SIMULASI DOCKING SENYAWA KURKUMIN DAN ANALOGNYA SEBAGAI INHIBITOR ENZIM 12-LIPOKSIGENASE GITA SYAHPUTRA

Transkripsi

1 SIMULASI DOCKING SENYAWA KURKUMIN DAN ANALOGNYA SEBAGAI INHIBITOR ENZIM 12-LIPOKSIGENASE GITA SYAHPUTRA SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

2

3 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Simulasi Docking Senyawa Kurkumin dan Analognya sebagai Inhibitor Enzim 12-Lipoksigenase adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Mei 2014 Gita Syahputra NIM G

4 RINGKASAN GITA SYAHPUTRA. Simulasi Docking Senyawa Kurkumin dan Analognya sebagai Inhibitor Enzim 12-Lipoksigenase. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan TONY IBNU SUMARYADA. Kurkumin adalah metabolit sekunder yang dihasilkan dari tanaman kunyi (Curcuma longa) dan temulawak (Curcuma xanthorrhiza) dan temulawak yang dapat dimanfaatkan sebagai terapi inflamasi. Kurkumin dapat menghambat kerja enzim lipoksigenase yang merupakan enzim pendegradasi asam arakidonat yang bertanggung jawab pada efek inflamasi Interaksi kurkumin dengan enzim 12-lipoksigenase dapat dipelajari melalui simulasi docking. Simulasi docking digunakan dalam mendesain obat secara komputasi. Dalam penelitian ini kurkumin dan analognya diinteraksikan dengan enzim lipoksigenase untuk mendapatkan interaksi yang optimum dengan parameter yang diamati adalah energi bebas Gibbs ( G) serta ikatan kimia yang terbentuk. Dalam penelitian ini menggunakan metode simulasi docking dengan aplikasi AutoDockVina. Ligan yang digunakan adalah kurkumin enol, kurkumin keto, bisdemetoksikurkumin, demetoksikurkumin, analog 1, dan analog 2 sedangkan reseptornya adalah enzim 12-lipoksigenase. Aplikasi lain yang digunakan adalah PyMol, LigPlot, dan VMD untuk persiapan ligan dan reseptor sertatoxtree untuk prediksi toksisitas berdasarkan QSAR. Hasil yang diperoleh adalah analog 2 memiliki kestabilan yang paling baik dengan nilai G sebesar -8,8 kkal/mol. Analog 2 diprediksi bersifat toksik dan berpotensi sebagai senyawa karsinogenik. Analog 1 merupakan alternatif senyawa sintetik yang potensial sebagai inhibitor enzim 12-lipksigenase berdasarkan nilai energi bebas Gibbs ( G) -8,6 kkal/mol, sifat solubilitas, geometri struktur, dan prediksi toksisitas. Gugus fungsi yang berperan dalam interaksi ligan-reseptor secara umum adalah gugus fungsi OH pada struktur aromatik, dan gugus fungsi CO pada struktur rantai tengah.berdasarkan analisis interaksi kurkumin dan analognya dapat diketahui bahwa kunyit dan temulawak dapat digunakan sebagai terapi herbal untuk mengurangi efek inflamasi. Kata Kunci :Simulasi docking, Kurkumin, Analog, Enzim 12- Lipoksigenase

5 SUMMARY GITA SYAHPUTRA. Docking Simulation of Curcumin and Its Analogs as Inhibitors on 12-Lipoxygenase Enzyme.Supervised by LAKSMI AMBARSARI and TONY IBNU SUMARYADA Curcumin is a secondary metabolite which produced from Curcuma longa and Curcuma xanthorrhiza can be used as an inflammatory therapy. Curcumin can inhibit lipoxygenase enzymes which are arachidonic acid degrading enzymes that are responsible for the inflammatory effects. Interaction of curcumin with 12-lipoxygenase enzyme can be studied through the docking simulations. Docking simulations used in computational drug design. In this study the docking of curcumin and its analogs with lipoxygenase enzymes is amiedto obtain an optimum interaction with the observed parameters like Gibbs free energy ( G) and the chemical bonds that are formed. In this research, the docking simulations were performed using AutoDockVina program. Ligans used are enolcurcumin, ketocurcumin, bisdemetoxycurcumin, demetoxycurcumin, analog 1, and analog 2 while 12- lipoxygenase enzyme was used as the receptor. PyMOL, LigPlot, and VMD were used for the data analysis in this research and for toxicity prediction, based QSAR, using AutoDockVina program The result shows that analog 2 has the best stability with G of -8.8 kcal / mole. However, analog 2 predicted to be toxic because of potentially carcinogenic compounds. Analog 1 has shown potential to become an alternative modification compound as inhibitor of the enzyme 12-lipksigenase based on the value of the Gibbs free energy ( G) -8.6 kcal / mol, solubility properties, geometry structure, and toxicity prediction. Functional groups that play a role in ligand-receptor interactions in general is OH in aromatic structures, and CO in the middle of the chain structure. Based on the analysis of the interaction of curcumin and its analogs, Curcuma longa and Curcuma xanthorriza can be used as a herbal therapy to reduce the effects of inflammation. Keywords :Docking simulation, curcumin, analog, 12-lipoxygenase enzyme

