BAB I. PENDAHULUAN. A. Latar Belakang. jaringan paru yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis complex

Transkripsi

1 BAB I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit infeksi yang umumnya mengenai jaringan paru yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC). Penyakit ini dapat mengenai semua umur, klinis bervariasi dari tanpa gejala sama sekali hingga manifestasi berat. M. tuberculosis merupakan salah satu mikroorganisme yang paling berhasil terhadap manusia ditinjau dari dosis infeksitas (1-10 organisme per aerosol), kejadian (menginfeksi 1/3 penduduk dunia), lama (infeksi jangka panjang), kematian (salah satu penyebab kematian terbanyak akibat infeksi), dan mekanisme patologis yang memungkinkan penyebaran per aerosol (Murray et al., 2014) Hingga saat ini ditemukan penurunan kasus TB rata-rata 1% setiap tahunnya, namun demikian penderita TB masih cukup tinggi, yaitu berjumlah 17.1 juta orang. Kasus baru ditemukan sekitar 8.8 juta kasus setiap tahunnya dengan angka kematian sekitar 1.4 juta orang. Indonesia merupakan negara dengan kasus TB terbesar keempat di dunia, dengan kasus baru dan kematian tiap tahunnya. Insiden kasus Basil Tahan Asam (BTA) positif diperkirakan 110 per penduduk. (WHO, 2014; Kemenkes, 2011). 1

2 Pada anak, insiden TB bervariasi antara satu negara dengan negara lainnya dengan kasus tertinggi di temukan di negara kawasan Sub Sahara, Asia Selatan dan Asia Tenggara. Kejadian TB pada anak berkisar 10 15% dari total kasus, walaupun pada dasarnya angka ini masih sangat kasar mengingat metoda diagnostik TB anak yang sangat sulit, karena seringkali TB anak tidak menunjukkan gambaran klinis yang jelas. Penelitian di Skotlandia menunjukkan hanya 60% anak yang diobati dengan tuberkulosis yang memperlihatkan gejala klinis. Angka kematian akibat TB berkisar antara 10 20% yang terjadi pada umur kurang dari 15 tahun. (WHO, 2014; Brenan, 2005). Permasalahan dalam penanganan TB adalah karakteristik M. tuberculosis yang sangat unik, seperti pertumbuhan bakteri yang lambat, strain yang sangat bervariasi, pengobatan yang membutuhkan kesabaran pasien karena diperlukan waktu yang lama, adanya strain yang telah mengalami resistensi (Multi Drug resistent of Tuberculosis, MDR-TB), perkembangan HIV/AIDS, adanya infeksi laten yang mencapai 40-50% kasus infeksi, adanya variasi strain, efektivitas vaksin Tuberkulosis yang makin menurun serta metoda diagnosis yang belum optimal (WHO, 2014; Yuen et al., 2014) Analisis terhadap strain M. tuberculosis memperlihatkan adanya beberapa strain utama, yaitu East African-Indian (EAI), Beijing, Haarlem, Latin American and Mediterranean (LAM), Central Asian (CAS), subspesies Eropa dengan jumlah kopi IS6110 yang sedikit (sub famili X) dan sub spesies yang belum terdefinisi dengan baik (sub famili T). (Filliol et al., 2003; Wirth et al., 2008). Di Indonesia, M. tuberculosis strain Beijing merupakan kelompok terbesar dibanding strain lain, 2

