IDENTIFIKASI DAN ANALISIS FILOGENETIK LALAT BUAH Bactrocera bryoniae (Tryon) (Diptera:Tephritidae) DI PULAU BALI MENGGUNAKAN GEN ITS1

Transkripsi

1 IDENTIFIKASI DAN ANALISIS FILOGENETIK LALAT BUAH Bactrocera bryoniae (Tryon) (Diptera:Tephritidae) DI PULAU BALI MENGGUNAKAN GEN ITS1 Putu Shinta Devi, I Putu Sudiarta *), dan Gusti Ngurah Alit Susanta Wirya Program Magister Bioteknologi Pertanian, Program Pascasarjana Universitas Udayana *) Corresponding author at : Jl. PB. Sudirman Denpasar Bali Indonesia putu.ueda@yahoo.com Abstract Some species of Bactrocera are the important pest on fruits and vegetables. B. bryoniae, one of exotic species have been found in Bali. this species is potentially causing economic losses. accurate identification Information required to determine the appropriate pest control. The objective of the research are (1) Identify B. bryoniae based on the morphological characteristics (2) Identify B. bryoniae based on molecular characteristics using ITS1 gene (3) Knowing the genetic diversity of B. bryoniae that found in Bali island based gene ITS1. (4) to analyze the phylogenetic of B. bryoniae that found in Bali based on ITS1 gene. Based on their morphological characteristics, the new Bactrocera species found in Bali is Bactrocera bryoniae. molecular Identification of B. bryoniae were successfully performed with ITS1 gene, B. bryoniae species that found in Bali could be distinguished from other Bactrocera species based on ITS1 gene, Phylogenetic analysis of B. bryoniae based on ITS1 genes showed that B. bryoniae from Bali were in different groups with other Bactrocera species. The level of homology and phylogeny tree construction were show that B. bryoniae Bali could be distinguished from other Bactrocera species based on ITS1 Gene. Keywords: Fruitfly, Bactrocera Bryoniae, Internal Transcribed Spacer1(ITS1), identification, Phylogenetic. 1. Pendahuluan Ancaman serangan organisme penganggu tumbuhan semakin bertambah terhadap pertumbuhan ekonomi dan kesehatan manusia serta keamanan lingkungan. Famili Tephritidae adalah salah satu organisme pengganggu tumbuhan penting yang telah mengakibatkan kerugian secara ekonomi pada budidaya pertanian (Li et al., 2013). Lalat buah genus Bactrocera termasuk dalam famili Tephritidae yang merupakan famili dengan jumlah terbesar dari ordo Diptera. Genus Bactrocera adalah kelompok lalat buah yang terdiri lebih dari 450 spesies (Drew dan Hancock, 2000). Beberapa spesies Bactrocera adalah hama penting pada buah dan sayuran (Allwood et al., 1999). Setidaknya 28 Subgenera 35

