MATERI DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Materi

Transkripsi

1 MATERI DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Proses sampling monyet ekor panjang (MEP) yang digunakan pada penelitian ini terbagi atas dua periode sampling. Periode sampling pertama, telah dilakukan pada bulan Agustus 2002 sampai September 2005, yang meliputi kegiatan persiapan hewan penelitian dengan metode perfusi jaringan yang dilakukan di Pusat Studi Satwa Primata (PSSP) Institut Pertanian Bogor. Sedangkan periode sampling kedua, dilakukan untuk melengkapi sampel MEP periode sebelumnya, yang dimulai dari bulan November 2006 sampai Juni Adapun kegiatan pada periode tersebut meliputi proses pembuatan preparat histologi dari jaringan hipofise dan kulit, pewarnaan histokimia, serta pengamatan hasil penelitian. Kegiatan ini dilakukan di Laboratorium Riset Anatomi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Materi Hewan penelitian Penelitian ini menggunakan organ hipofise dan jaringan kulit yang diambil di bagian kepala dan perut MEP. Hewan yang digunakan terdiri atas dua periode sampel. Sampel periode pertama adalah pemanfaatan hasil sampling MEP yang diperoleh dari Pusat Studi Satwa Primata Institut Pertanian Bogor. Adapun tingkatan umur MEP periode pertama terdiri atas: fetus MEP umur 55 hari (F-55) kebuntingan yang khusus digunakan untuk pengambilan kulit perut, fetus umur 70 hari (F-70), 85 hari (F-85), 100 hari (F-100), 120 hari (F-120) dan 150 hari (F-150), serta anak umur 1 bulan (P-1) dan 3 bulan (P-3), dengan jumlah satu ekor untuk setiap tingkatan umur. Pelaksanaan sampling dilakukan dibawah pengawasan dan persetujuan Komisi Kesejahteraan Hewan (Animal Care and Use Committee/ACUC) PSSP, LPPM-IPB nomor IR. Sampel periode kedua adalah pengambilan sampel MEP untuk melengkapi tingkatan umur MEP dari sampel periode pertama, yang terdiri atas: MEP anak umur 15 bulan (P-15), dewasa umur 50 bulan (P-50) dan 100 bulan (P-100), dengan jumlah satu ekor untuk setiap tingkatan umur. Sampel prenatal (fetus) dan postnatal (anak) dari sampel periode pertama, berasal dari induk MEP yang ditangkap dari alam, yang terlebih dahulu

2 dikarantina untuk pemeriksaan status kesehatan dan ditempatkan pada kandang individual. Untuk menentukan umur fetus secara akurat, seluruh induk MEP dikawinkan dengan metode time mating. Siklus menstruasi MEP betina diamati melalui teknik usap vagina sebelum dikawinkan. Pada penelitian ini hanya indukinduk yang memiliki siklus menstruasi yang teratur saja yang dijadikan sebagai indukan fetus. Induk betina yang terpilih, selanjutnya dipindahkan ke kandang kawin. Masa subur induk betina ditandai dengan adanya sekresi lendir vagina yang encer dan bening, kondisi ini biasanya terlihat pada hari ke-11 siklus menstruasi. Saat betina memasuki masa subur, MEP jantan dimasukkan ke kandang kawin untuk disatukan dengan induk betina selama 3 hari. Penentuan hari ke-0 kebuntingan dihitung mulai dari hari ke-2 penggabungan dengan standar deviasi satu hari. Proses sampling untuk sampel periode pertama dilakukan oleh PSSP IPB. Sampel periode kedua, merupakan hasil tangkapan dari alam, kemudian di tempatkan di kandang individu dan diperiksa status kesehatan serta ditentukan kisaran umurnya. Penentuan kisaran umur MEP, dilakukan berdasarkan hasil pemeriksaan terhadap pertumbuhan dan pergantian gigi (Fortman et al. 2002). Bahan penelitian Untuk keperluan perfusi, fiksasi, dehidrasi dan parafinisasi jaringan, secara berurutan digunakan paraformaldehid 0.2% dalam phosphate buffered saline (PBS) 0.1 M ph 7.4; normal bufer formalin 10%, alkohol bertingkat, silol dan parafin histoplast dengan titik leleh o C. Bahan untuk pewarnaan hematoksilin-eosin (HE) adalah pewarna hematoksilin delafield, pewarna eosin dalam alkohol dan Entelan. Untuk pewarnaan Masson s trichrome (MT) modifikasi Goldner digunakan bahan pewarna ponceau 2R, orange G dan lightgreen. Sedangkan untuk pewarnaan imunohistokimia digunakan larutan PBS, aquades, larutan 3% hidrogen peroksida, larutan 10% normal goat serum (Vector Laboratories, Inc), anti human ACTH rabbit serum (1:750) (Gift. NIIDK, USA), 0.02 anti rabbit IgG goat serum (Vector Laboratories, Inc), larutan 0.03% 3.3-Diaminobenzidine (DAB) dan 2% silan (3-aminopropyltrihexysilane/APES) dalam aseton. Sedangkan untuk pewarnaan latar belakang digunakan pewarna hematoksilin.

