Laporan terinci hasil kajian beserta nama tim pengkaji sebagaimana tercantum dalam Lampiran 1, Lampiran 2, dan Lampiran 3.

Transkripsi

1 LAPORAN TIM TEKNIS KEAMANAN HAYATI PRODUK REKAYASA GENETIK BIDANG KEAMANAN PANGAN TENTANG HASIL PENGKAJIAN KEAMANAN PANGAN KEDELAI PRODUK REKAYASA GENETIK EVENT MON Kegiatan : Pengkajian Keamanan Pangan Kedelai Produk Rekayasa Genetik (PRG) Event MON Pemohon : PT. Branita Sandhini Tanggal Pengkajian : Februari 2017 Tim Kecil Tim Teknis Keamanan Hayati Bidang Keamanan Pangan Juli 2017 Pleno Tim Teknis Keamanan Hayati Pangan Undang-Undang Republik Indonesia Nomor 18 Tahun 2012 tentang Pangan, Pasal 77 ayat (2) berbunyi: Setiap Orang yang melakukan kegiatan atau proses Produksi Pangan dilarang menggunakan bahan baku, bahan tambahan Pangan, dan/atau bahan lain yang dihasilkan dari Rekayasa Genetik Pangan yang belum mendapatkan persetujuan Keamanan Pangan sebelum diedarkan. Ketentuan lebih lanjut mengenai pengkajian keamanan pangan tersebut tertuang dalam Peraturan Pemerintah Republik Indonesia Nomor 28 Tahun 2004 tentang Keamanan, Mutu dan Gizi Pangan; Peraturan Pemerintah Republik Indonesia Nomor 21 Tahun 2005 tentang Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik; Peraturan Presiden Republik Indonesia Nomor 39 Tahun 2010 tentang Komisi Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik, yang telah diubah oleh Peraturan Presiden Republik Indonesia Nomor 53 Tahun 2014; Peraturan Kepala Badan POM HK Tahun 2012 tentang Pedoman Pengkajian Keamanan Pangan Produk Rekayasa Genetik, yang telah diubah oleh; dan Keputusan Ketua Komisi Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik (KKH PRG) Nomor: KEP- 01/KKH/03/2017 tentang Perubahan Atas Keputusan Ketua Komisi Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik Nomor : KEP-02/KKH/10/2015 tentang Penetapan Tim Teknis Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik. Sehubungan dengan permohonan dari PT. Branita Sandhini untuk memeriksakan keamanan pangan bagi kesehatan manusia terhadap kedelai PRG event MON sebelum diedarkan, TTKH telah melakukan pengkajian keamanan pangan terhadap kedelai PRG event MON Pelaksanaan pengkajian dilakukan berdasarkan Peraturan Kepala Badan POM HK Tahun 2012 tentang Pedoman Pengkajian Keamanan Pangan Produk Rekayasa Genetik yang telah diubah oleh Peraturan Kepala Badan POM No. 19 Tahun 2016 dan surat penugasan ketua Komisi Keamanan Hayati kepada Wakil Ketua Bidang Keamanan Pangan KKH PRG Nomor B-/33/KKH PRG/12/2016 Tanggal 30 Desember 2016 Perihal Penugasan Pengkajian Keamanan Pangan Produk Rekayasa Genetik (PRG) Komoditas Kedelai Event MON Berdasarkan hasil pengkajian disimpulkan hal-hal sebagai berikut : 1. Kedelai PRG event MON mengandung satu kopi sisipan T-DNA yang berisi gen cry1a.105 dan cry2ab2; tidak mengandung sekuen backbone dari 1

2 plasmid transformasi PV-GMIR13196; T-DNA dalam kedelai PRG event MON masih stabil sampai lima generasi, serta diwariskan mengikuti hukum Mendel. 2. Kedelai PRG event MON sepadan secara substansial dengan kedelai non PRG; tidak menunjukkan adanya potensi menimbulkan alergi; dan tidak termasuk ke dalam bahan yang bersifat toksik. 3. TTKH menilai bahwa kedelai PRG event MON yang diajukan adalah aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pangan. 4. Apabila kemudian ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan pangan yang diperoleh hingga saat ini, maka status keamanan pangan kedelai PRG event MON perlu dikaji ulang. 5. Apabila setelah ditetapkan aman pangan, kemudian kedelai PRG event MON terbukti menimbulkan dampak negatif terhadap kesehatan manusia maka pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan, serta menarik kedelai PRG event MON dari peredaran. 6. Kedelai PRG event MON tidak boleh digunakan sebagai pakan ternak sampai memperoleh sertifikat aman pakan. 7. Kedelai PRG event MON tidak boleh dibudidayakan sampai ditetapkan aman lingkungan. Laporan terinci hasil kajian beserta nama tim pengkaji sebagaimana tercantum dalam Lampiran 1, Lampiran 2, dan Lampiran 3. 2