3 berkisar antara % (Parwati et al., 2008; Lisdawati et al., 2010; Muchtar et al., 2011). M. tuberculosis strain Beijing dianggap lebih virulen dibanding non Beijing dan mempunyai kecenderungan resisten terhadap Obat Anti Tuberkulosis (OAT) (Parwati et al., 2010). Pemahaman terhadap variasi genomik M. tuberculosis sangat penting diketahui sebab variasi akan memberikan pengaruh terhadap virulensi, patogenesitas, penghindaran sistem imun dan imunogenesitas. Namun demikian, sejumlah penelitian memperlihatkan variasi molekuler diantara isolat MTBC sangat bervariatif, berbeda antara satu gen dengan gen lainnya (Brosch et al., 2002; Chopin et al., 2013). Pada saat ini, salah satu fokus kajian genomik dan proteomik M. tuberculosis adalah terhadap kelompok protein spesifik yang disandi oleh multigen Prolin - Glutamat/ Prolin-Prolin Glutamat (PE/PPE) yang merupakan kelompok protein paling banyak disekresikan ke dalam sitoplasma. Ciri khas dari protein kelompok PE/PPE adalah adanya 110 asam amino yang conserved pada N terminal yang didominasi oleh Prolin (P) dan Glutamat (E). Asam amino pada C terminal bervariasi dan total asam amino setiap gen adalah (Akhter et al., 2012). Kelompok gen ini terdiri dari 104 gen atau mencakup 4% dari total gen M. tuberculosis dan terdiri dari 2 subgrup, sub grup PE dan PPE. Subgrup PPE berjumlah 29 protein, sub grup PE dibagi atas 2 kelompok, yaitu PE, 8 protein dengan sekuens C terminal dan 67 protein kelompok Polymorphic GC-rich repetitive sequences (PE-PGRS). Kelompok PGRS umumnya mempunyai 3

4 perulangan Alanin dan Glisin yang unik, membentuk pola Gly-Gly-Ala-Gly-Gly (Brennan & Delogu, 2002; Akhter et al., 2012) Hasil penelitian memperlihatkan protein kelompok PE-PGRS belum banyak diketahui fungsinya, namun data yang ada menunjukkan protein ini disekresikan dalam jumlah besar ke intra sel, salah satu komponen penyusun dinding sel bakteri, berperan dalam pertahanan dan replikasi (Chaturvedi et al., 2010; Casciofero et al., 2011) Variasi pada gen yang menyandi protein PE-PGRS sangat bervariasi tergantung pada jenis proteinnya. Variasi molekular pada PE-PGRS 33 adalah 1.67% sedangkan variasi PE-PGRS 16 dan 26 adalah 0.5 dan 15% (Talarico et al., 2005; Talarico et al., 2008). Karakteristik molekuler ini menyebabkan variasi imunogenesitas dan fungsi dari protein PE-PGRS berbeda satu sama lain. Beberapa PE-PGRS disekresikan ke dalam lingkungan sedangkan yang lain merupakan komponen dinding sel (Dheenadhayalan et al., 2006; Chopin et al., 2013). Fungsi dari protein kelompok PE-PGRS belum banyak diketahui, diduga berkaitan dengan pembentukan dinding sel, induser sel T dan B, variasi antigenik, modifikasi atau penghindaran dari sistem imun. PE-PGRS 33 terletak pada membran sel dan sebagian besar pada salah satu ujung sel bakteri sehingga protein ini berhubungan langsung dengan dunia luar. Overekspresi protein ini akan menyebabkan pemanjangan sel bakteri dibanding normal. Sebaliknya, M. tuberculosis dengan delesi PE-PGRS33 (mutan Rv1818c) tidak menunjukan 4

