semalaman (freezing over night). Molekul DNA dipusing dengan menggunakan sentrifius pada kecepatan rpm selama 5 menit untuk memisahkan EtOH absolute dan mengendapkan DNA. Supernatan yang didapat dibuang untuk selanjutnya endapan didiamkan sampai kering (3 jam). Endapan yang telah kering dipulihkan kembali dengan cara menambahkan 100 μl TE 80%. Sampel DNA disimpan dalam freezer suhu -20 o C dan siap digunakan. Amplifikasi DNA DNA diamplifikasi dengan teknik PCR. Sampel DNA hasil ekstraksi sebanyak μl dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml. Amplifikasi DNA dibuat dari campuran 1 μl sampel DNA yang sudah diektraksi dan premix sebanyak 14 μl. Premix terdiri atas 0.3 μl primer, 0.3 μl dntp, 0.05 μl taq polymerase, μl DW, 1.5 buffer, dan 1.0 MgCl 2. Campuran diinkubasi dalam thermocycler (mesin PCR) untuk proses amplifikasi. Proses amplifikasi diawali dengan predenaturasi pada suhu 95 o C selama 5 menit. Tahap kedua terdiri atas 35 siklus, masing-masing siklus terdiri atas proses denaturasi pada suhu 95 o C selama 10 detik, annealing primer pada suhu 60 o C selama 20 detik dan ekstensi DNA pada suhu 72 o C selama 30 detik. Tahapan terakhir adalah elongasi pada suhu 72 o C selama 5 menit. Forward 685 CTCTATGACA TGGTTGCCTG AAAATGTAGG GGGCTCAGTG ACCCAGGAGC TGCCTTCCAC 745 GTCTCCTGTG CTCAGGTCAG ACTGACCTTC CATTACCAAA TCCGAACAAC AGGTCCAGAG 805 TCCTACACAG CTTCTTGTCC ATCCTGCTGA GCAGAATTTG CTTGCAAAAG AGCAAATGGG 865 GAAACAAAGC AGGACCTTTG ACCCCTCACT ATATTAGTTC TGCATAAATG CCAGTGTCTC 935 AGATGAGCAT CAACCTCAGC TTCAGCCTGG GAGAGAGAAA GCAGGACAGG TAAGAACTGC 985 ACTCTCTGCT CTGGGTGGGA TGGACCTTGG GACATTGACA AGTGAGTGGA GGTGACCTGC 1045 TCCACTTTTT ACAAAGCATG GACCCTCCTC ATGCTCTACA GCATGGAATA CTGCTGAAAT 1105 GGAAGAGGGT GGGAGTGAAT TGATGTTGAG CGATGGAAGC TCCATAGGAC ACTCATAGCA 1165 GGGTCAAAC Reverse Gambar 1 Posisi penempelan primer (garis bawah) dan titik potong (tebal) gen ApoVLDL-II SfcI (Ensembl nomor akses: ENSGALG ). Elektroforesis Hasil amplifikasi DNA divisualisasi melalui elektroforesis untuk menentukan kelayakan proses RFLP. Proses elektroforesis dimulai dengan pembuatan gel agarose. Gel terbuat dari 0.45 g agarose gel dan 30 ml 0.5 TBE yang dipanaskan dalam microwave pada suhu medium-high selama 3 menit, lalu dihomogenisasi dengan stirrer, ditambahkan 2.5 μl EtBr 10%. Gel dicetak pada tray pencetak dan dibiarkan hingga mengeras. Amplikon diambil sebanyak 5 μl dan dicampur loading dye 1 μl, campuran ditaruh pada sumur gel, pada sumur terakhir ditaruh marker dengan panjang 100 pb, lalu dielektroforesis pada

