BAHAN DAN METODE. Tempat dan Waktu

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Patologi Serangga Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan dari November 2009 sampai Januari Alat dan Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah serangga S. litura, SlNPV, bengkuang, daun kedelai, air destilata, kertas tisu, dan buffer SDS 0,1%. Alat-alat yang digunakan adalah wadah pembiakan dan pemeliharaan S. litura, mikroskop stereo, cawan petri, pinset, mortar, hemasitometer, pipet, tabung reaksi, sentrifus, lemari pendingin, autoklaf, timbangan digital, kuas, dan wadah plastik. Penyiapan suspensi SlNPV Larva S. litura di lapangan yang terinfeksi virus dikumpulkan, kemudian digerus menggunakan mortar dalam buffer SDS 0,1% untuk mendapatkan suspensi kasar. Suspensi kasar yang diperoleh disentrifugasi dengan sentrifus (High speed micro refrigerated centrifuge Tommy 151) untuk memperoleh suspense polyhedral yang lebih bersih dari berbagai macam kotoran ataupun dari sisa jaringan larva. Suspensi kasar disentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 2 menit, kemudian supernatan dikumpulkan dan endapannya dibuang. Supernatan disentrifugasi lagi dengan kecepatan 5000 rpm selama 20 menit, kemudian endapannya diambil dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 2000 rpm selama 2 menit. Supernatan disentrifugasi kembali dengan tahapan yang sama seperti sebelumnya sampai diperoleh hasil berupa endapan akhir yang relatif bersih. Kemudian endapan akhir tersebut diresuspensi dengan akuades secukupnya. Suspensi yang didapatkan kemudian diencerkan untuk mempermudah penghitungan konsentrasi Polyhedra Inclusion Bodies (PIBs). Suspensi induk sebanyak 0,01 ml diencerkan dalam buffer sebanyak 0,99 ml untuk mendapatkan

2 pengenceran 100 kali. Suspensi hasil pengenceran tersebut diambil dengan pipet tetes dan diteteskan pada hemasitometer burker kemudian diamati dan dihitung PIBs di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali (Gambar 1). Konsentrasi PIBs dalam suspensi induk yang diperoleh adalah 1,66 x 10 7 PIBs/ml. Suspensi induk tersebut kemudian diencerkan lagi dan diperoleh konsentrasi 117 PIBs/ml, 233 PIBs/ml, 465 PIBs/ml, 698 PIBs/ml, dan 930 PIBs/ml. Konsentrasi ini merupakan konsentrasi yang akan digunakan dalam uji toksisitas. Gambar 1 Polihedra spodoptera litura nucleopolyhedrovirus di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x Penyiapan S. litura Larva yang akan diuji diambil dan dikoleksi dari lapangan. Larva yang dikoleksi adalah larva instar I, kemudian larva tersebut dipelihara di laboratorium. Larva yang digunakan pada percobaan adalah instar III, yang sehat dengan ciriciri larva aktif bergerak, dengan warna tubuh cerah. Uji Toksisitas NPV terhadap Mortalitas S. litura Uji pendahuluan dilakukan untuk menentukan taraf konsentrasi dari SlNPV terhadap larva S. litura. Penentuan konsentrasi berdasarkan pada literatur, bahwa SlNPV memiliki tingkat patogenisitas yang relatif tinggi Nilai LC 50 (konsentrasi yang mematikan 50% populasi) untuk larva instar III sebesar 5,4 x