2 Bactrocera telah dinyatakan sebagai hama penting dan dibagi menjadi 4 Group yaitu: Bactrocera, Melanodacus, Queenslandacus, dan Zeudacus (Drew,1989). Karakter morfologi dapat digunakan sebagai dasar dalam melakukan identifikasi dan ini merupakan cara yang paling sederhana serta mudah dilakukan, karakter morfologi pada lalat buah yang digunakan untuk melakukan identifikasi meliputi bagian caput, torak, karakter scutellum, karakter sayap dan karakter abdomen (Suputa et al., 2006). Adanya perbedaan dari beberapa hasil identifikasi lalat buah secara morfologi atau konvensional ini menunjukkan adanya kelemahan pada metode identifikasi konvensional tersebut. Metode konvensional yang berdasarkan ciri morfologi kurang akurat akibat adanya pengaruh perubahan-perubahan lingkungan. Karakter-karakter morfologi sering tidak menggambarkan hubungan genetik akibat adanya interaksi lingkungan dan sejumlah kontrol genetik yang tidak diketahui, sehingga perlu dilakukan karakterisasi molekuler untuk mendapatkan hasil yang akurat dalam mengkarakterisasi perbedaan spesies (McPheron dan Steck, 1996; Smith et al., 2003; Siwi, 2004). Identifikasi molekuler digunakan untuk mendukung dan meningkatkan akurasi identifikasi morfologi, Karakter DNA diketahui relatif lebih konsisten dibandingkan karakter morfologi (Hidayat, 2005). Identifikasi molekuler dapat dilakukan dengan teknik Polymerase chain reaction (PCR) dengan target gen Internal Transcribed Spacer dari Ribosomal RNA operon atau yang dikenal dengan ITS1. Berdasarkan pemantauan tahun Balai Karantina Pertanian Kelas I Denpasar ditemukan jenis Bactrocera eksotik di Pulau Bali yaitu Bactrocera bryoniae, spesies ini adalah salah satu spesies Bactrocera yang perlu diwaspadai, B. bryoniae ditemukan di Kabupaten Buleleng pada pertanaman cabe, serangan lalat buah ini dikhawatirkan dapat menimbulkan kerusakan dan kerugian ekonomi. Informasi identifikasi dan filogenetik tentang B. bryoniae sangat diperlukan guna pengambilan kebijakan manajemen pengendalian dan tindakan karantina yang akan dilakukan untuk mencegah tersebarnya B. bryoniae ke seluruh wilayah Republik Indonesia Sehingga identifikasi molekuler dan filogenetik lalat buah Bactrocera bryoniae perlu dipelajari lebih lanjut. 2. Bahan dan Metode 2.1. Pemasangan perangkap Metode pemasangan perangkap mengacu pada Pedoman surveilensi organisme pengganggu tumbuhan (OPT) atau OPT karantina (OPTK) dari Badan Karantina Pertanian. Pemasangan perangkap dilakukan dengan menggunakan perangkap (Trapping) tipe Steiner (Steiner Trap) dengan zat pemikat (attractant) Cue lure. Diteteskan atraktan Cuelure 2 ml dan insektisida 2 ml pada kapas dalam setiap perangkap dengan menggunakan jarum suntik. Pemasangan perangkap dilakukan pada pertanaman cabai yang merupakan inang dari lalat buah B. bryoniae di Desa Sumberklampok Kecamatan Gerokgak Kabupaten Buleleng, 36

3 penentuan lokasi pemasangan perangkap berdasarkan data pemantauan BKP Kelas I Denpasar bahwa sejak tahun 2013 hingga 2015 B. bryoniae hanya ditemukan di lokasi tersebut. Perangkap digantungkan pada cabang pohon yang ternaungi dengan ketinggian sekitar 2 m dari permukaan tanah. Pemasangan perangkap dilakukan pada saat tanaman cabai mulai berbuah, diulang sebanyak 3 kali dengan perangkap yang digunakan sebanyak 3 buah perangkap disetiap pemasangan dengan jarak pemasangan masing-masing 100 m, pemasangan dilakukan selama satu bulan dengan interval pengumpulan lalat buah yang terperangkap seminggu sekali. Penambahan atraktan dan pestisida dilakukan pengambilan lalat buah. Pengumpulan lalat buah dari perangkap dilakukan seminggu setelah waktu pemasangan. Lalat buah yang terkumpul dibawa ke laboratorium, dikeringanginkan dan dimasukkan dalam botol vial dengan tambahan silicagel didalamnya, selanjutnya lalat buah hasil perangkap ini digunakan untuk identifikasi secara morfologi dan molekuler Identifikasi secara morfologi Pengamatan untuk identifikasi morfologi dilihat berdasarkan ciri morfologinya yang mencakup karakter morfologi bagian tubuh lalat buah yang penting dalam penelusuran kunci identifikasi, di antaranya adalah: bentuk spot pada muka, warna mesonotum, ada tidaknya pita kuning di kedua sisi lateral dan tengah toraks, warna, pola dan jumlah rambut pada skutelum, pola pada pembuluh sayap (costa band), bentuk dan pola abdomen, serta warna dan spot pada tungkai (Drew, 1989; Lawson et al., 2003). Sebagai pustaka acuan digunakan buku yang berjudul Fruit Flies of Indonesia : Their Identification, Pest Status and Pest Menegement yang dikeluarkan oleh Griffith University, Brisbane, Australia dan Kementerian Pertanian RI tahun 2008, yang didalamnya berisi keterangan keterangan dan panduan untuk mengidentifikasi beserta semua nama jenis spesies lalat buah yang terdapat di Indonesia. Pengamatan dan identifikasi lalat buah dilakukan di bawah mikroskop stereo dan mikroskop digital. Spesimen yang telah diidentifikasi selanjutnya disimpan dalam freezer -80 o C untuk digunakan dalam identifikasi molekuler Identifikasi molekuler Identifikasi molekuler dimulai dengan melakukan ekstraksi DNA dari sampel B. bryoniae dan dilanjutkan dengan metode PCR, primer yang digunakan berdasarkan gen ITS1. Produk PCR kemudian dilanjutkan dengan elektroforesis dan sekuensing untuk mengetahui urutan basa nukleotidanya. Ekstraksi DNA dari sampel lalat buah menggunakan Qiagen DNeasy (Qiagen, Hilden, Germany) Blood and Tissue kits. Seekor lalat buah yang telah disimpan dalam freezer -80 o C digerus dengan menggunakan mortar dan pestel. 37