17 5 tegangan 100 V selama menit sampai fragmen DNA selesai bermigrasi di dalam gel. Visualisasi hasil elektroforesis dilakukan pada UV transiluminator. Produk PCR yang terang dan tidak ditemukan pita ganda (multiple bands) layak untuk digunakan pada proses selanjutnya. RFLP dan Pendeteksian Keragaman DNA Produk PCR sebanyak 5 μl dipindahkan ke dalam tabung ependorf 0.5 ml, ditambahkan 0.9 μl DW (Destilation Water), 0.4 μl enzim retriksi SfcI, dan buffer 0.7 μl. Campuran diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 o C. Amplikon yang telah dipotong enzim retriksi selanjutnya dielektroforesis kembali pada tegangan 100 V selama menit pada agarose gel dan diamati di bawah sinar UV. Pita DNA yang terlihat dilakukan pembandingan dengan marker, genotyping dilakukan berdasarkan panjang fragmen DNA yang terlihat. Posisi migrasi yang sama dianggap sebagai satu tipe alel dan digunakan untuk penentuan genotipe setiap sampel (Tabel 2). Tabel 2 Genotipe dan panjang produk hasil PCR-RFLP Lokus Genotipe Panjang Produk (pb) ApoVLDL-II SfcI AA GG AG dan , 396 dan 93 Analisis Data Frekuensi Alel dan Genotipe Frekuensi alel merupakan rasio suatu alel terhadap keseluruhan alel pada suatu lokus dalam populasi yaitu pada setiap jenis ayam yang diamati. Frekuensi alel dapat dihitung menggunakan rumus Nei dan Kumar (2000), sebagai berikut: ( ) Frekuensi genotipe adalah rasio suatu genotipe terhadap jumlah populasi. Keragaman genotipe pada masing-masing individu ternak dapat ditentukan melalui pita-pita DNA yang ditemukan. Frekuensi genotip dapat dihitung dengan rumus Nei dan Kumar (2000), sebagai berikut: Keterangan: x i = frekuensi alel ke-i; x ii = frekuensi genotipe ke-i; n ii = jumlah individu bergenotipe ii; n ij = jumlah individu bergenotipe ij; dan N = jumlah total sampel.

18 6 Keseimbangan Hardy-Weinberg (HW) Keseimbangan Hardy-Weinberg diuji dengan menggunakan perhitungan chi-kuadrat menurut Nei dan Kumar (2000) yaitu dengan rumus sebagai berikut: Keterangan: χ 2 = chi-kuadrat; O = jumlah pengamatan genotipe ke-i; dan E = jumlah harapan genotipe ke-i. Heterozigositas Keragaman genetik diketahui melalui estimasi frekuensi heterozigositas pengamatan dari masing-masing jenis ayam lokal, dapat dilakukan dengan perhitungan menurut Weir (1996): Keterangan: H 0 n ij N = heterozigositas pengamatan; = frekuensi alel ke-i; dan = jumlah individu yang dianalisis. Heterozigositas harapan dihitung menggunakan rumus berdasarkan Nei dan Kumar (2000) yaitu: Keterangan: H e x i q = heterozigositas harapan; = frekuensi harapan; dan = jumlah alel. HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi Gen ApoVLDL-II SfcI Gen ApoVLDL-II terletak pada kromosom 1 serta memiliki panjang basa 4222 pb yang terdiri dari 4 exon dan 3 intron (Ensembl Nomor akses: ENSGALG ). Menurut Li et al. (2005) terjadi mutasi pada basa 634 ruas intron 1 gen ApoVLDL-II dari Guanin (G) menjadi Adenin (A). Rekonstruksi gen ApoVLDL-II dan titik potong enzim SfcI pada ruas intron 1 dapat dilihat pada Gambar 2.