6 Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

7 SIMULASI DOCKING SENYAWA KURKUMIN DAN ANALOGNYA SEBAGAI INHIBITOR ENZIM 12-LIPOKSIGENASE GITA SYAHPUTRA Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Biokimia SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

8 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc

9 Judul Tesis : Simulasi Docking Senyawa Kurkumin dan Analognya sebagai Inhibitor Enzim 12-Lipoksigenase Nama : Gita Syahputra NIM : G Disetujui oleh Komisi Pembimbing Dr. Laksmi Ambarsari, M.S Ketua Dr. Tony Ibnu Sumaryada, M.Si Anggota Diketahui oleh Ketua Program Studi Biokimia Dekan Sekolah Pascasarjana Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc. Agr Tanggal Ujian:14 Mei 2014 Tanggal Lulus :

10 PRAKATA Puji dan syukur penulis ucapkan kehadirat Allah subhanahuwata ala atas rahmat dan karunia-nya sehingga penulisan tesis ini dapat diselesaikan. Tesis ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program studi Biokimia Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih yang sebesarbesarnya kepada : 1. Dr. Laksmi Ambarsari, M.S dan Dr. Tony Ibnu Sumaryada, M.Si selaku dosen pembimbing yang telah banyak memberikan ilmu, arahan, bimbingan, waktu, saran, dan masukan kepada penulis dalam penulisan tesis. 2. Dr. I Made Artika, M.App.Sc selaku dosen penguji luar komisi atas masukan dan saran bagi penulisan tesis ini. 3. Ibunda Anggarsih Tyas Utami dan ayahanda Gatot Mulyanto, atas segala doa, perhatian, cinta kasih, motivasi, dan dukungan yang selama ini senantiasa mengalir tak henti-hentinya kepada penulis. 4. Hari Fitriansyah dan Syahfarhan Pahlevi, kakak dan adik tersayang atas segala doa dan dukungannya kepada penulis 5. Keluarga Bude Sri Wuryani atas segala doa, dukungan, dan motivasi kepada penulis 6. Rekan seperjuangan di S2 Biokimia 2012 yang selalu menyemangati satu sama lain. 7. Pihak yang tidak dapat dituliskan satu per satu, terimakasih atas kerjasamanya. Bogor, Mei 2014 Gita Syahputra

11 DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN 1 PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Perumusan Masalah 3 Tujuan Penelitian 3 2 METODE 4 Waktu dan Lokasi Penelitian 4 Alat dan Bahan 4 Prosedur Penelitian 4 Pencarian struktur reseptor dan ligan 4 Simulasi docking 4 Evaluasi hasil docking 5 Diagram Alir Penelitian 5 3 HASIL DAN PEMBAHASAN 6 Enzim 12-Lipoksigenase (Reseptor) 6 Kurkumin dan Analognya (Ligan) 9 Sifat Ligan Berdasarkan Aturan Lipinski 12 Hasil Analisis Docking 13 Energi Bebas Gibbs ( G) 14 Interaksi Residu dangan Ligan 15 Ikatan Kimia Residu dengan Analog 2 15 Ikatan Kimia Residu dengan Asam Arakidonat 16 Ikatan Kimia Residu dengan Etodolak dengan 17 Ikatan Kimia Residu dengan Asam Kafeat, Analog 1, dan Kurkumin Keto 18 Ikatan Kimia Residu dengan Kurkumin Enol, Bisdemetoksikurkumin, dan Demetoksikurkumin 20 Toksisitas Ligan Berdasarkan QSAR 24 Diskusi Umum 25 4 SIMPULAN DAN SARAN 28 Simpulan 28 Saran 28 DAFTAR PUSTAKA 29 LAMPIRAN 33 RIWAYAT HIDUP 53 DAFTAR TABEL 1 Sifat ligan berdasarkan Aturan Lipinski 12 iii iii iii