4 Ditambahkan 180 µl Buffer ATL dan dimasukkan kedalam Eppendof tube 1.5 ml. Ditambahkan 20 µl proteinase K, divortex untuk mencampur, kemudian diinkubasi pada suhu 56 o C overnight sampai lalat buah benar-benar lisis. Divortex kembali selama 15 detik dan ditambahkan 200 µl buffer AL kemudian divortex, ditambahkan 200 µl ethanol (96 100%) dan divortex kembali. Campuran tersebut dipindahkan dengan menggunakan mikropipet ke Dneasy Mini Spin column yang sudah dipasang pada tube 2 ml. Disentrifuges 8000 rpm selama 1 menit kemudian buang cairan yang tertampung dalam tube tersebut. Pindahkan DNeasy mini spin column ke tube 2 ml yang baru kemudian ditambahkan 500 µl buffer AW1 dan disentrifuges dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Buang cairan yang tertampung dalam tube 2 ml. Dneasy mini spin column ditempatkan di tube 2 ml yang baru kemudian ditambahkan buffer AW2 sebanyak 500 µl, disetrifuges selama 3 menit dengan kecepatan rpm untuk mengeringkan membran DNeasy. Buang cairan yang tertampung dan tube. Tempatkan Dneasy mini spin column pada tube 1.5 ml atau 2 ml masukkan buffer AE di Dneasy membran, inkubasi pada suhu ruang selama 1 menit dan kemudian disentrifuge selama 1 menit dengan kecepatan 8000 rpm. PCR dengan gen ITS1 Hasil ekstraksi DNA kemudian diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer yang didesain dari Gen ITS1 yaitu baits1f 5 GGA AGG ATC ATT ATT GTG TTC C 3 dan baits1r 5 ATG AGC CGA GTG ATC CAC C 3 (Plant Health Australia, 2011). PCR dilakukan dalam volume 25 μl yang terdiri dari 1 butir PCR bead, 1μl primer forward dan 1μl primer reverse, DNA template 2 μl dan Nuclease free water 21 μl dilakukan pada Thermal cycler. PCR dengan menggunakan primer ITS dilakukan pada kondisi predenaturasi pada 94 ºC selama 2 menit ; dilanjutkan dengan 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 94 ºC selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada 60 ºC selama 1 menit dan pemanjangan (extension) pada 72 ºC selama 1 menit; dan siklus terakhir ditambahkan 5 menit pada 72 ºC (Plant Health Australia, 2011). Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan Gel Agarose. Pembuatan 1% gel agarose dalam volume 80 ml 1x buffer TAE, maka jumlah agarose yang akan ditimbang yaitu: 1 gram/100ml x 80ml= 0,8 gram. Agarose 0,8 gram ditempatkan ke dalam labu erlenmeyer dan isi dengan larutan 1X Buffer TAE sampai volume 80ml, kemudian dikocok sampai merata. Setelah itu dianaskan dalam microwave sampai mendidih sampai larutan menjadi jernih. Kemudian agarose didinginkan kira-kira sampai 60 o C dan tambahkan 4 µl biotine gel red dan campur hingga merata, setelah itu larutan dituang ke dalam tray dan pasang wellforming combs, ditunggu kurang lebih 30 menit atau sampai gel mengeras. Kemudian well-forming combs dilepas secara perlahan-lahan dan gel agarose siap digunakan untuk elektroforesis. Produk PCR dengan primer ITS1 dielektreforesis dengan Gel agarose 1%, Elektroforesis dilakukan selama 120 menit pada 80 Volt, 38