3 Lampiran 1. Ringkasan Pengkajian Keamanan Pangan Kedelai PRG event MON I. Pendahuluan Kedelai PRG event MON merupakan kedelai produk rekayasa genetik dari perusahaan PT. Branita Sandhini yang menghasilkan protein insektisidal Cry1A.105 dan Cry2Ab2. Protein Cry1A.105 dan Cry2Ab2 bertanggung jawab atas ketahanan terhadap serangan hama serangga Lepidoptera. Kedelai PRG event MON telah memperoleh sertifikat aman pangan di Amerika Serikat (2014), Kanada (2014), Australia dan Selandia Baru (2015), Jepang (2016), dan Taiwan (2016). Pengkajian keamanan pangan kedelai PRG event MON dilakukan berdasarkan Peraturan Kepala Badan POM Nomor HK Tahun 2012 tentang Pedoman Pengkajian Keamanan Pangan Produk Rekayasa Genetik yang telah diubah oleh Peraturan Kepala Badan POM Nomor 19 Tahun 2016 dan surat penugasan Ketua Komisi Keamanan Hayati kepada Wakil Ketua Bidang Keamanan Pangan KKH PRG Nomor B-/33/KKH PRG/12/2016 Tanggal 30 Desember 2016 Perihal Penugasan Pengkajian Keamanan Pangan Produk Rekayasa Genetik (PRG) Komoditas Kedelai Event MON TTKH PRG Bidang Pangan telah melakukan pengkajian keamanan pangan kedelai PRG event MON berdasarkan informasi genetik dan informasi keamanan pangan yang terdiri atas kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas sebagaimana diuraikan di bawah ini. II. Informasi Genetik II.1. Elemen Genetik Kedelai PRG event MON dirakit menggunakan plasmid PV-GMIR Plasmid PV-GMIR13196 tersebut mengandung dua T-DNA (T- DNA I dan T-DNA II). T-DNA I mengandung dua kaset yaitu 1) kaset cry1a.105 yang berisi gen cry1a.105 yang dimodifikasi dan diregulasi oleh promoter RbcS4 dan terminator Pt1; 2) kaset cry2ab2 berisi gen cry2ab2 yang diregulasi oleh promoter Act2 dan terminator Mt; dan T-DNA II mengandung kaset ekspresi berisi gen penanda 1) gen aada yang diregulasi oleh promoter EF 1α dan terminator E9, dan 2) gen spla yang diregulasi oleh promoter usp dan terminator nos untuk seleksi dari jaringan yang telah ditransformasi (Garnaat et al. 2015). Kedelai PRG event MON mengandung 2 gen interes, yaitu : 1. Gen cry1a.105 menyandi protein Cry1A.105 untuk ketahanan terhadap hama dari ordo Lepidoptera seperti: Crocidosema aporema (bean shoot moth), Rachiplusia nu (sunflower looper), Spodoptera frugiperda (fall armyworm), Anticarsia gemmatalis (velvetbean caterpillar), Cjamysodeixis includens (soybean looper) dan Helicoverpa zea (corn earworm); dan 2. Gen cry2ab2 menyandi protein Cry2Ab2 untuk ketahanan terhadap hama utama kedelai seperti C. aporema, R. nu, S. frugiperda, A. gemmatalis, C. includens dan H. zea. II.2. Sumber Gen Interes Sumber gen interes kedelai PRG event MON 87751, yaitu gen cry1a.105 berasal dari bakteri tanah Bacillus thuringiensis, dengan promoter RbcS4 berasal dari tanaman Arabidopsis thaliana, dan terminator Pt1 berasal dari tanaman 3

4 Medicago truncatula. Gen cry2ab2 berasal dari bakteri tanah B. thuringiensis subsp. kurstaki, dengan promoter Act2 berasal dari tanaman A. thaliana, dan terminator Mt berasal dari tanaman padi (Oryza sativa) (Garnaat et al. 2015). Gen aada berasal dari bakteri Escherichia coli, dan promoter EF 1α berasal dari A. thaliana, dan terminator E9 berasal dari Pisum sativum. Gen spla berasal dari Agrobacterium tumefaciens, dengan promoter usp berasal dari Vicia faba, dan terminator nos berasal dari A. tumefaciens (Garnaat et al. 2015). II.3. Sistem Transformasi Kedelai PRG event MON dirakit dengan metode transformasi dimediasi Agrobacterium tumefaciens. Eksplan meristem yang diambil dari embrio biji kedelai galur A3555 diinfeksi dengan A. tumefasiens strain AB30 yang mengandung plasmid PV-GMIR13196 (Garnaat et al. 2015). Selama transformasi, kedua T-DNA disisipkan ke dalam genom kedelai. Selanjutnya, melalui pemuliaan konvensional, pemisahan, pemilihan dan seleksi digunakan untuk mengisolasi