5 perbedaan ukuran sel dibanding normal. (Singh et al., 2001; Banu et al., 2002; Delogu et al., 2004). Persentase residu glisin yang tinggi (40%) memperlihatkan struktur hidrofobik mirip dengan ditemukan pada laba-laba dan tanaman. Pola sekuens kedua protein sama dengan motif perulangan Gly-Ala. Protein dengan struktur seperti itu merupakan salah satu komponen penyusun dinding sel. Penelitian yang sama juga memperlihatkan motif PE tidak berperan dalam morfologi koloni M. tuberculosis. Domain PE berperan dalam lokalisasi bakteri pada subselular sedangkan domain PGRS berperan pada bentuk dan morfologi koloni. Berdasarkan kondisi ini ekspresi PE diduga berperan dalam daya tahan bakteri di dalam host (Banu et al., 2002; Cole et al., 1999; Delogu et al., 2004). Analisis imunogenesitas terhadap protein kelompok PE-PGRS memperlihatkan hasil yang berbeda. PE-PGRS 33 dan 22 berperan dalam interaksi dengan makrofag namun tidak berkaitan dengan daya tahan bakteri dalam lingkungan intraselular. Interaksi ini berkaitan dengan ekspresi protein pada permukaan bakteri. Hal ini menjadi salah satu dasar interaksi protein PE- PGRS dengan host yang berperan dalam virulensi bakteri (Espitia et al., 1999; Delogu et al., 2002). M. tuberculosis akan mengekspresikan sejumlah gen yang berperan untuk persistensi pada fase infeksi kronis atau laten. Fenomena ini didukung dengan penelitian yang memperlihatkan ekspresi macrophage activated gene 24 (mag24) pada infeksi laten di dalam makrofag dan jaringan granuloma. Hilangnya mag24 menyebabkan bakteri tidak dapat menetap di dalam makrofag dan jaringan 5

6 granulasi. Mag24 merupakan gen yang homolog dengan Rv3812 (PE-PGRS 62) dan Rv1651c (PE-PGRS 30). (Sassetti & Rubin, 2003; Ramakrishnan et al., 2000) Hasil penelitian lain juga memperlihatkan bahwa Rv1651c mengalami overekspresi pada infeksi fase kronik (Delogu et al., 2006). Analisis microarray terhadap protein kelompok PE-PGRS dari M. tuberculosis di dalam makrofag pada berbagai kondisi, seperti starvasi dan stres oksidatif memperlihatkan variasi ekspresi gen. Data ini memperlihatkan adanya variasi ekspresi protein PE-PGRS yang dikendalikan oleh sistem regulator yang berbeda. Gen Rv2741 yang menyandi protein PE-PGRS 47 mengalami overekspresi pada lingkungan kaya zat besi, sebaliknya Rv 0279c (PE-PGRS4) mengalami depresi. Hal ini memperlihatkan bahwa PE-PGRS berperan dalam virulensi bakteri yang berkaitan dengan pemasukan besi (Betts et al., 2002; Fisher et al., 2002; Rodriguez et al., 2002; Saviola et al., 2003; Voskuil et al., 2004). Ekspresi PE-PGRS 16 meningkat 8 kali lipat sebaliknya PE-PGRS 26 mengalami penurunan 5 kali lipat saat bakteri berada di dalam makrofag. Dubnau dkk (2002) melaporkan ekspresi PE-PGRS 16 dan PE-PGRS 34 saat bakteri di dalam makrofag. Diduga protein ini berperan dalam pertahanan diri dan replikasi bakteri (Dheenadhayalan et al., 2006; Delogu et al., 2004; Brennan et al., 2001; Dubnau et al., 2002). Penderita TB memperlihatkan respon antibodi terhadap PE-PGRS 30 dan PE-PGRS 51. Respon antibodi terjadi pada tahap preklinis dimana manifestasi klinis belum terlihat. Respon antibodi juga ditemukan pada mencit yang diinduksi dengan PGRS domain dari PE-PGRS 33. Hal ini menggambarkan bahwa protein 6