5 Produk PCR yang digunakan dalam elektroforesis adalah sebanyak 2 μl ditambah 2 μl loading dye. DNA yang telah dielektroforesis kemudian divisualisasi dengan UV transluminator. Produk hasil PCR yang berhasil teramplifikasi saat elektroforesis dikirim ke Laboratorium FirstBase Malaysia untuk disekuensing, urutan basa nukleotida hasil sekuensing ini akan digunakan dalam analisis molekuler selanjutnya. Analisis sekuen hasil sekuen B. bryoniae berdasarkan Gen ITS1 digunakan untuk mencari sekuen gen B. bryoniae yang telah dipublikasikan di GeneBank dengan Program Basic Local Alignment Tool (BLAST) (NCBI 2014) yang dapat diakses pada situs the European Bioinformatic Institute (EBI) ( Sekuen-sekuen homolog tersebut selanjutnya digunakan untuk membuat alignment kemudian digunakan untuk mengetahui tingkat similaritas atau kesejajaran sekuen dengan menggunakan program ClustalW. Analisis filogenetik Penentuan jarak genetik dan analisis filogeni dilakukan dengan rekonstruksi pohon filogeni dengan menggunakan software Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 6.06) untuk mengetahui kekerabatan antara sekuen Gen B.bryoniae yang berasal dari Pulau Bali dengan spesies yang berasal dari negara yang berbeda. 3. Hasil dan Pembahasan 3.1 Karakteristik Morfologi B. bryoniae Spesies Bactrocera baru yang ditemukan di Pulau Bali diidentifikasi berdasarkan buku yang berjudul Fruit Flies of Indonesia : Their Identificatoin, Pest Status and Pest Menegement yang dikeluarkan oleh Griffith University, Brisbane, Australia dan Kementerian Pertanian RI. Pengamatan morfologi meliputi warna tubuh, bentuk spot pada wajah, warna mesonotum, scutum, dan scutelum, ada tidaknya pita kuning di kedua sisi lateral dan tengah toraks, warna, pola dan jumlah rambut pada skutelum, pola pada pembuluh sayap (costa band), bentuk dan pola abdomen, serta warna dan spot pada tungkai. Ciri morfologi spesifik yang sangat berbeda dengan spesies Bactrocera lainnya dan dapat digunakan untuk identifikasi B. bryoniae yaitu bentuk spot wajah, warna Postpronotal lobe, skutum dan scutellum, bentuk mesopleural stripe, costal band dan microtrichia pada sayap. Hasil pengamatan morfologi spesies Bactrocera baru yang ditemukan di Pulau Bali adalah sebagai berikut (Gambar 1). Seluruh karakter morfologi spesies Bactrocera baru yang ditemukan di Pulau Bali tersebut sangat mirip dengan morfologi B. bryoniae sesuai dengan acuan identifikasi yang digunakan. 39

6 a b c d e f g Gambar 1. Karakteristik Morfologi B. bryoniae.(a). Spesies utuh B. bryoniae, (b) caput: spot pada wajah berbentuk bulat tak beraturan, (c) Sayap dengan costal band yang sangat tebal confluent atau overlapping di sepanjang vein R4+5, (d) Microtrichia hanya menutupi setengah bagian sudut second costal cell (e) skutum berwarna hitam, Scutellum berwarna kuning, (f) mesopleural stripe lebih lebar dari notopleuron, (g). terdapat lateral postsutural vittae, namun tidak terdapat medial postsutural vittae (h). Abdomen terga III-V coklat orange dengan satu medial dan 2 lateral longitudinal band yang gelap sepanjang bagian anterior dari terga ke III hingga menutupi bagian lateral sampai ke terga V h 40

