KARAKTERISASI ABNORMALITAS EMBRIO SOMATIK KELAPA SAWIT (Elaeis guineensis Jacq) NESTI F. SIANIPAR A

Transkripsi

1 KARAKTERISASI ABNORMALITAS EMBRIO SOMATIK KELAPA SAWIT (Elaeis guineensis Jacq) NESTI F. SIANIPAR A SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008

2 PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Karakterisasi Abnormalitas Embrio Somatik Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq) adalah karya saya sendiri dengan bimbingan dari Komisi Pembimbing dan belumdiajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini. Bogor, Januari 2008 Nesti F. Sianipar A

3 ABSTRACT NESTI F. SIANIPAR. Characterization on Abnormalities of Oilpalm (Elaeis guineensis Jacq) Somatic Embryos. GUSTAAF A. WATTIMENA, MAGGY T. SUHARTONO, HAJRIAL ASWIDINNOOR and NURITA TORUAN- MATHIUS. Oilpalm is the most important vegetable oil producing plant in Indonesia. A mass production of oilpalm transplants to support new oilpalm estate can be conducted through tissue culture. However, the primary problem of tissue culture generated transplants is increasingly reproductive abnormalities postulated due to the genetic and/or epygenetic changes during somatic embryo (SE) formation. The objectives of this research were (1) to characterize abnormality of somatic embryos at several growth stages, (2) to study the genetic change of SEs at several growth stages and their plantles, and (3) to study the relationship of cytosine methylation of genomic DNA and abnormality at several SE growth stages and plantlets. Genetic characterization was accomplished by RAPD and RAF technique. Epigenetic characterization was conducted by RP-HPLC and RAFmethylation sensitive technique. The results showed that morphological characterization on SE at globular, heart form scutellar, and cotyledon resulted that there were morphological variations. The most obvious variations were observed at heart form scutellar stage and cotyledon. Histologically, the procambial strand of SE abnormal cotyledon of clone 638 and 558 was disperse and their protoderm cell layer was not clear. Meanwhile, at clone 636 the abnormal SE cotyledon was morphologically different from the normal one, but anatomically was similar to the normal one. The RAPD techniques distinguish the SE normal cotyledon to the abnormal at clone 638 by 5 primers (OPE-14,OPC-9, W-15, AP-20 and SC10-19), while at clone 558 by 3 primers (OPE-14, W-15 and AP-20). Among the five primers there were 3 primers differing the normal and abnormal SE cotyledon at clone 638, at a specific band of 1750 bp, those were OPE-14, W-15 and AP-20 primers. The RAF technique detected the changes of genomic DNA genom at bp. There were 3 among the 6 primers (AO-12, BB-18, W-15) detecting the sequence of genomic DNA at 150 bp. The genomic DNA slicing by RAF technique with MspI and Hpa2 enzymes could detect the location of cytosine methylation. The Hpa2 enzyme cut the m CCGG, but if both the Cs were methylated, the sequence was not cut. The MspI enzyme would cut the genomic DNA sequence when the cytosine experiencing an internal methylation (C m CGG). The RAF technique could detect methylation location of internal, external, and fully methylated at bp of genomic DNA. The RP-HPLC analysis showed very litle changes of cytosine ( %) at clone 638 and 636. The cytosine methylation changes of normal and abnormal SE were due to hipomethylation and hipermethylation at clon 638 and 558, respectively. The cytosine methylation change was too small to affect mophological change from normal to abnormal. Abnormality of SE at cotyledon stage was due to the change of genomic DNA sequence or mutation. Key words: somatic embryo, abnormality embryo somatic, oilpalm, DNA Methylation, RAPD, RAF, RP-HPLC