3 Alat penelitian Adapun alat-alat yang digunakan untuk perfusi dan fikasasi jaringan terdiri atas 1 set pompa perfusi, jarum kupu-kupu, skalpel, gunting, tang arteri, needle holder, pinset, spuit suntik, benang cat gut, tampon, gouce dan wadah penyimpanan jaringan. Untuk proses parafinisasi dan pemotongan jaringan digunakan gelas piala, inkubator, sliding microtome dan gelas objek. Untuk pewarnaan HE alat yang digunakan adalah rak, gelas objek dan gelas penutup, sedangkan kotak lembab, mikropipet dan timer digunakan untuk pewarnaan imunohistokimia. Selanjutnya untuk pengamatan hasil penelitian digunakan mikroskop cahaya dan mikrofotografi. Metode Pengambilan sampel periode pertama Induk MEP yang positif bunting terlebih dahulu dibius dan dilakukan laparotomi medianus untuk mengambil sampel fetus dari uterus. Selanjutnya, fetus dibius secara intraumbilikal dengan pentobarbital (0.1 ml/kg bobot badan), sedangkan anak MEP (P-1 dan P-3) dibius dengan anastetikum yang sama dengan dosis 20 mg/kg bobot badan secara intraperitonial. Dalam keadaan terbius, fetus MEP dikorbankan dengan cara mengeluarkan darah secara intrakardial dengan teknik perfusi. Perfusi dilakukan dengan menggunakan paraformaldehid 0.2% dalam PBS 0.1M, ph 7.4 pada suhu 37 o C dengan kecepatan antara ml/menit sebagai pre-rinse, dilanjutkan dengan larutan fiksatif 2% paraformaldehid dalam PBS 0.1M, ph 7.4 dengan suhu 4 o C selama 20 menit pada kecepatan yang sama. Perfusi intrakardial terhadap sampel MEP, dilakukan dalam kondisi hewan terbius, yaitu dengan cara membuka rongga dada, aorta torakalis dijepit dengan penjepit arteri, kemudian jarum kupu yang telah dihubungkan dengan pompa perfusi dimasukkan ke dalam ventrikel kiri jantung. Setelah jantung membesar akibat terisi larutan pre-rinse, atrium kanan disayat agar darah dan larutan perfusi dapat keluar dari jantung. Apabila larutan perfusi yang keluar telah jernih, maka larutan perfusi diganti dengan larutan fiksatif paraformaldehid 4% dalam PBS, suhu 4 o C selama 20 menit. Setelah proses perfusi selesai, selanjutnya diambil jaringan hipofise dan kulit, yaitu kulit di bagian kepala dan perut (khusus F-55, untuk pengamatan terhadap perkembangan kulit), dengan ukuran 0.5 cm 2 untuk setiap tingkatan umur MEP. Seluruh sampel jaringan, selanjutnya difiksasi dengan larutan paraformaldehid 4%. Sebagai stopping point, sampel organ dimasukkan ke dalam larutan alkohol 70%.