7 PE-PGRS akan diekspresikan selama infeksi dan mampu meningkatkan respon imun humoral. Namun demikian, respon imun humoral tidak bersifat protektif terhadap infeksi M. tuberculosis. Reaksi silang antibodi antara kelompok PE- PGRS juga ditemukan yang menunjukkan adanya epitop yang sama terhadap antibodi (Espitia et al., 1999; Singh et al., 2001; Delogu and Brennan, 2001; Banu et al,, 2002). Domain PE dari protein PE-PGRS 33 tidak memberikan respon antibodi namun memberikan respon terhadap Th1, namun demikian penelitian lain memperlihatkan protein total dari PE-PGRS 30 bersifat imunogenik terhadap Th1. Kondisi ini membuktikan bahwa PE-PGRS akan memberikan respon imun seluler dan diduga dipengaruhi oleh domain PE. Hasil penelitian ini belum tentu dapat disamakan dengan protein PE-PGRS yang lain (Delogu & Brennan, 2001; Campuzano et al., 2007). Analisis terhadap protein PE-PGRS memperlihatkan bahwa, bakteri dapat berkembang dengan baik di dalam makrofag dan jaringan granuloma, namun tanpa PE-PGRS bakteri tidak dapat bereplikasi di dalam makrofag dan persisten di dalam granuloma. PE-PGRS diduga berperan dalam menghambat presentasi antigen oleh APC, hal ini terkait kemiripan antara sekuens PE-PGRS dengan Epstein Barr Nuclear Antigen 1 (EBNA-1) dari Epstein Barr Virus (EBV), dimana EBNA-1 diketahui menghambat presentasi antigen (Banu et al., 2002; Espitia et al., 1999; Ramakrishnan et al., 2000; Levitskaya et al., 1995). PE- PGRS 11 juga berperan dalam resistensi bakteri terhadap stress oksidatif (Chaturvedi et al., 2010). 7

8 Kelompok lain dari PR-PGRS adalah PR-PGRS 24 dan 35. PR-PGRS 24 disandi oleh gen Rv1325c yang terdiri dari 1812 nukleotida. Sekuens penyandi protein ini berada pada posisi dari isolat standart M. tuberculosis H37Rv, sebaliknya PE-PGRS 35 disandi oleh gen Rv1983 yang terdiri dari 1677 nukleotida. Sekuens penyandi protein ini berada pada posisi Namun demikian, belum banyak data atau hasil penelitian yang berkaitan dengan protein ini. Data awal memperlihatkan Kedua protein mempunyai potensi imunogenisitas yang baik terhadap antibodi dan sel T berdasarkan susunan asam aminonya (Chopin et al., 2013). Pemahaman terhadap karakteristik molekular M. tuberculosis sangat berperan dalam identifikasi protein imunogenik, kemungkinan reaksi silang, toksisitas, serta pengembangan epitop imunogenik. Kondisi ini akan mendorong percepatan pengembangan vaksin dan model diagnostik cepat M. tuberculosis. Kajian terhadap potensi PE-PGRS 24 dan 34 baik dalam bentuk protein rekombinan maupun epitop imunogenik belum banyak dilakukan, baik sebagai kandidat diagnostik maupun vaksin. Sistem imun tubuh mengenal protein M. tuberculosis hanya melalui suatu antigenik determinant atau epitop. Dalam hal ini terdapat dua kelompok besar epitop imunogenik, yaitu epitop sel B dan epitop sel T. Epitop sel B merupakan daerah tertentu dari suatu protein yang dikenal oleh sel B yang berada pada permukan sedangkan epitop sel T merupakan daerah tertentu dari protein yang dikenal oleh struktur Major Histocompatibility Complex (MHC), yaitu MHC klas I untuk sel T sitotoksik dan MHC klas II untuk sel T helper (Janeway et al., 2010; 8