3 103 polihedra inclusion bodies (PIBs)/ml (Balai Besar-Biogen 2009). Sebagai kontrol digunakan akuades. Pengujian toksisitas SlNPV terhadap larva S. litura dilakukan dengan metode perlakuan pakan. Pada pengujian, ekstrak diuji pada lima taraf konsentrasi yang diharapkan dapat mengakibatkan kematian S. litura 10% sampai 95%. Daun kedelai dipotong dengan ukuran 2 x 2 cm. Setiap potong daun ditetesi dengan 30 µl SlNPV. Daun kontrol hanya ditetesi akuades. Daun perlakuan dan kontrol masing-masing sebanyak satu lembar dimasukkan ke dalam wadah plastik dengan volume 50 ml, kemudian satu larva instar kedua S. litura dimasukkan ke dalam wadah plastik tersebut dan diulang tiga kali setiap ulangan terdiri dari 15 larva. Setelah 24 jam larva selanjutnya diberi daun kedelai yang tidak mengandung NPV yang diganti setiap hari. Pengamatan kematian S. litura dilakukan 1 kali 24 jam setelah perlakuan sampai larva mati. Data hubungan konsentrasi-mortalitas diolah dengan polo-pc. Jika persentase kematian S. litura pada kontrol antara 5 sampai 20% maka dilakukan koreksi dengan menggunakan rumus Abbott ( 1925) sebagai berikut : Pt = {(P0 Pc)/(100 Pc)} x 100% Pt = % Kematian terkoreksi P 0 = % Kematian kumulatif pada perlakuan Pc = % Kematian kumulatif pada kontrol Data mortalitas diolah dengan analisis probit (Finney 1971) dengan program POLO-PC (LeOra Software, 2003). Konsentrasi mematikan (LC) dihitung pada selang kepercayaan 95% fiducial limits (FL). Uji Efektivitas Ekstrak bengkuang Paparan Sinar Matahari Intensitas matahari, suhu udara rata-rata dan kelembaban relatif selama masa perlakuan adalah berturut-turut 200 K/cm 2, 24,7 C, dan 89% (Klimatologi Dramaga 2010). Pemaparan SlNPV dilakukan di bawah sinar matahari langsung selama 0, 3, 6, dan 12 jam.

4 Metode Pengujian Percobaan ini terdiri atas dua faktor perlakuan, faktor pertama yaitu ekstrak bengkuang dengan konsentrasi 0% ekstrak bengkuang, penambahan 5% ekstrak bengkuang, penambahan 10% ekstrak bengkuang, serta 100% bengkuang tanpa NPV dan kontrol. Faktor kedua yaitu paparan di bawah sinar matahari langsung selama 0, 1, 3, 6, dan 12 jam. Konsentrasi yang digunakan adalah 10 4 PIBs/ml. Suspensi SlNPV dan ekstrak bengkuang dimasukkan ke dalam cawan Petri berdiameter 14 cm. Suspensi SlNPV tersebut dibiarkan terkena matahari langsung sesuai dengan perlakuan yang telah ditentukan. Daun kedelai segar berukuran 2 x 2 cm dicelupkan selama 5 detik kedalam suspensi NPV kemudian dikering anginkan selama 30 detik. Daun kedelai tersebut kemudian dimasukkan ke dalam wadah plastik yang sudah berisi larva S. litura instar tiga. Setelah pakan habis, diganti dengan daun-daun baru yang tidak diberi perlakuan virus dan diberikan sesuai kapasitas makan, sehingga larva tidak kekurangan pakan. Kematian larva dicatat setiap hari, pengamatan dihentikan setelah semua larva yang masih hidup menjadi pupa. Persentase mortalitas larva dikoreksi menggunakan rumus Abbott dengan formula seperti yang telah disebutkan pada percobaan sebelumnya. Persentase mortalitas larva S. litura (%). Pengamatan dilakukan dengan menghitung jumlah larva yang mati akibat perlakuan. Persentase mortalitas larva dihitung dengan menggunakan rumus Keteragan : P n N = Persentase mortalitas larva = Jumlah larva yang mati = Jumlah larva yang diuji.

5 Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan dalam pengujian konsentrasi virus dengan ekstrak bengkuang terhadap mortalitas dan waktu kematian S. litura adalah Rancangan Acak Lengkap Faktorial 5 x 5 dengan 3 ulangan, setiap ulangan terdiri dari 15 larva. Faktor pertama adalah konsentrasi bengkuang yaitu 0% ekstrak bengkuang (C 1 ), penambahan 5% ekstrak bengkuang (C 2 ), penambahan 10% ekstrak bengkuang (C 3 ), 100% ekstrak bengkuang tanpa NPV (C 4 ), kontrol akuades (C 5 ). Faktor kedua adalah waktu pemaparan dibawah sinar matahari langsung yaitu 0 jam (T 1 ), 1 jam (T 2 ), 3 jam (T 3 ), 6 jam (T 4 ), 12 jam (T 5 ). Analisis Data Data selanjutnya diolah menggunakan program Statistical Analisis System (SAS) for Windows versi 6.12 untuk memperoleh analisis ragam dan apabila berbeda nyata dilanjutkan dengan uji selang berganda Duncan pada taraf nyata α = 0,05.