4 Pengambilan sampel periode kedua Sampel periode kedua, terdiri atas seekor anak MEP umur 15 bulan (P-15) dan dua ekor MEP dewasa (P-50 dan P-100), masing-masing dibius dengan menggunakan anastetikum zoletil dosis 10 mg/kg bobot badan secara intramuskular. Dalam kedaan terbius, hewan dikorbankan dengan cara membuka rongga dada untuk mengeluarkan darah dari jantung. Setelah darah keluar seluruhnya, dibuka tulang tengkorak untuk mengambil jaringan hipofise. Selain hipofise, diambil pula jaringan kulit kepala berukuran 0.5 cm 2. Jaringan hipofise dan kulit yang diperoleh, dibilas dengan larutan NaCl fisiologis sebelum dimasukkan ke dalam larutan paraformaldehid 4% selama 24 jam. Sebelum dimasukkan ke dalam alkohol 70% sebagai stopping point, jaringan dimasukkan ke dalam larutan asam pikrat tanpa larutan asam asetat glasial selama 3 jam. Proses pembuatan blok parafin dan pemotongan preparat Jaringan hipofise dan kulit dimasukkan ke dalam tissue cassette sebagai tahap awal untuk proses dehidrasi. Sampel jaringan direndam secara berurutan di dalam larutan alkohol 70%, 80%, 90% dan 95 % masing-masing selama 6 jam pada suhu kamar, diikuti dengan perendaman dalam larutan alkohol 100% (1, 2, 3), masing-masing selama 1 jam pada suhu kamar. Proses penjernihan (clearing) dilakukan dengan larutan silol (1, 2, 3), masing-masing selama 30 menit. Selanjutnya dilakukan proses infiltrasi larutan paraffin dengan tiga kali pemindahan masing-masing selama 30 menit pada suhu 67 o C. Proses selanjutnya adalah pembuatan blok parafin dengan cara merendam jaringan ke dalam parafin cair dan didinginkan dalam suhu kamar. Blok parafin jaringan hipofise dari sampel periode pertama dan kedua, disayat dengan menggunakan sliding microtom dengan ketebalan 10 µm secara serial dengan berpedoman kepada teknik pembagian daerah pemotongan hipofise babi (Sasaki et al. 1992). Teknik pemotongan ini dimaksudkan untuk menujukkan gambaran hipofise secara utuh tanpa harus mewarnai seluruh sayatan. Sedangkan pemotongan blok jaringan kulit dari sampel periode pertama dan kedua, dilakukan dengan penyayatan blok secara transversal, dengan ketebalan 5 µm untuk pewarnaan HE dan MT, serta 10 µm untuk pewarnaan IHK. Selanjutnya, sayatan jaringan yang diperoleh diletakkan pada gelas objek yang sebelumnya telah dilapisi (coating) dengan silan (aminopropyltriehoxysilane/apes), dan ditetesi dengan aquades di atas hot-plate dengan suhu 37 o C. Setelah kering, gelas objek diinkubasikan pada suhu 37 o C selama satu malam. Sedangkan untuk keperluan pewarnaan HE dan MT, gelas objek tidak dilapisi dengan silan.