9 Akhter et al., 2012; Dorloi et al., 2011; Salomon and Flower, 2006; Sollner and Mayer, 2006). Pada infeksi M. tuberculosis, respon antibodi lebih banyak dikaji sebagai komponen diagnostik. Pemahaman terhadap protein antigenik terhadap sel B menjadi sangat penting dalam mengembangkan metoda diagnosis cepat. Salah satu masalah utama dalam mendapatkan protein antigenik adalah biaya dan waktu yang lama untuk sintesis protein rekombinan. Mengingat antibodi hanya mengenal sekuens asam amino atau epitop tertentu dari suatu protein, maka saat sekarang berkembang berbagai metoda komputasi untuk mengidentifikasi dan memprediksi epitop spesifik sel B, seperti PEOPLE, PREDITOP, ABC pred, BCPreds dan lain sebagainya (Alix, 1999; Odorico and Pellequer, 2003; Saha et al., 2005). Epitop sel B dapat dikelompokkan atas dua tipe, yaitu linear atau kontinyu dan konformatif atau diskontinyu. Epitop linear tersusun dari rantai pendek asam amino yang saling berurutan. Sebaliknya, konfirmatif tidak disusun oleh asam amino yang berurutan namun terbentuk akibat adanya lipatan pada struktur protein. Walaupun sebagian besar epitop sel B bersifat konformatif, namun penelitian lebih banyak kearah epitop linear. Kondisi ini menyebabkan berbagai metoda komputasi berkembang untuk memprediksi epitop linear sel B dari suatu protein (Flower, 2007; Greenbaum et al., 2007; Barlow et al., 1986; Larsen et al., 2006). Analisis dan prediksi epitop sel B akan memberikan banyak keuntungan, yaitu respon imunogenik tidak terlalu berbeda dengan protein utuh, mudah 9

10 disentesis karena hanya terdiri dari asam amino serta tidak memerlukan biaya yang besar dan waktu yang lama. Kajian terhadap epitop imunogenik sebagai model diagnosis M. tuberculosis telah banyak dilakukan, namun demikian belum banyak laporan tentang protein kelompok PE-PGRS. Beberapa penelitian yang berkaitan dengan analisis epitop imunogenik antara lain terhadap protein kelompok PPE (Wang et al., 2011) dan proline-threonine repetitive protein (PTRP; Rv0538) (Singh et al., 2009) serta penelitian yang kami lakukan terhadap protein sekresi M. tuberculosis yang berukuran 20 kda. Hasil penelitian kami terhadap 4 protein memperlihatkan protein ppia (Rv0009), dan nuob (Rv3146) berpotensi sebagai model diagnostik karena memperlihatkan titer antibodi yang berbeda antara penderita TB dan non TB. Pada penelitian ini kita mencoba menganalisis variasi molekular protein PE-PGRS 24 dan 35 serta potensinya imunogenik kedua protein baik dalam bentuk rekombinan maupun peptida imunogenik. Sekuens asam amino peptida didapatkan secara in siliko. B. Perumusan masalah Berdasarkan latar belakang penelitian dapat disusun rumusan masalah sebagai berikut : 1. Apakah terdapat perbedaan variasi molekuler PE-PGRS 24 dan 35 antara isolat M. tuberculosis strain Beijing dan Non Beijing..? 2. Bagaimanakah karakteristik protein PE PGRS 24 dan 35..? 10

11 3. Apakah epitop linear sel B dan epitop MHC klas I dan II protein PE PGRS 24 dan 35 berdasarkan analisis in siliko..? 4. Bagaimana respon imun humoral terhadap epitop sel B dari protein PE PGRS 24 dan 35..? 5. Apakah terdapat perbedaan respon imun humoral antara epitop sel B dengan protein rekombinan PE PGRS 24 dan 35..? 6. Apakah terdapat perbedaan respon imun humoral PE-PGRS 24 dan 35 pada kasus TB aktif dan non TB..? C. Tujuan Penelitian 1. Tujuan Umum Mengkaji karakteristik dan imunogenisitas protein kelompok PE-PGRS 24 dan 35 dari M. tuberculosis Strain Beijing isolat lokal 2. Tujuan Khusus 1. Mengkaji perbedaan variasi molekuler PE-PGRS 24 dan 35 antara isolat M. tuberculosis strain Beijing dan Non Beijing 2. Mengidentifikasi karakteristik protein PE PGRS 24 dan Mengidentifikasi epitop linear sel B dan epitop MHC klas I dan II dari protein PE PGRS 24 dan 35 secara in siliko. 4. Mengkaji respon imun humoral terhadap epitop linear sel B dari protein PE PGRS 24 dan 35 11