7 3.2 Karakteristik Molekuler B. bryoniae Spesies B.bryoniae hasil identifikasi morfologi selanjutnya didentifikasi secara molekuler berdasarkan gen ITS dan MT-CO1. Identifikasi molekuler B.bryoniae dalam penelitian ini menggunakan dua pasang primer yang berbeda,yaitu primer Internal Transcribed Spacer region (ITS1). Analisis gen ITS telah digunakan dalam protokol nasional Australia untuk mengidentifikasi lalat buah selain menggunakan metode identifikasi morfologi (Plant Health Australia, 2011) dapat mengamplifikasi fragmen DNA spesies B. bryoniae dengan ukuran fragmen bp. Pita DNA dengan ukuran yang sama teramplifikasi dari sampel BbryITS. Hasil pencarian sekuen yang homolog dalam BLAST, menunjukkan gen B. bryoniae asal Bali mempunyai similaritas dengan daerah ITS dari spesies Bactrocera lain. Hal ini menunjukkan bahwa PCR berhasil mengamplifikasi daerah ITS, namun tidak ditemukan sekuen spesies B. bryoniae yang memiliki similaritas dengan urutan basa dari B. bryoniae dari Bali berdasarkan gen ITS1. M BbryITS BbryITS 1000bp 820 bp Gambar 2. Hasil amplifikasi DNA B. bryoniae Bali berdasarkan Gen ITS dengan metode PCR menggunakan pasangan primer BaITS1f dan BaITS1r. Sampel BbryITS teramplifikasi dengan ukuran 820 bp. M : marker 100 bp. Daerah ITS rdna yang baik untuk diagnostik identifikasi spesies dan analisis filogenetik adalah daerah ITS-1 dan ITS-2 yang bersama-sama mengapit daerah 5.8S rdna, Gen ITS1 mampu digunakan untuk mengidentifikasi lebih dari 30 spesies lalat buah (McKenzie et al., 2004), namun tidak ditemukan data sekuen spesies B. bryoniae berdasarkan gen ITS1 pada Genbank, hal tersebut 41

8 menunjukkan bahwa Gen ITS1 belum pernah digunakan untuk identifikasi molekuler pada spesies B. bryoniae. Terdapat beberapa spesies Bactrocera lain dalam Genbank yang menunjukan similaritas dengan B. bryoniae Bali berdasarkan gen ITS1. Beberapa sekuen spesies yang similar ini selanjutnya digunakan dalam pensejajaran (alignment) dengan menggunakan program clustalw. Tabel 1. Tingkat homologi (%) B. bryoniae dengan spesies Bactrocera negara lain yang terdapat di GenBank berdasarkan gen ITS1 Sekuen BbryITS1Bali ID AF B. endiandrae Australia 91,6 ID AF B. tryoni 90,0 92,8 ID AF B. carambolae Malaysia 89,6 91,7 92,3 ID AF B. fuscitibia Indonesia 90,0 92,8 90,3 91,0 ID KM B. invadens 77,8 79,7 79,1 81,3 80,0 ID ALD83767 Ceratitis capitata 38,1 38,6 38,4 37,4 37,4 34,0 ID Keterangan: 1. B. bryoniae yang ditemukan di Bali, 2. B. endiandrae dari Australia, 3. B. tryoni dari Australia, 4. B. carambolae dari Malaysia, 5. B. fuscitibia dari Indonesia, 6. B.invaden, 7. Ceratitis capitata sebagai outgroup Hasil pensejajaran sekuen gen ITS menggunakan program Clustal W menunjukkan tingkat kekerabatan antara 34%-91%. Semakin tinggi nilai presentase maka kekerabatnnya semakin dekat. tingkat homologi sekuen gen ITS1 spesies B. bryoniae Bali tertinggi adalah dengan B. endiandrae yaitu hanya 91,6%, hal ini membuktikan bahwa B. bryoniae Bali berbeda dengan kelima spesies Bactrocera yang lain secara genetik. Hasil konstruksi pohon filogeni juga mendukung hal tersebut (Gambar 5.2), Analisis filogenetik B. bryoniae berdasarnya gen ITS1 menunjukkan bahwa B.bryoniae berada pada kelompok tersendiri berbeda kelompok dengan spesies B. endiandrae Australia, B. tryoni, B. carambolae, B. fuscitibia, dan B. invadens. B.bryoniae berada pada kelompok yang berbeda dengan lima spesies Bactrocera tersebut. Tingkat homologi dan konstruksi pohon filogeni tersebut menunjukkan bahwa B. bryoniae Bali dapat dibedakan dengan spesies Bactrocera lain berdasarkan Gen ITS