tanaman tersebut yang berisi kaset ekspresi cryla.105 dan cry2ab2 (T-DNA I) dan tidak berisi kaset ekspresi gen penanda (T- DNA II), sehingga menghasilkan kedelai PRG event MON (Garnaat et al. 2015). II.4. Stabilitas Genetik Hasil analisis dengan metode Next Generation Sequencing dan Junction Sequence Analysis (NGS/JSA) pada kedelai PRG event MON menunjukkan bahwa gen interes stabil sampai lima generasi. Data dari analisis NGS/JSA menunjukkan bahwa kedelai PRG event MON mengandung satu kopi T-DNA yang berisi gen cry1a.105 dan cry2ab2, dan diwariskan mengikuti hukum Mendel. Selain itu, melalui analisis NGS/JSA diketahui bahwa kedelai PRG event MON tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi PV-GMIR13196 (Garnaat et al. 2015). Berdasarkan hasil kajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa : 1. Kedelai PRG event MON mengandung satu kopi T-DNA yang berisi gen cry1a.105 dan cry2ab2; 2. T-DNA dalam kedelai PRG event MON masih stabil sampai lima generasi, serta diwariskan mengikuti hukum Mendel; dan 3. Kedelai PRG event MON tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi PV-GMIR III. III.1 Informasi Kemanan Pangan Kesepadanan Substansial Pengkajian kesepadanan substansial ini dilakukan berdasarkan dokumen Amended Report for MSL : Compositional Analyses of Soybean Forage and Seed Harvested from MON and the Control Grown in the United States During the 2012 Season (Elisa Leyva-Guerrero et al. 2014). Bahan yang digunakan untuk uji kesepadanan substansial adalah tanaman kedelai PRG event MON dan tanaman kedelai konvensional sebagai kontrol. Kedelai ditanam dalam rancangan randomized complete block design dengan empat ulangan pada setiap lokasi dari delapan lokasi penanaman di Amerika Serikat selama musim tanam tahun Kedelapan lokasi penanaman 4

5 adalah: Jackson County, Arkansas (ARNE), Story County, Iowa (IAHU), Jefferson County, Iowa (IARL), Champaign County, Illinois (ILTH), Pawnee County, Kansas (KSLA), Perquimans County, North Carolina (NCBD), Merrick County, Nebraska (NECC) dan Lehigh County, Pennsylvania (PAGR). Semua tanaman kedelai tumbuh dalam kondisi agronomik normal sesuai dengan kondisi geografis masing-masing wilayah. Setelah dipanen, biji kedelai dan tanaman kedelai (forage) dianalisis di laboratorium Covance Laboratories Inc., 3301 Kinsman Blvd, Madison, Wisconsin Covance Laboratories sudah menerapkan Good Laboratory Practices (GLP). Biji kedelai dianalisis untuk kandungan gizi termasuk kadar proksimat (protein, lemak, abu, air dan karbohidrat dihitung by-difference), serat [(acid detergent fiber (ADF) dan neutral detergent fiber (NDF)], asam-asam amino (alanin, arginin, asam aspartat, sistein, asam glutamat acid, glisin, histidin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptopfan, tirosin, dan valin), asam-asam lemak (C16:0 palmitat, C18:0 stearat, C18:1 oleat, C18:2 linoleat, C18:3 linolenat, C20:0 aracidat, C20:1 eikosenoat, dan C22:0 behenat), vitamin E (tokoferol), vitamin K1 (filokuinon) dan mineral (kalsium dan fosfor), serta zat anti gizi (lektin, inhibitor tripsin, asam fitat, rafinosa dan stakhiosa) dan komponen lain seperti isoflavon. Tanaman kedelai dianalisis untuk kadar proksimat (protein, lemak, abu, air dan karbohidrat by-difference), serta serat (ADF, NDF). Secara umum hasil analisis komposisi biji kedelai dan tanaman kedelai menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata antara kedelai PRG event MON dan kedelai konvensional, dan masuk ke dalam kisaran komposisi kedelai komersial. Berdasarkan hasil pengkajian kesepadanan substansial dapat disimpulkan bahwa kedelai PRG event MON sepadan secara substansial dengan kedelai non PRG. III.2 Alergenisitas Pengkajian alergenisitas produk kedelai PRG event MON dilakukan terhadap protein Cry1A.105 dan Cry2Ab2 melalui analisis bioinformatika, pengukuran konsentrasi protein dan analisis stabilitas cerna. III.2.1 Analisis Bioinformatika