12 2 Energi bebas Gibbs ( G) hasil docking 14 3 Ikatan hidrogen dan interaksi asam amino 22 4 Prediksi toksisitas ligan 24 DAFTAR GAMBAR 1 Struktur 5-lipoksigenase, 12-lipoksigenase, 15-lipoksigenase, dan molekul 3D3L 7 2 Struktur sekunder enzim 12-lipoksigenase 8 3 Plot Ramachandran dari enzim 12-lipoksigenase 9 4 Struktur kurkumin keto, kurkumin enol, bisdemetoksikurkumin, demetoksikurkumin 10 5 Struktur analog 1 dan analog 2 beserta gugus fungsi yang diganti dan atau ditambahkan 11 6 Struktur asam kaffeat, etodolak, dan asam arakidonat 11 7 Interaksi dua dan tiga dimensi antara analog 2 dengan reseptor 16 8 Interaksi dua dan tiga dimensi antara asam arakidonat dengan reseptor 17 9 Interaksi dua dan tiga dimensi antara etodolak dengan reseptor Interaksi dua dan tiga dimensi antara asam kaffeat dengan reseptor Interaksi dua dan tiga dimensi antara analog 1 dengan reseptor Interaksi dua dan tiga dimensi antara kurkumin keto dengan reseptor Interaksi dua dan tiga dimensi antara kurkumin enol dengan reseptor Interaksi dua dan tiga dimensi antara bisdemetoksikurkumin dengan reseptor Interaksi dua dan tiga dimensi antara demetoksikurkumin dengan reseptor Struktur kurkumin enol, bisdemetoksikurkumin, dan demetoksikurkumin dengan gugus hidroksi (OH) dan keton (CO) yang berperan dalam ikatan hidrogen Gugus yang berperan dalm sifat karsinogen pada analog 2 25 DAFTAR LAMPIRAN 1 Jenis 20 asam amino 34 2 Kontak residu dengan ligan 35 3 Persiapan ligan dan protein target 36 4 Simulasi docking 40 5 Pengamatan interaksi hasil docking 46 6 Hasil deteksi rotatable bond ligan 47 7 Nilai G ligan dengan reseptor 50