4 RINGKASAN NESTI F. SIANIPAR. Karakterisasi abnormalitas embrio somatik kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq). GUSTAAF A. WATTIMENA, MAGGY T. SUHARTONO, HAJRIAL ASWIDINNOOR and NURITA TORUAN MAHIUS. Kelapa sawit merupakan tanaman penghasil minyak nabati utama di Indonesia dan memegang peranan penting untuk memenuhi kebutuhan minyak nabati dalam negeri. Untuk meningkatkan peranan kelapa sawit dilakukan intensifikasi dan ekstensifikasi tanaman kelapa sawit. Untuk mencapai peningkatan perluasan areal pertanaman kelapa sawit membutuhkan bibit yang sangat besar. Salah satu cara penyediaan bibit kelapa sawit dapat melalui kultur jaringan. Kelebihan melalui kultur jaringan adalah mampu menghasilkan bibit dalam jumlah yang banyak dalam waktu yang relatif singkat. Namun demikian, kendala utama bibit hasil kultur jaringan adalah masalah abnormalitas pada organ reproduktif yang diduga terkait dengan perubahan genetik dan epigenetik selama masa pembentukan embrio somatik (ES). Tujuan penelitian ini adalah: (1) untuk mengkarakterisasi abnormalitas embrio somatik dari beberapa perkembangan, (2) mempelajari perubahan genetik ES dari beberapa tahap perkembangan ES dan planlet, dan (3) mempelajari hubungan metilasi sitosin DNA genom dengan abnormalitas pada beberapa tahap perkembangan ES dan planlet. Pendekatan yang dilakukan untuk mencapai tujuan tersebut adalah melalui karakterisasi morfologi, histologi, genetik dan epigenetik. Bahan tanaman yang digunakan adalah kalus embrio somatik (ES) Tenera unggul hasil seleksi (ortet terpilih) klon MK638, MK636 dan MK558 dari Balai Penelitian Marihat. ES normal dan abnormal yang telah dikarakterisasi pada percobaan morfologi. Karakterisasi morfologi ES normal atau abnormal dilakukan berdasarkan bentuk dan bidang polaritas, bidang pembelahan sel asimetri atau simetri, dan jumlah kotiledon. Morfologi masing masing fase perkembangan embrio didokumentasi menggunakan mikroskop binokuler dengan perbesaran 40x (stereomicroscope Technical, Japan). Teknik preparasi contoh dilakukan dalam bentuk sediaan anatomi berdasarkan metode Nakamura (1995). Karakterisasi genetik dilakukan dengan teknik Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD) dan Randomly Amplified DNA Fingerprinting (RAF). Karakterisasi berdasarkan epigenetik dilakukan dengan teknik Riverse-Phase Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) dan RAF-Sensitif Metilasi (RAF-SM). Hasil penelitian menunjukkan bahwa karakterisasi secara morfologi embrio somatik dari tahap globular, scuttelar berbentuk hati, dan kotiledon menghasilkan keragaman secara morfologi. Keragaman morfologi terlihat jelas pada tahap scutellar berbentuk hati dan kotiledon. Hasil histologi terlihat perbedaan pada ES kotiledon abnormal pada procambial strand menyebar dan lapisan sel protoderm tidak jelas pada klon 638 dan 558, sedangkan pada klon 636 ES kotiledon abnormal secara morfologi tetapi secara anatomi terlihat tidak berbeda dengan normal. Informasi yang diperoleh dengan teknik RAPD dari penelitian ini diketahui ES kotiledon normal dan abnormal pada klon 638 dapat dibedakan dengan 5 primer (OPE-14,OPC-9, W-15, AP-20 dan SC10-19), sedangkan ES kotiledon normal dan abnormal pada klon 558 dapat dibedakan dengan 3 primer (OPE-14,