12 5. Membandingkan respon imun humoral antara epitop sel B dengan rekombinan PE PGRS 24 dan Membandingkan perbedaan respon imun humoral PE-PGRS 24 dan 35 pada kasus TB aktif dan non TB D. Keaslian Penelitian Penelitian tentang karakteristik molekuler dan imunogenesitas protein kelompok PE-PGRS M. tuberculosis belum banyak dilakukan. Mengingat protein ini merupakan kelompok protein terbanyak yang dihasilkan dan mempunyai struktur yang conserved terutama pada asam amino awal, maka potensi protein kelompok ini untuk pengembangan vaksin dan diagnostik menjadi cukup besar. Beberapa penelitian yang berkorelasi dengan penelitian ini adalah Ramakrishnan dkk (2000) melaporkan bahwa M. marinum dapat berkembang dengan baik di dalam makrofag dan jaringan granuloma, namun tanpa PE-PGRS bakteri tidak dapat bereplikasi di dalam makrofag dan persisten di dalam granuloma. PE-PGRS diduga berperan dalam menghambat presentasi antigen oleh Antigen Presenting Cell (APC), hal ini terkait kemiripan antara sekuens PE-PGRS dengan protein EBNA-1 dari EBV. EBNA-1 telah diketahui menghambat presentasi antigen (Banu et al., 2002; Espitia et al., 1999; Ramakrishnan et al., 2000; Levitskaya et al., 1995). Penelitian lain memperlihatkan PE-PGRS11 berperan dalam resistensi bakteri terhadap stress oksidatif (Chaturvedi et al., 2010). 12

13 PE-PGRS banyak ditemukan pada M. tuberculosis dan M. bovis serta sangat sedikit ditemukan pada Mikobakteria lain, seperti M. avium. Protein ini terletak di permukaan sel dan berperan sebagai mediator interaksi dengan sel host. PG-PGRS 33 berperan dalam pembentukan dinding sel bakteri dan morfologi koloni (Delogu et al., 2004). Pada kultur sel diketahui protein ini disekresikan ke dalam lingkungan melalui sistem sekresi tipe VII (Esx5) dan translokasi protein diduga berkaitan dengan 30 asama amino awal (kelompok PE) (Casciofero et al., 2011). Ekspresi PE-PGRS 16 meningkat 8 kali lipat sebaliknya PE-PGRS 26 mengalami penurunan 5 kali lipat saat bakteri berada di dalam makrofag (Dheenadhayalan et al., 2006). Beberapa protein dari kelompok PE-PGRS diduga terekspresi pada tingkat intraselular, seperti PE-PGRS14, PE-PGRS24, PE-PGRS 33, 35, dan PE-PGRS 45. Ekspresi ini membuktikan bahwa protein ini diperlukan dalam perkembangan bakteri intra sel. Ekspresi PE-PGRS 16 dan PE-PGRS 34 ditemukan saat bakteri di dalam makrofag, diduga protein ini berperan dalam pertahanan diri dan replikasi bakteri (Dheenadhayalan et al., 2006; Delogu et al., 2004; Brennan et al., 2001; Dubnau et al., 2002). Secara umum kebaharuan pada penelitian ini adalah diketahuinya lokasi dan karakteristik protein kelompok PE-PGRS 24 dan 35, epitop yang terkait dengan sel B dan sel T serta respon imun humoral terhadap epitop dan protein rekombinan yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai kandidat vaksin. 13

14 E. Manfaat Penelitian 1. Teoritis Memberikan informasi tambahan tentang respon imun humoral dari protein PE-PGRS 24 dan 35. Memberikan informasi respon humoral epitop linear sel B 2. Praktis 1. Dapat menjadi dasar pemikiran pengembangan model diagnostik terhadap M. tuberculosis berdasarkan hasil respon imun humoral baik terhadap epitop maupun protein rekombinan 2. Membuka peluang pemanfaatan hasil penelitian ke dalam industri dalam kerangka kolaborasi industri perguruan tinggi dalam hal pengembangan model diagnostik baru, seperti konstruksi rapid test 14