13 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Salah satu cara tubuh untuk mempertahankan diri dari agen patologis adalah dengan melakukan tindakan inflamasi. Ciri-ciri makroskopik dari proses inflamasi yaitu, rubor (merah), tumor (bengkak), dolor (nyeri), kalor (panas), dan penurunan fungsi tubuh. Agen patologis penyebab inflamasi adalah mikroba, benda tajam, suhu, sinar X atau UV, listrik, zat kimia, dan lainnya. Inflamasi yang terjadi terus menerus akan menyebabkan berbagai penyakit hingga terjadinya proliferasi sel kanker (Kumar et al, 2005, Underwood, 2004, Constantinides, 1993) Siklooksigenase (SOX) dan lipoksigenase (LOX) pada manusia merupakan enzim yang berperan terhadap degradasi asam arakidonat melalui membran fosfolipid. Siklooksigenase mengubah asam arakidonat menuju prostaglandin, sedangkan lipoksigenase mengubah asam arakidonat menjadi asam hidroperoksieikosatetranoat (HPETE) dan menjadi hidroksieikosatetraenoat (HETE) atau menjadi leukotrien. Prostaglandin dan leukotrien merupakan senyawa yang bertanggung jawab pada terjadinya inflamasi. Pengobatan inflamasi yang dilakukan selama ini menggunakan obat jenis NSAID (Non Steroidal Antiinflamatory Drugs), tetapi obat tersebut memiliki efek samping pada gastrointestinal, yaitu dapat menyebabkan iritasi lambung dan pendarahan (Wong et al. 2001). Terapi herbal merupakan salah satu alternatif pengobatan inflamasi salah satunya menggunakan kurkumin. Kurkumin adalah metabolit sekunder dapat dimanfaatkan sebagai terapi antiinflamasi. Kurkumin dilaporkan dapat menghambat kinerja enzim lipoksigenase (LOX) yang merupakan enzim pendegradasi asam arakidonat. Kurkumin memiliki ketahanan terhadap ph lambung (Kumar et al, 2007, Tanu, et.al, 2002, Wong et.al, 2001, Jankun, et.al. 2000, Jankun et.al. 2006, Huang et.al. 1995, Aggrawal, et.al, 2008). Namun, efek kurkumin terhadap enzim 12-lipoksigenase belum banyak diketahui interaksi kestabilannya. Hal tersebut dapat diketahui secara in silico menggunakan metode simulasi docking. Kunyit (Curcuma longa) dan temulawak (Curcuma xanthorhiza) merupakan tanaman yang biasa digunakan dan merupakan komoditas bahan alam andalan Indonesia. Kedua tanaman tersebut dilaporkan mengandung senyawa kurkuminoid yang bermanfaat untuk terapi suatu penyakit. Temulawak mengandung turunan kurkuminoid berupa kurkumin dan demetoksikurkumin, adapun pada kunyit mengandung kurkumin, demetoksikurkumin, dan bisdemetoksikurkumin (Kertia & Sudarsono, 2005). Dalam perkembangannya, kurkumin dilaporkan memiliki beberapa manfaat antara lain sebagai antioksidan (Majed, et al. 1995, Rao, et al. 1993), antikanker (Huang, et.al. 1995, Aggrawal, et.al, 2008, Shisodia, et.al, 2007, Kunnumakkara, et.al, 2008a, Kunnumakkara, et.al, 2008b), anti-hiv (Mazmuder et.al, 1997, Barthelemy, et.al, 1998, Jagetia, et.al, 2007), hepatoprotektif dan neproprotektif (Goel, et.al, 2008). Beberapa negara seperti India, Cina, dan negara-negara Asia Tenggara seperti Indonesia, memanfaatkan zat warna kuning dari kurkumin sebagai bahan tambahan makanan, bumbu, maupun obat-obatan yang tidak berakibat toksik (Meiyanto,