Kemiripan struktural protein Cry1A.105 dan Cry2Ab2 dengan alergen, dianalisis menggunakan program FASTA. Database protein alergen, (AD_2013 yang berisi 1491 data) diperoleh dari Food Allergy Research dan Resource Program Database (FARRP, 2011). Hasil analisis menunjukkan : 1) Protein Cry1A.105 dan Cry2Ab2 tidak memiliki kemiripan sekuen asam amino yang relevan dengan sekuen asam amino protein alergen; 2) Tidak ditemukan kemiripan sekuen asam amino yang melebihi 35% pada fragmen 80 asam amino; 3) Tidak ada kemiripan sekuen delapan asam amino berurutan protein Cry1A.105/ Cry2Ab2 dengan protein alergen. (Codex Alimentarius, 2009; Kang dan Silvanovich, 2013a; Kang dan Silvanovich, 2013b) 5

6 III.2.2 Analisis Konsentrasi Protein Konsentrasi protein Cry1A.105 dan Cry2Ab2 diukur dengan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Protein Cry1A.105 dan Cry2Ab2 dalam biji kedelai PRG event MON masing-masing sebesar 0,0006% dan 0,001% dari total protein kedelai (Mozaffar, 2013). III.2.3 Analisis Stabilitas Cerna Jumlah protein Cry1A.105 dan Cry2Ab2 yang dihasilkan oleh tanaman kedelai PRG event MON sangat sedikit, oleh karena itu untuk keperluan pengujian, protein Cry1A.105 dan Cry2Ab2 diproduksi pada bakteri E.coli. Kesetaraan protein Cry1A.105 dan Cry2Ab2 yang dihasilkan oleh tanaman kedelai PRG event MON dengan yang dihasilkan oleh bakteri E. coli diuji dengan metode Western Blot, analisis sekuen N-terminal, reaksi glikosilasi dan uji bioaktivitas menggunakan corn earworm. Hasil pengujian tersebut menyimpulkan bahwa protein Cry1A.105 dan Cry2Ab2 yang dihasilkan oleh E.coli ekivalen dengan protein Cry1A.105 dan Cry2Ab2 yang dihasilkan oleh tanaman kedelai PRG event MON 87751(Chen & Mueller, 2013; Wang et al., 2013). Analisis stabilitas protein Cry1A.105 dan Cry2Ab2 dilakukan melalui (1) uji daya cerna menggunakan model pencernaan lambung (Simulated Gastric Fluid- SGF) dan usus (Simulated Intestinal Fluid-SIF) serta (2) uji stabilitas panas. Hasil hidrolisis protein diuji dengan SDS PAGE dan Western Blot. Data SDS-PAGE menunjukkan bahwa protein Cry1A.105 terhidrolisis sepenuhnya setelah inkubasi 0,5 menit dalam SGF. Selanjutnya fragmen peptida transien Cry1A.105 ~60 kda terhidrolisis dalam waktu 2 menit, dan fragmen transien <5 kda terhidrolisis setelah 30 menit inkubasi dalam SGF. Analisis Western blot mengkonfirmasi bahwa dalam 0,5 menit lebih dari 98% protein Cry1A.105 terhidrolisis (Barlow et al., 2013). Data SDS-PAGE menunjukkan bahwa protein Cry1A.105 terhidrolisis dalam waktu 2 menit setelah inkubasi di SIF dan fragmen transien kecil ~5 kda terhidrolisis sepenuhnya dalam waktu 0,5 menit dalam SIF. Data Western blot mengkonfirmasi bahwa 98,4% protein Cry1A.105 terhidrolisis setelah 5 menit inkubasi dalam SIF (Barlow et al., 2013). Protein Cry1A.105 kehilangan 96% aktivitas insektisidalnya ketika dipanaskan pada 75ºC (Gu dan Mueller, 2013a). Data SDS-PAGE menunjukkan bahwa protein Cry2Ab2 terhidrolisis dalam waktu 5 menit dalam SGF. Fragmen Cry2Ab2 transien (~4-5 kda) terhidrolisis setelah 2 menit inkubasi dalam SGF. Data Western blot mengkonfirmasi bahwa 99% protein Cry2Ab2 terhidrolisis dalam waktu 5 menit dalam SGF, dan 96% protein Cry2Ab2 terhidrolisis setelah inkubasi 5 menit dalam SIF (Wang dan Hernan, 2013). Protein Cry2Ab2 kehilangan 96 % aktifitas insektisidalnya ketika dipanaskan pada 75ºC (Gu dan Mueller, 2013b). Berdasarkan hasil pengkajian alergenisitas dapat disimpulkan bahwa protein Cry1A.105 dan Cry2Ab2 tidak menunjukkan adanya potensi menimbulkan alergi. III.3 Toksisitas Pengujian toksisitas akut telah dilakukan terhadap protein CrylA.105 dan Cry2Ab2 di laboratorium yang menerapkan GLP. 6