19 7 Gambar 2 Rekonstruksi gen ApoVLDL-II dan titik potong enzim SfcI pada intron 1 basa ke-1080 Hasil amplifikasi gen apo very low density lipoprotein-ii (ApoVLDL- II SfcI) menggunakan metode PCR (polymerase chain reaction) pada sampel ayam kampung ciawi, ayam kampung sukabumi, ayam merawang, ayam sentul, dan ayam pelung menghasilkan produk PCR (amplikon) sepanjang 489 pb. Menurut Muladno (2010) metode PCR terdiri atas 3 tahap yaitu denaturasi (pemisahan DNA untai ganda), annealing (penempelan primer) dan extension (pemanjangan) atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis enzim taq polymerase. Suhu annealing yang digunakan dalam amplifikasi gen ApoVLDL-II pada penelitian ini adalah suhu 60 o C. Menurut Viljoen et al. (2015) suhu optimum annealing DNA berkisar antara o C. Hasil tersebut dapat dilihat pada Gambar 3. M pb 489pb 400 pb 300 pb 200 pb 100 pb Keterangan : M= Marker, 1-16= sampel Gambar 3 Hasil amplifikasi gen ApoVLDL-II SfcI pada gel agarosa 1.5%. Keragaman Gen ApoVLDL-II SfcI Hasil analisis gen ApoVLDL-II pada populasi ayam lokal dengan menggunakan metode PCR-RFLP adalah bahwa semua populasi sampel beragam. Pada semua populasi sampel ditemukan 2 alel yaitu alel A dan alel G. Menurut

20 8 Allendorf dan Luikart (2006) populasi dapat dinilai beragam apabila memiliki lebih dari 1 alel dalam 1 lokus. Pada ayam kampung ciawi dan ayam kampung sukabumi ditemukan 3 macam genotipe yaitu AA (489 pb), AG (489, 396 dan 93 pb) dan GG (396 dan 93 pb), sedangkan pada ayam sentul, merawang dan pelung hanya ditemukan 2 macam genotipe yaitu AG (489, 396 dan 93 pb) dan GG ( 396 dan 93 pb). Hasil tersebut dapat dilihat pada Gambar 4. Keterangan : M= Marker, 1-11= sampel ayam kampung sukabumi Gambar 4 Hasil RFLP gen ApoVLDL-II SfcI pada gel agarosa 2% Frekuensi Genotipe dan Alel Gen ApoVLDL-II SfcI Frekuensi genotipe GG pada ayam kampung ciawi, ayam kampung sukabumi, ayam merawang, ayam sentul dan ayam pelung lebih tinggi daripada frekuensi genotipe AG dan AA. Perhitungan frekuensi alel menunjukkan nilai yang sama yaitu frekuensi alel G lebih tinggi dari pada alel A. Hasil ini sesuai dengan penelitian Seyedabadi et al. (2010) alel G mempunyai frekuensi yang lebih tinggi daripada pada alel A. Hasil penelitian Musa et al. (2008) ayam dengan genotipe AA mempunyai trigliserida dan VLDL (very low density lipoprotein) yang lebih tinggi dibandingkan ayam yang mempunyai genotipe AG. Musa dan Chen (2007) menjelaskan bahwa ayam dengan genotipe AA mempunyai bobot badan yang lebih tinggi dan berbeda secara signifikan dari ayam dengan genotipe AG dan GG. Nilai frekuensi genotipe dan frekuensi alel dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Nilai frekuensi genotipe dan frekuensi alel gen ApoVLDL-II SfcI pada populasi ayam lokal No Populasi N Frekuensi Genotipe Frekuensi Alel AA GG AG A G 1 Ayam Kampung Ciawi Ayam Kampung Sukabumi Ayam Merawang Ayam Sentul Ayam Pelung Keterangan: N= Jumlah sampel

21 9 Frekuensi genotipe GG yang ditemukan tinggi pada populasi ayam lokal menunjukan bahwa keunggulan ayam lokal adalah mempunyai trigliserida dan VLDL yang rendah. Hal ini memberikan informasi awal untuk seleksi pada ayam lokal berkaitan dengan sifat bobot badan dan kualitas kandungan lemak karkas. Keseimbangan Hardy-Weinberg pada Gen ApoVLDL-II SfcI Hasil analisis keseimbangan Hardy-Weinberg gen ApoVLDL-II SfcI menggunakan nilai chi-kuadrat (X 2 ) menerangkan bahwa sampel ayam kampung sukabumi, ayam merawang, ayam sentul, dan ayam pelung berada pada keseimbangan Hardy-Weinberg (X 2 hitung < X 2 tabel 0.05). Ayam kampung ciawi tidak berada dalam keseimbangan (X 2 hitung > X 2 tabel 0.05) Keseimbangan Hardy-Weinberg