14 2 1999). Kurkuminoid diketahui berpotensi sebagai antiinflamasi (Jankun, et.al. 2000, Jankun et.al. 2006, Huang et.al. 1995, Aggrawal, et.al, 2008). Berdasarkan hasil analisis struktur kurkumin, secara farmakologi aktivitas kurkumin terdapat pada gugus-gugus fungsionalnya seperti ikatan rangkap pada rantai tengah, gugus gugus β-diketon, dan gugus hidroksi fenolik. Aktifitas antiinflamasi oleh kurkumin terdapat pada gugus fungsi hidroksi fenolik (Mukhopadhyay et.al, 1982). Penelitian mengungkapkan bahwa kurkumin dapat menghambat enzim 12-lipoksigenase pada trombosit manusia. Kurkumin dengan dosis tertentu dapat menekan pembentukan leukotrien. Hasil penelitian menyebutkan bahwa dosis kurkumin 5-10 µm berpotensi menghambat metabolisme asam arakidonat sekitar 50% (Huang et.al. 1995) Penggunaan senyawa analog kurkumin digunakan untuk pengembangan kandidat obatn dengan mencari senyawa yang berpotensi memiliki aktivitas farmakologi yang sama dengan kurkumin. Strategi yang digunakan adalah dengan mencari senyawa baru dengan dua cara, yaitu: (1) modifikasi struktur dan turunan kurkumin serta (2) formulasi. Penelitian hingga kini banyak dilakukan modifikasi analog dan turunan kurkumin, untuk memperoleh senyawa yang lebih potensial, stabil, aman, dan memiliki aktivitas yang lebih spesifik (Ritmaleni dan Ari Simbara, 2010). Modifikasi struktur senyawa kurkumin secara in silico diharapkan dapat menjadi langkah awal desain senyawa obat sebelum dilakukan penelitian secara in vivo dan in vitro. Selain itu, pendekatan secara in silico dapat memberikan keuntungan yaitu menghemat biaya dan waktu penelitian. Modifikasi struktur molekul berguna untuk mendapatkan struktur yang lebih stabil dalam berinterksi dengan protein target (enzim 12-lipoksigenase). Modifikasi struktur senyawa kurkumin bertujuan untuk mengetahui kandidat obat yang potensial berdasarkan kemampuan interaksinya (interaksi inhibisi) dengan enzim yang berkaitan dengan aktivitasnya. Salah satu modifikasi struktur senyawa kurkumin yaitu Pentagamavunon-0 (PGV-0) (Yuwono, T dan Oetari, R.A, 2004). Adelin (2013) melakukan penelitian dengan memodifikasi struktur kurkumin dan melihat pengaruh inhibisi terhadapat enzim siklooksigenase-2 secara in silico. Penelitian mengenai interaksi molekular antara 12-lipoksigenase dengan kurkumin, bisdemetoksikurkumin, dan demetoksikurkumin telah dilakukan oleh Utami (2009), Tasbichaty (2010), dengan menganalisis dinamika molekularnya. Akan tetapi, energi bebas Gibbs ( G) yang didapatkan memiliki nilai G positif, yang menunjukan tidak adanya interaksi antara enzim 12-lipoksigenase dengan kurkumin dan kedua turunan alaminya. Selain itu penelitian lain yang serupa telah dilakukan oleh Edwita (2012), tetapi penelitian tersebut tidak menggambarkan kestabilan interaksi dengan perhitungan energi bebas Gibbs ( G) dan tidak diketahui residu yang terlibat dengan enzim. Simulasi docking dalam penelitian ini menggunakan piranti lunak AutoDock Vina. Reseptor yang digunakan adalah enzim 12-lipoksigenase dan ligan yang digunakan adalah kurkumin enol, kurkumin keto, bisdemetoksikurkumin, demetoksikurkumin, analog 1, dan analog 2. Tahap awal adalah persiapan reseptor dan ligan. Reseptor diamati kestabilannya dengan Plot Ramachandran sedangkan ligan diamati sifat hidrofob/hidrofil dengan aturan Lipinski. Parameter yang diamati dalam docking adalah kestabilan konformasi reseptor-ligan melalui nilai G dan interksi ligan-reseptor. Tahap akhir adalah evaluasi hasi docking dengan mengamati interaksi ligan-reseptor melalui piranti lunak PyMol dan LigPlot ++.

15 3 Prediksi toksisitas (QSAR) dari ligan diamati dengan ToxTree. Manfaat penelitian ini dapat digunakan sebagai informasi ilmiah kandidat obat dari bahan aktif senyawa kurkumin dan analognya sebagai inhibitor enzim 12-lipoksigenase. Perumusan Masalah Pemanfaatan kurkumin telah dilakukan secara empirik oleh masyarakat tanpa adanya suatu kontrol. Kurkumin tersebut dilaporkan dapat menjadi terapi herbal untuk penyembuhan penyakit. Beberapa penelitian menyebutkan bahwa kurkumin dapat menginhibisi enzim 12-lipoksigenase sehingga dapat mengurangi efek inflamasi. Pemanfaatan kurkumin dan turunannya sebagai terapi herbal suatu penyakit belum diketahui senyawa aktif spesifik yang bertanggung jawab dalam mengurangi efek inflamasi. Melalui teknik in silico, penelitian ini dapat diketahui interaksi antara kurkumin dan analognya sebagai inhibitor enzim 12- lipoksigenase. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan energi bebas Gibbs ( G) dan interaksi ikatan kimia yang terbentuk antara kurkumin dan analognya terhadap enzim 12-lipoksigenase dengan simulasi docking. Penelitian ini juga menentukan senyawa analog kurkumin terbaik sebagai inhibitor enzim 12-lipoksigenase