7 III.3.1 Toksisitas Akut Protein CrylA.105 Pengujian toksisitas akut telah dilakukan terhadap protein CrylA.105 dan telah dilaporkan (Bonnette, 2005). Jumlah protein Cry1A.105 yang dihasilkan oleh tanaman kedelai PRG event MON sangat sedikit, oleh karena itu untuk keperluan pengujian, protein Cry1A.105 diproduksi pada bakteri E.coli. Kesetaraan protein Cry1A.105 yang dihasilkan oleh tanaman kedelai PRG event MON dengan yang dihasilkan oleh bakteri E. coli diuji dengan metode Western Blot, analisis sekuen N-terminal, reaksi glikosilasi dan uji bioaktivitas menggunakan corn earworm. Hasil pengujian tersebut menyimpulkan bahwa protein Cry1A.105 yang dihasilkan oleh E.coli ekivalen dengan protein Cry1A.105 yang dihasilkan oleh tanaman kedelai PRG event MON (Chen & Mueller, 2013). Uji toksisitas akut terhadap protein Cry1A.105 dilakukan menggunakan mencit jantan dan betina. Pemberian bahan uji dilakukan secara oral dengan cekokan tunggal. Bahan yang diuji berupa larutan protein Cry1a.105, dan larutan bovine serum albumin (BSA) sebagai kontrol. Protein Cry1A.105 disuspensikan dalam larutan dapar 1 mm karbonat-bikarbonat, ph 10,26. Protein BSA dilarutkan dalam larutan dapar 25,8 mm karbonat-bikarbonat ph 10,28, dan 3,1 mm glutation tereduksi, yang juga merupakan larutan kontrol pelarut (Lee et al., 2005). Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit jantan dan betina, strain CrI: CD-1 (ICR)BR (VAF/Plus ), yang berasal dari Charles River Laboratories, Inc., Stone Ridge, New York. Mencit jantan berumur sekitar 8 minggu, dengan berat badan antara 26,7-30,5 g pada hari ke 0, sedangkan mencit betina berumur sekitar 9 minggu dengan berat badan antara 24,4-27,9 g pada hari ke 0. Mencit mengalami aklimatisasi selama 5 hari, kemudian dipindahkan ke dalam kandang stainless steel secara individual, yang ditempatkan dalam ruangan bersuhu o C dan kelembaban relatif %, dengan pencahayaan selama 12 jam terang 12 jam gelap. Ransum yang berupa PMl Certified Rodent Meal # 5002 (PMI Nutrition International), diberikan secara ad libitum selama pengujian berlangsung. Air minum (Municipal tap water treated by reverse osmosis) juga diberikan secara ad libitum (Bonnette, 2005). Sebanyak 30 ekor mencit jantan dan 30 ekor betina dibagi menjadi tiga kelompok (10 ekor jantan dan 10 ekor betina per kelompok). Kelompok 1 diberi cekokan larutan kontrol pelarut sebanyak 66,6 ml/kg BB (diberikan dua kali, masing-masing sebanyak 33,3 ml, pada hari yang sama). Kelompok 2 diberi cekokan larutan protein BSA, sebagai protein kontrol sebanyak 66,6 ml/kg BB (setara dengan dosis target sebesar 1000 mg protein BSA/kg BB, atau berdasarkan hasil analisis sebesar 1998 mg protein BSA/kg BB) (Lee et al., 2005), yang diberikan dua kali pada hari yang sama, masing-masing sebanyak 33,3 ml. Sedangkan kelompok 3 diberi cekokan larutan protein Cry1A.105, sebagai protein uji; sebanyak 66,6 ml/kg BB (setara dengan dosis target sebesar 1000 mg protein Cry1A.105/kg BB, atau berdasarkan hasil analisis sebesar 2072 mg protein Cry1A.105/kg BB), yang diberikan dua kali pada hari yang sama, masing-masing sebanyak 33,3 ml. Pemberian 7

8 bahan uji atau kontrol hanya dilakukan sekali, yaitu pada hari ke 1, dengan dua kali cekokan yang berselang sekitar 4 jam, sedangkan pengujian berlangsung selama 14 hari. Observasi klinis dilakukan setiap hari, sedangkan penimbangan berat badan dan perhitungan konsumsi ransum dilakukan pada hari ke 0, ke 7 dan hari ke 14. Pada hari terakhir pengujian, semua mencit dimatikan (menggunakan inhalasi CO 2 ), kemudian dilakukan, pembedahan dan pengamatan organ dalam (Lee et al., 2005). Hasil pengujian menunjukkan bahwa : (1) tidak terdapat mencit yang mati selama pengujian berlangsung, sebagai akibat pemberian protein uji atau protein kontrol; (2) terdapat 1 ekor mencit jantan pada kelompok protein uji yang harus sengaja dimatikan pada hari pertama pengujian akibat adanya kesalahan pada waktu pencekokan; (3) tidak terdapat perbedaan secara statistik dalam hal konsumsi ransum antara kelompok perlakuan dan kontrol; (4) tidak terdapat perbedaan secara statistik dalam hal berat badan dan perubahan berat badan antara kelompok perlakuan dan