menggambarkan frekuensi alel dan genotipe dari generasi ke generasi yang tidak mengalami perubahan akibat adanya kawin acak atau random mating (Allendorf dan Luikart 2006). Nilai X 2 hitung dan X 2 tabel dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 Keseimbangan Hardy-Weinberg gen ApoVLDL-II SfcI berdasarkan uji chi -square (X 2 ) No Jumlah Sampel sampel X 2 hitung X 2 tabel 1 Ayam Kampung Ciawi Ayam Kampung Sukabumi Ayam Merawang Ayam Sentul Ayam Pelung Nilai X tabel dengan derajat bebas (db) 1 adalah Pada ayam ayam kampung sukabumi, ayam merawang, ayam sentul dan ayam pelung nilai X 2 hitung < X 2 tabel artinya populasi sampel berada pada keseimbangan Hardy- Weinberg. Pada ayam kampung ciawi tidak berada dalam keseimbangan Hardy- Weinberg (X 2 hitung > X 2 tabel). Menurut Noor (2008) suatu populasi yang cukup besar berada dalam keseimbangan Hardy-Weinberg jika terdapat frekuensi genotipe dominan dan resesif konstan dari generasi ke generasi, tidak ada seleksi, mutasi, dan migrasi. Keadaan populasi yang demikian disebut dalam keadaan equilibrium (Noor 2008). Pendugaan Nilai Heterozigositas Gen ApoVLDL-II SfcI Hasil analisis nilai heterozigositas gen ApoVLDL-II didapatkan nilai heterozigositas pengamatan (Ho) pada ayam kampung ciawi (0.114) dan sukabumi (0.179) lebih kecil dari nilai heterozigositas harapan (He) yaitu dan Nilai heterozigositas pengamatan pada ayam merawang, sentul dan pelung adalah (Ho) 0.080, 0.040, dan lebih besar dari nilai heterozigositas harapan (He) 0.077, dan Nilai Ho adalah proporsi heterozigotas pengamatan, sedangkan nilai He menerangkan nilai heterozigotas harapan jika

22 10 terjadi kawin acak (Allendorf dan Luikart 2006). Pendugaan nilai heterozigositas pengamatan (Ho) dan heterozigositas harapan (He) dapat dilihat pada Tabel 5. Tabel 5 Pendugaan nilai heterozigositas gen ApoVLDL-II SfcI Sampel Jumlah sampel Nilai He Nilai Ho Ayam kampung Ciawi Ayam kampung Sukabumi Ayam merawang Ayam sentul Ayam pelung Keterangan: Ho = heterozigositas pengamatan dan He = heterozigositas harapan Heterozigositas menerangkan hubungan kekerabatan antar ternak, makin jauh hubungan kekerabatan maka makin sedikit kesamaan gen-genya dan makin besar pula tingkat heterozigositasnya (Noor 2008). Nilai Heterozigositas berkisar antara 0 sampai 1 (Allendorf dan Luikart 2006). Nilai heterozigositas pengamatan gen ApoVLDL-II pada ayam sampel tergolong rendah yaitu berkisar Javanmard et al. (2005) menyatakan nilai heterozigositas pengamatan lebih rendah dari 0.5 mengindikasikan rendahnya variasi gen dalam populasi. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Hasil Identifikasi keragaman gen ApoVLDL-II SfcI pada ayam kampung ciawi, ayam kampung sukabumi, ayam merawang, ayam sentul, dan ayam pelung menunjukan gen tersebut bersifat beragam. Pada semua sampel ditemukan 2 macam alel yaitu alel A dan alel G, dengan frekuensi alel G lebih tinggi dari alel A. Sampel ayam kampung ciawi dan sukabumi ditemukan 3 genotipe (AA, AG dan GG), sedangkan ayam merawang, sentul dan pelung terdapat 2 genotipe (AG dan GG), dengan frekuensi genotipe GG lebih tinggi dari AG dan AA. Pada populasi ayam kampung sukabumi, ayam merawang, ayam sentul dan ayam pelung berada pada keseimbangan Hardy-Weinberg, sedangkan ayam kampung ciawi tidak berada pada keseimbangan. Nilai heterozigositas pada sampel ayam tergolong rendah berkisar Saran Penelitian lanjutan dengan melakukan korelasi antara berbagai macam genotipe (AA, AG, GG) terhadap pertumbuhan, bobot badan, bobot karkas, dan lemak dapat dilakukan. Hal bermanfaat untuk menunjang program seleksi sehingga memperoleh bibit unggul dalam rangka pemenuhan kebutuhan daging unggas di Indonesia.