5 W-15 dan AP-20). Diantara 5 primer terdapat 3 primer yang menunjukkan perbedaan antara ES kotiledon normal dan abnormal pada klon 638 yaitu pada pita yang spesifik disekitar 1750 bp yaitu primer OPE-14, W-15 dan AP-20. Dengan Teknik RAF hanya menganalisis klon 638, ada 6 dari 8 primer yang dapat membedakan antara ES kotiledon normal dan abnormal, planlet dan daun tanaman induk normal. Dengan analisis RAF dapat diketahui perubahan sekuen DNA genom berada disekitar bp. Ada 3 dari 6 primer (AO-12, BB-18, W-15) yang menunjukkan perubahan sekuens DNA genom pada fragmen spesifik disekitar 150 bp. Hasil pemotongan DNA genom dengan enzim MspI dan HpaII yang dapat dideteksi lokasi terjadinya metilasi sitosin dengan teknik RAF. Enzim HpaII memotong sekuen m CCGG tetapi jika C keduanya mengalami metilasi sekuen tersebut tidak terpotong. Msp1 akan memotong bila sitosin internal termetilasi (C m CGG). Teknik RAF ini dapat mendeteksi lokasi metilasi internal, metilasi eksternal dan metilasi penuh (fully-metilated ) yang terjadi sekitar bp pada DNA genom. Hasil analisis RP-HPLC menunjukkan perubahan metilasi sitosin sangat kecil sekitar 0,25 2,72 % pada klon 638 dan klon 636. Perubahan metilasi sitosin antara ES normal dan abnormal terjadi hipometilasi pada klon 638 dan terjadi hipermetilasi pada klon 558. Perbedaan kandungan metilasi sitosin sangat kecil, sehingga metilasi sitosin tidak berpengaruh langsung terhadap perubahan morfologi dari normal menjadi abnormal. Abnormalitas yang terjadi pada embrio somatik pada tahap kotiledon akibat terjadinya perubahan sekuens DNA genom atau mutasi. Berdasarkan hasil penelitian ada beberapa informasi yang baru yaitu : (1) terdapat keragaman abnormal pada tingkat morfologi dan histologi pada fase skutelar berbentuk hati dan kotiledon, (2) terjadi perubahan sekuens DNA berbeda pada ES kotiledon normal dan abnormal dengan teknik RAPD dan RAF, (3) terdapat mutasi pada fase ES kotiledon abnormal yang dideteksi dengan teknik RAF, (4) terdapat perubahan pola situs metilasi sitosin pada ES kotiledon abnormal dengan tanaman induk normal, (5) morfologi dan histologi abnormal berhubungan dengan perubahan genetik dan epigenetik dan (6) Perubahan kandungan metilasi sitosin DNA genom tidak berdampak langsung terhadap perubahan morfologi embrio somatik. Kata kunci : Embrio somatik, abnormalitas embrio-somatik, kelapa sawit, metilasi DNA, RAPD, RAF, RP-HPLC

6 Hak cipta milik IPB, tahun 2008 Hak cipta dilindungi undang-undang 1. Dilarang mengutipsebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah. b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

7 KARAKTERISASI ABNORMALITAS EMBRIO SOMATIK KELAPA SAWIT (Elaeis guineensis Jacq) NESTI F. SIANIPAR Desertasi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor Pada Program Studi Agronomi Institut Pertanian Bogor SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008

8 Judul Disertasi Nama Nomor Pokok Program Studi : Karakterisasi Abnormalitas Embrio Somatik Kelapa Sawit (Elaeis guineesis Jacq) : Nesti F. Sianipar : A : Agronomi Disetujui Komisi Pembimbing (Prof. Dr. Ir. G. A. Wattimena M.Sc) Ketua (Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono) Anggota (Dr. Ir. Hajrial Aswidinnoor, M.Sc) (Dr. Nurita Toruan-Mathius, M. S) Anggota Anggota Diketahui Ketua program Studi Agronomi Dekan Sekolah Pascasarjana (Dr. Ir Munif Ghulamahdi, M.S) (Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.S ) Tanggal Ujian : 17 Januari 2008 Tanggal Lulus : 4 Februari 2008

9 Penguji pada Ujian Tertutup : Dr. Ir. Sobir M.S. (Staf Pengajar Departemen Agronomi dan Hortikultura, FAPERTA IPB) Penguji pada Ujian Terbuka : 1. Prof. Dr. Endang Sukara (Deputi Bidang Ilmu Pengetahuan Hayati LIPI) 2. Dr. Ir. Endah Retno Palupi, M.Sc (Staf Pengajar Departemen Agronomi dan Hortikultura, FAPERTA IPB)