kontrol; (5) tidak ditemukan adanya abnormalitas klinis yang nyata pada semua kelompok mencit, demikian pula tidak ditemukan adanya pengaruh patologis pemberian protein uji terhadap organ dalam (Bonnette, 2005). Berdasarkan pengujian tersebut disimpulkan bahwa tidak terdapat efek toksik pada mencit akibat pemberian protein Cry1A.105 sampai dosis 2072 mg/kg BB. III.3.1.b Toksisitas Akut Protein Cry2Ab2 Pengujian toksisitas akut telah dilakukan terhadap protein Cry2Ab2 dan telah dilaporkan (Bonnette, 2006). Jumlah protein Cry2Ab2 yang dihasilkan oleh tanaman kedelai PRG event MON sangat sedikit, oleh karena itu untuk keperluan pengujian, protein Cry2Ab2 diproduksi pada bakteri E.coli. Kesetaraan protein Cry2Ab2 yang dihasilkan oleh tanaman kedelai PRG event MON dengan yang dihasilkan oleh bakteri E. coli diuji dengan metode Western Blot, analisis sekuen N-terminal, reaksi glikosilasi dan uji bioaktivitas menggunakan corn earworm. Hasil pengujian tersebut menyimpulkan bahwa protein Cry2Ab2 yang dihasilkan oleh E.coli ekivalen dengan protein Cry2Ab2 yang dihasilkan oleh tanaman kedelai PRG event MON (Wang et al., 2013). Uji toksisitas akut terhadap protein Cry2Ab2 dilakukan menggunakan mencit jantan dan betina. Pemberian bahan uji dilakukan secara oral dengan cara cekokan tunggal. Bahan yang diuji berupa larutan protein Cry2Ab2 dan larutan BSA digunakan sebagai kontrol. Sebagai pelarut protein digunakan larutan dapar 2 mm karbonat-bikarbonat dengan 2 mm glutation tereduksi (ph 10,5), yang juga digunakan sebagai kontrol pelarut (Bonnette, 2006). Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit jantan dan betina, strain CrI: CD-1 (ICR)BR (VAF/Plus ), yang berasal dari Charles River Laboratories, Inc., Stone Ridge, New York. Mencit jantan berumur sekitar 8 minggu, dengan berat badan antara 27,4 31,3 g pada hari ke 0, sedangkan mencit betina berumur sekitar 10 minggu dengan berat badan antara 24,3-26,7 g pada hari ke 0. Mencit mengalami aklimatisasi selama 5 hari, kemudian dipindahkan ke dalam kandang stainless steel secara individual, 8

9 yang ditempatkan dalam ruangan bersuhu o C dan kelembaban relatif %, dengan pencahayaan selama 12 jam terang 12 jam gelap. Ransum yang berupa PMl Certified Rodent Meal # 5002 (PMI Nutrition International), diberikan secara ad libitum selama pengujian berlangsung. Air minum (Municipal tap water treated by reverse osmosis) juga diberikan secara ad libitum (Bonnette, 2006). Sebanyak 30 ekor mencit jantan dan 30 ekor betina dibagi menjadi tiga kelompok (10 ekor jantan dan 10 ekor betina per kelompok). Kelompok 1 diberi cekokan kontrol pelarut; sebanyak 66,6 ml/kg BB (diberikan dua kali, masing-masing sebanyak 33,3 ml, pada hari yang sama). Kelompok 2 diberi cekokan larutan protein BSA, sebagai protein kontrol; sebanyak 66,6 ml/kg BB (setara dengan dosis target sebesar 1750 mg protein BSA/kg BB, atau berdasarkan hasil analisis sebesar 2424 mg protein BSA/kg BB) (Silvanovich et al dalam Bonnette, 2006), yang diberikan dua kali pada hari yang sama, masing-masing sebanyak 33,3 ml. Sedangkan kelompok 3 diberi cekokan larutan protein Cry2Ab2, sebagai protein uji; sebanyak 66,6 ml/kg BB (setara dengan dosis target sebesar 1750 mg protein Cry2Ab2/kg BB, atau berdasarkan hasil analisis sebesar 2198 mg protein Cry2Ab2/kg BB), yang diberikan dua kali pada hari yang sama, masing-masing sebanyak 33,3 ml. Pemberian bahan uji atau kontrol hanya dilakukan sekali, yaitu pada hari ke 1, dengan dua kali cekokan yang berselang sekitar 4 jam, sedangkan observasi berlangsung selama 14 hari. Observasi klinis dilakukan setiap hari, sedangkan penimbangan berat badan dan perhitungan konsumsi ransum dilakukan pada hari ke 0, ke 7 dan hari ke 14. Pada hari terakhir pengujian, semua mencit dimatikan, kemudian dilakukan pembedahan dan pengamatan organ dalam (Bonnette, 2006). Hasil pengujian menunjukkan bahwa tidak terdapat mencit yang mati selama pengujian