23 11 DAFTAR PUSTAKA Allendorf FW, Luikart G Conservation and the Genetics of Population. Oxford (GB): Blackwell Publishing. Javanmard A, Asadzadeh N, Banabazi MH, Tavakolian J The allele and genotype frequencies of bovine pituitary-specific transcription factor and leptin genes in Iranian cattle and buffalo populations using PCR-RFLP. Iranian Biotechnol. 3(2): Li H, Deeb N, Zhou H, Ashwel CM, Lamont SJ Chicken quantitative trait loci for growth and body composition associated with the very low density Apolipoprotein-II gene. Poult Sci. 84: Muladno Teknologi Rekayasa Genetika. Ed ke-2. Bogor (ID): IPB Pr. Musa HH, Chen GH, Cheng JH, Bao WB, Suleiman AH Single strand conformation polymorphism in intron 1 of the chicken apovldl-ii gene, and its relationship with triglyceride and very low density lipoprotein concentrations. Turk J Vet Anim Sci. 2009; 33(3): Musa HH, Chen GH Association of polymorphisms in avian apovldl-ii gene with body weight and abdominal fat weight. Afr J Biotechnol. 6: Nataamijaya AG Pengembangan Potensi Ayam Lokal untuk Menunjang Peningkatan Kesejahteraan Petani. J Litbang Pertanian. 29(4). Nei M, Kumar S Molecular Evolution and Phylogenetics. New York (US): Oxford Univ Pr. Noor RR Genetika Ternak. Bogor (ID): Penebar Swadaya. Sambrook J, Fritsch EF, Medrano JF Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Ed ke-2. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory Pr. Seyedabadi HR, Amirinia C, Amirmozafari N, Torshizi RV, Chamani M Association between single nucleotide polymorphism of apovldl-ii gene with growth and body composition traits in Iranian commercial broiler line. Afr J Biotechnol. 9: Viljoen GJ, Nel LH, Crowther JR Molecular Diagnostic PCR Handbook. Netherlands (NL): Springer. Weir BS Genetic Data Analysis II: Method for Discrete Population Genetic Data. Ed ke-2. Sunderland (GB): Sinauer Associates.

24 12 LAMPIRAN 1 Sekuen gen ApoVLDL-II (Ensembl Nomor akses: ENSGALG ) ( Description Synonyms Location About this gene apovitellenin 1 [Source:CGNC Symbol;Acc:49826] APOVLDLII apo-ii apo-vldl-ii apovitellenin I apovitellenin-1 very low density lipoprotein II, APOVLDLII, APO-VLDL-II, APO-II Chromosome 1: 82,609,206-82,612,227 reverse strand. Galgal4:CM This gene has 1 transcript (splice variant) and 6 orthologues. Transcripts >chromosome:galgal4:1: : :-1 AGATACTGGTTGAGCTTTTCAGAGAGTCCATCTGTTAGTTGAAATTCATGTCAGTGACTT AGTAGGTGGCTAATACTACTTTATGTCACTGACATAAGATTGTTTTGTTGGATCTCACAT TGTAGGTTTCATGTATGCCTCATGCCTGCACCTTTTCCTCAGCTAATGCCATTTGTTGCT CCATATTGCAAATGTTCTGCCTCCTGTTCAATGGTTTTATGTGTAAGATACTGATGGTTG