10 PRAKATA Puji Syukur yang tak terhingga penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas segala karunia-nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Disertasi ini membuat 6 bab, beberapa bab merupakan pengembangan dari naskah artikel yang diajukan ke jurnal ilmiah. Satu bab yang telah terbit dijurnal ilmiah yaitu dengan judul Karakterisasi secara Morfologi Abnormalitas Embrio Somatik Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq) dari Eksplan Daun (Jurnal AgroBiogen No. 1, April 2007). Ucapan terima kasih dan penghargaan disampaikan kepada Komisi Pembimbing, Prof. Dr. Ir. Gustaaf A. Wattimena selaku ketua serta, Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono, Dr. Ir. Hajrial Aswidinnoor, M.Sc. dan Dr. Nurita Toruan- Mathius, M.S., masing-masing sebagai anggota yang memberikan waktu untuk berdiskusi sejak penetapan topik penelitian hingga akhir penyelesaian studi. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada : 1. Ketua Yayasan SDM-IPTEK The Habibie Center atas kesempatan dan kepercayaan beasiswa yang diberikan kepada penulis selama mengikuti pendidikan S3. 2. Dekan Sekolah Pascasarjana beserta staf, ketua Progran Studi Agronomi Sekolah Pascasarjana IPB, dan seluruh staf pengajar yang telah membekali dan memperkaya penulis dengan berbagai ilmu. 3. Dr. Ir. Sobir M.S selaku Penguji Luar Komisi pada Ujian Tertutup serta Prof. Dr. Endang Sukara dan Dr. Ir. Endah Retno Palupi, M.Sc, selaku Penguji Luar Komisi pada Ujian Terbuka. 4. Rekan-rekan mahasiswa S3 Program Studi Agronomi, Sekolah Pascasarjana IPB atas kerjasamanya dalam proses penyelesaian studi dan desertasi ini. 5. Rekan-rekan dilaboratorium Biologi Molekuler Biotrop, laboratorium Kultur Jaringan BPBPI, laboratorium Biologi IPB, laboratorium Kedokteran hewan IPB. 6. Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia atas bantuan dana penelitan lewat projek APBN dan kerja sama dengan Balai Penelitian Perkebunan Kelapa Sawit Medan diketuai oleh Dr. Nurita-Toruan Mathius. 7. Dr. Rudy Lukman, S.P., M.Si. atas bantuan deteksi genetik dengan teknik RAF yang dilaksanakan di laboratorium PT.BISI International, Kediri. 8. Dr. Diana Elisabeth S.Si., M.Si., Dr. Ir. Helen Hetharie,M.Si., Dr. Ir, Catur Herison, M.Sc., Dr. Ir Ragapadmi Purnamaningsih, M.Si. atas bantuan diskusi selama penelitian dan penulisan desertasi ini. Penghargaan dan terima kasih kepada kakak dan adik-adik tersayang atas perhatian dan toleransi yang diberikan selama penulis menghadapi masa-masa berat dalam pendidikan ini. Terima kasih tak terhingga penulis sampaikan kepada bapak Ranap Sianipar dan mama Helena Simanjuntak, berkat cinta dan kasih sayang, doa serta didikan beliau penulis mampu menempuh pendidikan formal hingga jenjang tertinggi Bogor, Januari 2008 Nesti F. Sianipar

11 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Pematang Siantar, Sumatera Utara pada tanggal 14 April 1971 sebagai anak ketiga dari pasangan Ranap Sianipar dan Helena Simanjuntak. Pada tahun 1990, penulis diterima di Fakultas Pertanian Universitas Islam Sumatera Utara, Medan dan lulus tahun Tahun 1996, penulis mendapat kesempatan untuk melanjutkan pendidikan S2 pada Program Studi Agronomi Bidang Bioteknologi Tanaman di Institut Pertanian Bogor dan lulus tahun Pada tahun 1999, penulis mendapat kesempatan mengikuti Training Course on Molecular Techniques at the technical University of Muenchen di German. Pada tahun 2002, penulis melanjutkan S3 di Progran Studi Agronomi, Institut Pertanian Bogor dengan pendalaman minat pada Biologi Molekuler Tanaman melalui beasiswa The Habibie Center. Pada tahun 2003, penulis menjadi pengajar di Universitas Kristen Krida Wacana, Jakarta. Pada tahun 2005, penulis terpilih menjadi 7 wanita ilmuan yang diselenggarakan oleh Komisi nasional Indonesia untuk UNESCO dan didukung oleh L oreal Indonesia for women in Science Sebuah artikel telah diterbitkan dengan judul Karakterisasi secara Morfologi Abnormalitas Embrio Somatik Kelapa Sawit (Elaeis guinensis Jacq) dari Eksplan Daun di jurnal AgroBiogen pada April Pada Agustus 2007, karya ilmiah berjudul Karakterisasi Abnormalitas Embrio somatik Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq) secara Morfologi dan RAPD telah disajikan di Seminar Nasional.