berlangsung, sebagai akibat pemberian protein uji atau protein kontrol. Terdapat 1 ekor mencit jantan yang harus dikeluarkan dari pengujian pada hari pertama karena adanya kesalahan pada waktu pencekokan, dan digantikan dengan mencit jantan lain. Tidak terdapat perbedaan secara statistik dalam hal konsumsi ransum antara kelompok perlakuan dan kontrol. Tidak terdapat perbedaan secara statistik dalam hal berat badan dan perubahan berat badan antara kelompok perlakuan dan kontrol. Tidak ditemukan adanya abnormalitas klinis yang nyata pada semua kelompok mencit, demikian pula tidak ditemukan adanya pengaruh patologis pemberian protein uji terhadap organ dalam (Bonnette, 2006). Berdasarkan pengujian tersebut disimpulkan bahwa tidak terdapat efek toksik pada mencit akibat pemberian protein Cry2Ab2 sampai dosis 2198 mg/kg BB. IV. Kesimpulan Berdasarkan hasil pengkajian tentang informasi genetik, kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas disimpulkan hal-hal sebagai berikut: 1. Kedelai PRG event MON mengandung satu kopi sisipan T-DNA yang berisi gen cry1a.105 dan cry2ab2 dan tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi PV-GMIR13196; T-DNA dalam kedelai PRG event MON masih stabil sampai lima generasi, serta diwariskan mengikuti hukum Mendel. 9

10 2. Kedelai PRG event MON sepadan secara substansial dengan kedelai non PRG; tidak menunjukkan adanya potensi menimbulkan alergi; dan tidak termasuk ke dalam bahan yang bersifat toksik. 3. TTKH menilai bahwa kedelai PRG event MON yang diajukan adalah aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pangan. 4. Apabila kemudian ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan pangan yang diperoleh hingga saat ini, maka status keamanan pangan kedelai PRG event MON perlu dikaji ulang. 5. Apabila setelah ditetapkan aman pangan, kemudian kedelai PRG event MON terbukti menimbulkan dampak negatif terhadap kesehatan manusia maka pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan, serta menarik kedelai PRG event MON dari peredaran. 6. Kedelai PRG event MON tidak boleh digunakan sebagai pakan ternak sampai memperoleh sertifikat aman pakan. 7. Kedelai PRG event MON tidak boleh dibudidayakan sampai ditetapkan aman lingkungan. V. Daftar Acuan Axelos, M., C. Bardet, T.Liboz, A. L. V. Thai, C. Curie, dan B. Lescure The Gene Family Encoding the Arabidopsis thaliana Translation Elongation Factor EF- 1α : Molecular Cloning, Characterization and Expression. Mol Gen Genet 219 : Laboratoire des Relations Plantes-Micoorganismes, CNRS-INRA. Toulouse, France. Barlow R., R. Wang, dan R. Hernan Assessment of the In Vitro Digestibility of Cry1A.105 Protein in Simulated Gastric and Simulated Intestinal Fluids. Study REG Monsanto Company 800 N. Lindbergh Blvd. St. Louis, MO Bonnette, K.L An Acute Oral Toxicity Study in Mice with Cry1a.105 Protein. Company Report. Study No EUF Performing Laboratory: Charles River Laboratories Preclinical Services 640 North Elizabeth Street Spencerville, OH Monsanto Company 800 N. Lindbergh Blvd. St. Louis, MO Bonnette, K.L An Acute Oral Toxicity Study in Mice with Cry2ab2 Protein. Company Report. Study No. EUF Monsanto Study No. CRO Performing Laboratory: Charles River Laboratories, Preclinical Services, 640 North Elizabeth Street, Spencerville, OH Monsanto Company, 800 N. Lindbergh Blvd., St. Louis, MO Bäumlein H., W. Boerjan, I. Nagy, R. Bassϋner, M.V. Montagu, D. Inze dan U. Wobus A Novel Seed Protein Gene From Vicia faba is Developmentally Regulated in Transgenic Tobacco and Arabidopsis plants. Mo. Gen Genet. 225: Agricultural Biotechnology Center, H02101, Hungary. Chen, B. dan G.M. Mueller, Characterization of the Cry1A.105 Protein Purified from. the Soybean Seed of MON and Comparison of the Physicochemical and Functional Properties of the Plant-Produced and Escherichia coli-produced Cry1A.105 Proteins. Study REG Testing Facility: Monsanto Regulatory, Monsanto Company 800 North Lindbergh Boulevard Saint Louis, Missouri