5 3 1 2 Gambar 13 Pembagian daerah pemotongan hipofise pada babi. Potongan a, b dan c adalah daerah medial, paramedial dan lateral. 1: neurohipofise, 2: pars intermedia, 3: adenohipofise (Sasaki et al. 1992). Pewarnaan hematoksilin-eosin, Masson s trichrome dan imunohistokimia Sayatan jaringan hipofise dan kulit pada gelas objek selanjutnya memasuki tahap deparafinisasi dan rehidrasi. Setelah kedua tahap tersebut, dilakukan proses pewarnaan dengan metode hematoksilin-eosin (HE) (Humason 1967), Masson,s trichrome (MT) modifikasi Goldner (Kiernan 1990) dan imunohistokimia (IHK) metode avidin-biotin-peroxidase complex (ABC method) (Hsu et al. 1981). Metode pewarnaan HE dan MT digunakan untuk mengamati morfologi dan identifikasi sel-sel penyusun PI dan perkembangan buluh darah dan jaringan ikat secara histologis, sedangkan dengan metode pewarnaan IHK dapat diketahui perkembangan dan distribusi sel-sel ir-acth-msh di PI serta aksis antara sel-sel ir-acth-msh PI hipofise dengan melanogenesis pada melanosit di epidermis dan folikel rambut kulit MEP. Pewarnaan IHK diawali dengan proses deparafinisasi dan rehidrasi, kemudian jaringan dibilas tiga kali dengan aquades masing-masing 5 menit. Aquades yang berada disekitar jaringan pada gelas objek dikeringkan menggunakan kertas tisu, selanjutnya jaringan dilingkari dengan pena parafin, gelas objek diletakkan pada posisi mendatar di dalam kotak lembab. Jaringan diteteskan 3% hidrogen peroksida dalam aquades selama 15 menit pada suhu kamar. Selanjutnya jaringan pada gelas objek diinkubasikan dengan 10% normal goat serum (Vector Laboratories, Inc) selama 30 menit pada suhu kamar. Tahap berikutnya, jaringan pada gelas objek diinkubasikan dengan anti human ACTH rabbit serum dengan pengenceran 1 : 750 selama 1 malam pada suhu

6 4 o C. dan diinkubasikan dengan antibodi sekunder, yaitu 0.02% anti rabbit IgG goat serum (Vector Laboratories, Inc) selama 30 menit pada suhu 37 o C. Sebagai marker digunakan campuran 10 µl avidin dan 10 µl biotin (Vector Laboratories, Inc) dalam 1 ml PBS. dan diinkubasikan di dalam inkubator dengan suhu 37 o C selama 30 menit. Untuk visualisasi hasil pewarnaan, jaringan diinkubasikan dengan larutan 0.03% 3.3-diaminobenzidine (DAB) selama 20 menit sambil diamati di bawah mikroskop, selanjutnya dibilas dengan PBS. Untuk pewarnaan latar belakang, digunakan pewarna hematoksilin. Selanjutnya dilakukan dehidrasi dan clearing jaringan, lalu ditutup dengan gelas penutup (cover glass) dengan menggunakan bahan perekat Entelan. Pengamatan Pengamatan hasil pewarnaan terhadap jaringan hipofise, meliputi: anatomi dan perkembangan PI hipofise MEP, perkembangan buluh darah dan jaringan ikat, serta perkembangan dan distribusi sel-sel ir-acth-msh PI hipofise. Sedangkan pengamatan terhadap kulit meliputi: anatomi dan perkembangan struktur kulit MEP, perkembangan melanogenesis di epidermis dan folikel rambut serta aksis sel-sel ir-acth-msh PI hipofise - melanosit kulit MEP. Untuk mendeteksi sel-sel ir-msh di PI hipofise dan melanosit kulit MEP, dilakukan secara tidak langsung, yaitu melalui reaksi yang terjadi antara anti human ACTH rabbit serum dengan ACTH. Teknik ini dapat dilakukan, karena ACTH merupakan prekursor α-msh, baik di sel-sel melanotrop PI maupun di melanosit kulit. Analisis Hasil Pengamatan kepadatan (densitas) sel dan intensitas warna yang dihasilkan pada pewarnaan HE dan IHK, buluh darah dan jaringan ikat pada pewarnaan MT, dilakukan dengan metode skoring. Adapun kriteria pemberian skor terhadap densitas sel-sel asidofil dan basofil, buluh darah dan jaringan ikat PI hipofise serta sel-sel ir-acth-msh, berkisar antara negatif (-) untuk sel yang tidak teramati, positif satu (+) untuk densitas jarang, sampai dengan positif empat (++++) untuk densitas terpadat. Sedangkan kriteria skor untuk intensitas pewarnaan pada distribusi sel-sel ir-acth-msh PI hipofise, berkisar antara negatif (-) untuk warna yang tidak dihasilkan, positif satu (+) untuk intensitas sangat lemah sampai dengan positif empat (++++) untuk intesitas sangat kuat. Adapun data mengenai anatomi dan perkembangan struktur kulit MEP serta aksis sel-sel ir-acth-msh PI - melanosit kulit MEP diolah secara deskriptif.