ACCTTACTGAAGACCCAATGGGCTCTCAGAGATTGAGCTATGATTGAGATTGAGCTACAT TCCACAGCATGGCACTACAGATGCTTTCTGACTGGGCACAGTTCCCTAGGCAGTCTGGGT AGAAGTTATGCTTCCCCTGTGCAGATCTTGGCAAGTGGCTGAGATTTACACCCATTTTGT CAGCCTGCGCAAAAAGGCTTGGCTATGGGGAAAAATGAACTGTGAGAGTACTGTATGTAT ACATATACCTGTGTGCACCAGTTGGTTAATACATTTGTTGGAAACAGAGGGTGAACTGTG AATGAGCATAATAGACACAAATAATTTGCAGCTGTCAAAGTGGTCGGCTTTCAACATGAG CCTTCCCACAGGAACAGTGGGAGCAAAAATCAGTCCAGCTGTAGCTACAGTTAATGTGGA ATTTGGTCAGTTTATGAAAGGGGCCTCTATGACATGGTTGCCTGAAAATGTAGGGGGCTC AGTGACCCAGGAGCTGCCTTCCACGTCTCCTGTGCTCAGGTCAGACTGACCTTCCATTAC CAAATCCGAACAACAGGTCCAGAGTCCTACACAGCTTCTTGTCCATCCTGCTGAGCAGAA TTTGCTTGCAAAAGAGCAAATGGGGAAACAAAGCAGGACCTTTGACCCCTCACTATATTA GTTCTGCATAAATGCCAGTGTCTCAGATGAGCATCAACCTCAGCTTCAGCCTGGGAGAGA GAAAGCAGGACAGGTAAGAACTGCACTCTCTGCTCTGGGTGGGATGGACCTTGGGACATT GACAAGTGAGTGGAGGTGACCTGCTCCACTTTTTACAAAGCATGGACCCTCCTCATGCTC TACAGCATGGAATACTGCTGAAATGGAAGAGGGTGGGAGTGAATTGATGTTGAGCGATGG AAGCTCCATAGGACACTCATAGCAGGGTCAAACCCATGGTTAGGAACTGCAGAGTTGCAG AGTTGGAATATACATGACTTTTTCCCAGCTGCCCTCACCGATAGCAGCTTTAGGTTCTAG AGCAGGTAAGATCCTCTCTTTACAATCCTGGGAAGCAAATTTATACCTTTTGTCTACAAC GGGAGAAACTGGCCTTAGGATTAAAATTCAAAGAAGGGTAGTAACTGAGCAACAGCTGCT AGTCAGCAAATTCCTAGTGAAGATGGAGTGGTAGTTTTGGGAAGTAATCTGTGCATAGAA GGAAATCAAAACAGGTATACACTGCCTTACTGCAGAATAAGAAACACAGGATTTAGCAAA GTATTCATATGGAATAGGTGTACAGCTCTTTTTGCCATTGCAATTCCTAGCACTGATGTT TCCATCATGTTGTTTTGACTGATGCAACCCTGTAGTTCAGCCTTTAAATCTGTTTTACTT TCTAACACCTTTCTAAATGCACAGTATTTGAAAAGTTTGTTTAGATGTAATGTCATCTTT TCAATGTACCAACTTTTCAAGAGTTTCTTGAATTCCAGATTTTTCAATAGACAGAATAAA GGATGTTGGATGATGGTGAAGTTTGCACTTATTTCCTTCTGATAATTTGTTCTGCCTGGG TTGCTGTCTGCTTCACTTATCAGTGTGGAAGAGACAAGAGAACCTGCTTGGGTCTTTCCT CAACTAGAGCAAGACAAAGTACTCAGATCACTGTGTCATTCAGAAGATCATTGCATGTGA TGCATTGACTAGCGTGAGATTCCTTACAGCAGTTGACAAAAATTCAAGAAAAAAAACAAA CTGCAGCATGACTTTTTCATTTTTACCCCTGTGTGGAAGAAGTCTTTTCTGACCACAGTG TTCATTGTTTGCTCCTATGTTGAAGCAAGGAATTTTAACTTAGAAGAAATAACTTTAAGC ATCACATATTTCTTGGAGCTCTGAAAGCTATCATTCATTGTGGATATTTGTGATTACATG AATAAAAGAACATGTTCATTTTTGTGCTCTATTTTCCTCACTTCTTAAGAAGAACTGCAC CATCATATTTCCTGTCTTTTTTGTTTTGTTGTTTTTTTTTTAATTATTATATATTGGTTA TACAAACCTGATGTTTAGTAGACATGATATTTTTCTAAAAACAAACAAAATATTGTATGG TTATCCCAGCAGGTCTCTTGGTGTAAAGGGCTGAACTGGTACCAACAAACCATGGTGCAA