11 Codex Alimentarius, Food Derived from Modern Biotechnology. Second Edition. Codex Alimentarius. Rome. Elisa Leyva-Guerrero, Kathleen D. Miller, and Roy D. Sorbet, Monsanto Company 800 North Lindbergh Blvd. Saint Louis, Missouri 63167, November 21, 2014, MSL , Monsanto Study No. REG , Covance Study No FARRP Allergen database, version 11. University of Nebraska, Food Allergy Research dan Resource Program, Lincoln, Nebraska. Fling, M. E, J. Kopf, dan C. Richards Nucleotide Sequence of The Transposon Tn7 Gene Encoding an Aminoglycoside-Modifying Enzyme, 3 (9)-O- Nucleotidyltransferase. Wellcome Research Laboratories, Research Triangle Park, NC 27709, USA. Garnaat et al Amended Report for MSL : Molecular Characterization of Insect Protected Soybean (MON 87751). Monsanto Company. Study No. REG Performing Laboratory : Monsanto Company, The Genome Analysus Center Lab CC Chesterfiled Parkway West, Chesterfield, Missouri Gu, X dan G. Mueller. 2013a. Effect of Heat Treatment on the Functional Activity of Escherichia coli (E.coli)- Produced MON Cry1A.105 Protein. Study REG Monsanto Company. 800 N. Lindbergh Blvd. St. Louis, MO Gu, X dan G. Mueller. 2013b. Effect of Heat Treatment on the Functional Activity of Escherichia coli (E.coli)- Produced MON Cry2Ab2 Protein. Study REG Monsanto Company. 800 N. Lindbergh Blvd. St. Louis, MO International Life Sciences Institute (ILSI) Crop Composition Database. Versi Diakses 14 Agustus Kang dan Silvanovich. 2013a. Updated Bioinformatics Evaluation of the Cry1A.105 Protein in MON Utilizing the AD_2013, TOX_2013 and PRT_2013 Databases. Study REG Monsanto Company 800 N. Lindbergh Blvd. St. Louis, MO Kang dan Silvanovich. 2013b. Updated Bioinformatics Evaluation of the Cry2Ab2 Protein Utilizing the AD_2013, TOX_2013 and PRT_2013 Databases. Study REG Monsanto Company 800 N. Lindbergh Blvd. St. Louis, MO Lee T. C., S. L. Levine, dan E. A. Rice Formulation and Confirmation of Dose Solutions for an Acute Oral Toxicity Study in Mice with E.coli-Produced Cry1A.105 Protein. Company Report. Study No. EUF Performing Laboratory : Monsanto Company. 800 North Lindbergh Boulevard, Saint Louis, Missouri Leyva-Guerrero, E., K. D. Miller, dan R. D. Sorbet Amended Report for MSL : Compositional Analyses of Soybean Forage and Seed Harvested from MON and the Control Grown in the United States During the 2012 Season. Monsanto Study No. REG , Covance Study No

12 Mozaffar, S Amended Report for MSL : Assessment of Cry1A.105 and Cry2Ab2 Protein Levels in Soybean Tissues Collected from MON Produced in U.S. Field Trials during Study REG Monsanto Company 800 N. Lindbergh Blvd. St. Louis, MO Thomas, K., G. Bannon, S. Hefle, C. Herouet, M. Holsapple, G. Ladies, S. MacIntosh, dan L. Privalle Forum In Silico Methods for Evaluating Human Allergenicity To Novel Proteins : International Bioinformatics Workshop Meeting Report, February Toxicologival Sciences 88 (2), Wang R., R. Hernan, dan J. M. Fridley Amended Report for MSL : Characterization of the Cry2Ab2 Protein Purified from the Soybean Seed of MON and Comparison of the Physicochemical and Functional Properties of the Plant-Produced and Escherichia coli-produced Cry2Ab2 Proteins. Company Report. Study REG Testing Facility: Monsanto Regulatory, Monsanto Company, 800 North Lindbergh Boulevard, Saint Louis, Missouri Wang dan Hernan, Assesment of the In Vitro Digestibility of Cry2Ab2 Protein in Simulated Gastric and Simulated Intestinal Fluids. Company Report. Study REG Testing Facility: Monsanto Regulatory, Monsanto Company, 800 North Lindbergh Boulevard, Saint Louis, Missouri Yong-Qian A., J. M. Mc Dowell, S. Huang, E. C. McKinney, S. Chambliss dan R. B. Meagher Strong, Constitutive Expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 Actin Subclass in Vegetative Tissues. The Plant Journal 10(1), Department of Genetics University of Georgia Athens, USA. 12