9 78 B. carambolae Malaysia B. fuscitibia Indonesia B. endiandra Australia B. tryoni B. invadens BbryBaliITS Ceratitis capitata Gambar 3. Pohon Filogeni B. bryoniae asal Bali dibandingkan dengan beberapa Bactrocera yang berasal dari negara lain berdasarkan gen ITS1. Nomor aksesi B. endiandra Australia AF297564, B. tryoni AF121159, B. carambolae Malaysia AF297560, B. fuscitibia Indonesia AF297565, B. invadens KM dan Ceratitis capitata ALD83767 sebagai pembanding luar spesies. Pohon filogeni dikonstruksi menggunakan perangkat MEGA versi 6.06 (Algoritma UPGMA dengan 1000 bootstrap method Replications). 4. Simpulan Berdasarkan karakteristik morfologinya, spesies Bactrocera baru yang ditemukan di Bali adalah Bactrocera bryoniae. Identifikasi molekuler B. bryoniae berhasil dilakukan dengan gen MT-CO1 dan ITS1. Tidak ditemukan data sekuen B. bryoniae berdasarkan Gen ITS1 di basis data Genbank, spesies B. bryoniae yang ditemukan di Bali dapat dibedakan dengan spesies Bactrocera lain berdasarkan gen ITS1, Analisis filogenetik B. bryoniae berdasarnya gen ITS1 menunjukkan bahwa B.bryoniae asal Bali berada pada kelompok tersendiri berbeda kelompok dengan spesies Bactrocera yang lain. Tingkat homologi dan konstruksi pohon filogeni tersebut menunjukkan bahwa B. bryoniae Bali dapat dibedakan dengan spesies Bactrocera lain berdasarkan Gen ITS1. Daftar Pustaka Allwood AJ, Chinajariyawong A, Kritsaneepaiboon S, Drew R, Hamacek EL, Hancock DL, Hengsawad C, Jipanin JC, Jirasurat M, Kong Krong C, Leong CTS, Vijaysegaran S Host plan records for fruit flies (Diptera: Tephritidae) in Southeast Asia. Singapore: Raffles Bulletin Zoology Supplement. 7:1 92. Drew RA & Hancock DL Phylogeny of the tribe Dacini (Dacinae) based on morphological, distributional, and biological data. In: Aluja M, Norrbom AL, editors. Fruit Flies (Tephritidae): Phylogeny and Evolution of Behavior, Florida: CRC Press. p

10 Drew RA The tropical fruit flies (Diptera: Tephritidae: Dacinae) of the Australasian and Oceanian regions. Queensland: Memorial Queensland Museum.26: Hidayat, T., Diah Kusumawaty, Kusdianti, Dian Din Yati, Astry Agusthina Muchtar, dan Dina Mariana Analisis filogenetik molekuler pada Phyllanthus niruri (Euphorbiaceae) menggunakan urutan basa DNA daerah Internal Transcribed Spacer (ITS). Jurusan Pendidikan Biologi, Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pendidikan Indonesia, Bandung 13(1): Li Q, Di-Yan Li, Mo-Mo Li, Hua Ye, Wei Shi, Long Zhang and Yan-Qing Duan A Phylogenetic Analysis Within Tephritidae of Diptera Based on the Concatenated 13 Mitochondrial Protein Coding Genes of mt Genomes. Asian Journal of Animal and Veterinary Advances 8 (3) : Plant Health Australia The Australian Handbook for the Identification of Fruit Flies. Version 1.0. Plant Health Australia. Canberra, ACT. Suputa, Cahyanti, Kustaryati A, Railan M, Issusilaningtyas dan Taufiq A Pedoman Identifikasi Lalat Buah (Diptera: Tephritidae). Yogyakarta : UGM McPheron BA & Steck GJ, Overview of research on the behavior of fruit flies. In Fruit Fly Pests: A World Assessment of Their Biology and Management. Florida: St Lucie Press. Siwi SS Jenis-jenis lalat buah penting di Indonesia dan macam tanaman inangnya. Bogor: Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian. Smith, PT., Srini Kambhampati & Karen A. Amstrong Phylogenetic relationships among Bactrocera spesies (Diptera : Tephritidae) Inferred from mitochondrial DNA sequences. Manhattan: Molecular Phylogenetics and Evolution :