12 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR ISI... ix DAFTAR TABEL... xi DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN... xiii 1. PENDAHULUAN UMUM Latar Belakang... 1 Perumusan Masalah... 6 Tujuan Penelitian... 6 Hipotesis Penelitian...7 Manfaat Penelitian... 7 Peta Alir Penelitian TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq.)... 9 Media Kultur Jaringan Embrio Somatik Keragaman Somaklonal Hasil Kultur Jaringan Abnormalitas Tanaman Kelapa Sawit Hasil Kultur Jaringan. 16 Metilasi DNA Tanaman Hasil Kultur Jaringan Analisis Genotipik Embrio Somatik dengan Marka Molekuler KARAKTERISASI MORFOLOGI DAN HISTOLOGI ABNORMALITAS EMBRIO SOMATIK KELAPA SAWIT (Elaeis guineensis Jacq.) Abstrak Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil dan Pembahasan Morfologi Embrio Somatik Abnormal Histologi Embrio Somatik Abnormal Simpulan xii ix

13 4. ANALISIS ABNORMALITAS EMBRIO SOMATIK KELAPA SAWIT DENGAN TEKNIK RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHISM DNA (RAPD) DAN RAMDOMLY AMPLIFIED DNA FINGERPRINTING (RAF) Abstrak Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil dan Pembahasan Analisis Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD) Analisis Randomly Amplified DNA Fingerprinting (RAF ) Simpulan DETEKSI METILASI DNA EMBRIO SOMATIK KELAPA SAWIT (Elaeis guineensis Jacq.) DENGAN TEKNIK RANDOMLY AMPLIFIED DNA FINGERPRINGING (RAF) DAN RP-HPLC Abstrak Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil dan Pembahasan Deteksi Lokasi Metilasi Sitosin dengan Teknik RAF Kuantifikasi Metilasi Sitosin dengan Teknik RP-HPLC Simpulan PEMBAHASAN UMUM SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA x

14 DAFTAR TABEL Halaman 1. Karakteristik abnormalitas embrio somatik secara morfologi Hasil karakterisasi abnormalitas embrio somatik secara histologi Pengambilan sampel untuk isolasi DNA Komposisi reaksi PCR dengan primer RAPD Komposisi reaksi PCR dengan primer RAF Jenis, susunan oligonukleotida, jumlah pita DNA genom dari primer terseleksi Data pola pita polimorfik hasil analisis RAPD Klon 638 dan 558 kelapa sawit Jenis, susunan oligonukleotida, jumlah fragmen, jumlah fragmen polimorfik DNA yang terseleksi Data fragmen polimorfik hasil analisis RAF klon 638 kelapa sawit Perbandingan teknik analisis RAPD dan RAF pada kotiledon dan planlet Hasil deteksi lokasi metilasi sitosin DNA genom dengan metode RAF pada klon xi

15 DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Alir penelitian, tujuan dan output pada setiap data penelitian Morfologi abnormal embrio somatik tahap globular N (Normal), Ab (Abnormal) Morfologi abnormal embrio somatik tahap skutellar berbentuk hati N (Normal), Ab (Abnormal) Morfologi abnormal embrio somatik tahap kotiledon N (Normal), Ab (Abnormal) Perkembangan struktur anatomi embrio somatik abnormal pada tiga klon kelapa sawit fase globular Perkembangan struktur anatomi embrio somatik abnormal pada tiga klon kelapa sawit fase skutellar berbentuk hati Perkembangan struktur anatomi embrio somatik abnormal pada tiga klon kelapa sawit fase skutellar berbentuk hati DNA embrio somatik klon 638 dan klon a. Primer W-18. M (marker 1kb) klon 558 dan klon b. Primer SC M (marker 1kb) klon 558 dan klon Deteksi fluorescent dengan elektroferogram RAF. Primer AB-16 (5 -CCCGGATGGT-3 ) yang dilebel dengan 6-carboxy-fluorecein (FAM) DNA Genom Klon 638 (A): Marker DNA 100 ng (M), (B): ES kotiledon dipotong dengan Msp 1 dan Hpa II Deteksi fluoresen teknik RAF dengan primer AB-16 (5 -CCCGGAT GGT-3 ).yang dilabel dengan FAM (6-canboxy-fluorecein) Tanaman Kelapa Sawit klon Kandungan persentase 5-Metilcitosin dari embrio somatik (ES), planlet dan tanaman induk normal klon Kandungan persentase 5-Metilcitosin dari embrio somatik, planlet dan tanaman induk normal klon

16 DAFTAR LAMPIRAN xii Halaman 1. Profil pita DNA hasil RAPD Profil fragmen DNA hasil RAF Profil fragmen DNA hasil RAF dengan pemotongan enzim Hpa2 dan Msp Profil elusi RP-HPLC DNA genom embrio somatik dan daun planlet kelapa sawit Tabel Susunan Sekuens Primer Hasil Analisis RAF Penyimpangan Genetik dengan NTSYS Hasil Analisis RAPD Penyimpangan Genetik dengan NTSYS