25 13 TACAGGGCATTGGTGATAGCTGTGATTCTGCTCCTTAGCACCACTGTCCCTGGTAAGTTT GAACAGCTTTTGAGACAGGTTCTCATTACCTTGGAGAAGTCTATCCCATCCACAAAGTAA GGCTGAAACCCAGTAACACAGTTAAAAACCATGAGTACCTGGTGCTTTCTAAAGTGAAAG TAGGGGCTTGGTTTGCAAAGCATCCATACCTGGTAGAAATACTCTGCCAGGTCATGTGAC TCAGGTGCCCAGAAATTAGTAATGAAAATTAGCTGGGTGCTGTTAGAGCAAATTCTTTGA ACCTGAGAATTTTGCATCTTTTTCCACTGTCTCTGGTGGAAGAGAGACATGTGACTGGAG AAGCCTCATGTTTTTTTTTGCCTCCTCCCTCTCAGAAGTGCACTCAAAGTCCATCATTGA CAGAGAACGTCGTGACTGGCTGGTCATCCCTGATGCAGCTGCAGCTTACATCTACGAAGC TGTGAACAAGGTGTCCCCTAGAGCTGGTCAGTTCTTGCTGGATGTTTCCCAGACTACAGT AGTTTCTGGGATCAGGTATGGAAAACACTTCTGTGCTAGCGTTGCAATAGCCATAGGTGG AAAAGGAGAGGGAGAAGTGGGAAAAAGAACAGATTGATCAGGTATCTGTATGAGGGGACC CAAGGGACAAAGAATGCATGGGTAGGGGTGGGGTGGGGGGCAATGACTGGTAGGGTATCA GCACCCTGGAAGAGGCTGAGCAGATGCTGCGGTGCTGGCTGTGAGGAGTTGAGTACTGAA GGTGCCAGCAACACTGATGGCACTCAACTCAGATTATAAAATTCACTCTATCTCTAAATA TGTATTCCTCAAAGAAAGGGAAGGAGTTTCCCCCAGAAGAAAAAGCACAACAACTCACGA GATAAAGTTTTGCCTAACTCACAGCAAATACAGACTGCCTATTCCTGCCTTCTGAGGAAA GCCCCTTTAGGACTGCAAAGGAGATCTGCACCAGTGACAGGCAGTGTGAAAGAAGGATAG CTTGATAACTACTGCAGAGATTACTCTCACTCCCATATGTATATATCTCACCATGTATGC TGTTGTCTCCTGCAGGAACTTCCTCATCAATGAAACGGCTAGACTCACTAAACTGGCGGA ACAGCTGATGGAAAAAATAAAGAACCTGTGTTACACAAAAGTGCTAGGCTACTAGTTGGA AGAAAAGTCGGTGTTCCCTTAAGTGAGTGGGTAGCATCCTGCAGTGTCCTCTTTCCCCTT GCCTCTACTATGGACCAAGATCAGTCAATAACAAAGAATTGATGCTCCCATTAATGTAAC TAGAGGGAACCCAGCATCAAAGACCAAAGGATGGATGATATCTGCAGAGCTCTGCTGTAG CCAAATCTTGAAAATTAATTCCTCCTGAATGACTTGGCCATTGACCCTCTAATAAAAAAA TGTTGGTTGTTACACTTCTTTCAGTTTCCTACTCGAACTGACTGTTATAAAATCACATCC AACTCTGCACCCCATTCTGCTGAGAAAGTCGCTGTGATTCACAATAAGTTGTTACAGGCT ATGCGTGCAAACCCTGACAGTACAGGCACACTTAACTAAGCTCATGTTCTTGGTAGATGG GGGGATGCTTGAACATCTTTTGGAGTCACCACAGCATGGCAACCAGAGTAGCCATAACCT CACATTATGAGAGGCCATGAAATGTTGAGTCCCACTAATTGTTCTCCTTGGTTGGGTAAG AAGCAAGCAGATGCACCTGTACCAAGTGTCTGAAGATTTCAGACCATTTAGGAAGTGCCA GTAAATGGAACTGTGCATCAGT 2 Alat-alat yang digunakan dalam penelitian

26 14 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 29 Maret 1994 di Indramayu, Jawa Barat. Penulis merupakan anak pertama dari 2 bersaudara pasangan Bapak Satim dan Ibu Mustanginah. Pendidikan SD, SMP dan SMA penulis selesaikan di kota Indramayu yaitu SDN Gadingan III dari tahun 2000 sampai 2006, selanjutnya melanjutkan di SMPN 1 Sliyeg tahun 2006 sampai 2009, masuk SMA tahun 2009 di SMAN 1 Sliyeg dan lulus tahun Pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk perguruan tinggi negeri IPB jalur undangan dan diterima sebagai mahasiswa Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor angkatan 49. Selama mengikuti pendidikan penulis aktif mengikuti berbagai kegiatan diantaranya organisasi OMDA Indramayu IKADA (Ikatan Keluarga dan Mahasiswa Darma Ayu) sebagai Infokom tahun Penulis juga aktif menjadi anggota CUA (Chess Unity of Agriculture) atau organisasi catur kampus dari tahun 2012 sampai Pada tahun pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Genetika Ternak.