16 2 METODE Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli - Desember 2013 di Laboratorium Komputer, Departemen Fisika, Institut Pertanian Bogor (IPB), Bogor, Jawa Barat. Alat dan Bahan Penelitian ini dilakukan secara in silico sehingga alat yang digunakan berupa seperangkat peralatan komputer. Bahan pada penelitian in silico tidak menggunakan bahan alami, tetapi menggunakan struktur kimia enzim 12- lipoksigenase, kurkumin dan analognya yang dapat diunduh melalui situs database. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini dibagi dalam dua kelompok, yaitu piranti keras dan piranti lunak. Piranti keras yang digunakan dalam penelitian memiliki spesifikasi Random Access Memory (RAM) 12GB, prosesor Intel Core i7 3,3 GHz. Perangkat computer tersebut telah dilengkapi piranti lunak Marvin Sketch 6.0, AutoDock Vina, PyMol 1.3, LigPlot , VMD. Bahan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah struktur molekul enzim 12-lipoksigenase, kurkumin enol, kurkumin keto, bisemetoksikurkumin, demetoksikurkumin, serta dua buah analog (analog 1 dan analog 2). Kontrol agonis adalah subtsrat asam arakidonat yang berikatan secara normal dengan enzim 12-lipoksigenase, sedangkan sebagai kontrol antagonis digunakan etodolak dan asam kaffeat. Data struktur kristal 3 dimensi (3D) dari enzim 12- lipoksigenase diunduh dari RSCB PDB (Berman et.al 2000) Prosedur Penelitian Pencarian struktur reseptor dan ligan Tahap awal untuk melakukan simulasi docking adalah menentukan reseptor dan ligan yang akan diuji. Reseptor yang digunakan berupa enzim 12- lipoksigenase. Struktur protein target dapat diunduh melalui situs adapun struktur ligan dapat diperoleh dengan menggambarkan struktur 2 dimensi (2D) dan 3 dimensi (3D) pada piranti lunak MarvinSketch. Simulasi docking diperlukan struktur 3D dari protein target dan ligan. Sebelum melakukan simulasi docking, data-data struktur molekul dan data lainnya disimpan dalam satu folder pada satu direktori kerja. Sebelum dilakukan simulasi docking perlu dilakukan analisis sifat bioavaibilitas ligan dengan menggunakan aturan Lipinski (Lipinski, 2007). Protein yang akan dilakukan simulasi docking perlu dilakukan analisis struktur sekunder dan posisi ramachandran dengan menggunakan piranti lunak VMD. Prosedur penelitian lengkap dapat dilihat pada lampiran 3. Simulasi docking Setelah mendapatkan protein target dan ligan, maka simulasi docking siap dilakukan. menggunakan piranti lunak AutoDock Vina. Protein target dan ligan

17 5 yang akan dilakukan simulasi menggunakan format.pdbqt yang merupakan format untuk molekul yang telah ditambahkan muatan atom. Kalkulasi docking menggunakan algoritma Lamarckian Genetic Algorithm (LGA). Setiap ligan yang disimulasi dilakukan replikasi sebanyak sepuluh kali untuk mendapatkan energi bebas Gibbs ( G) yang terbaik. Prosedur penelitian lengkap dapat dilihat pada lampiran 4. Evaluasi hasil docking Tahap terakhir adalah evaluasi hasil docking dengan menggunakan piranti lunak Ligplot ++ dan PyMol. Hasil yang didapatkan adalah interaksi antara kurkumin dengan enzim 12-lipoksigenase. Penentuan konformasi protein dengan ligan hasil docking dengan memilih konformasi ligan yang memiliki energi bebas Gibbs ( G) yang paling rendah. Analisis ikatan hidrogen dan residu kontak antara ligan dan protein target dapat diamati dengan menggunakan piranti lunak Ligplot ++ dengan format.pdb. Prosedur penelitian lengkap dapat dilihat pada lampiran 5 Diagram Alir Penelitian Ligan -Pencarian struktur kurkumin dan analognya -Penggambaran struktur 2D -Konversi menjadi struktur 3D -Mendapatkan aturan lipinski Struktur kurkumin dan analog Simulasi Docking AutoDock Vina Reseptor -Pengunduhan molekul protein -Penghilangan molekul air -Penghilangan molekul kontaminan -Melihat plot Ramachandran Struktur enzim 12-lipoksigenase Hasil Docking -Pengaturan grid box -Pendeteksian rotatable bond -Interaksi protein dan ligan -Mendapatkan energi bebas Gibbs ( G) Analisis Energi bebas Gibss ( G) Ikatan Hidrogen Interaksi Hidrofob Prediksi Toksisitas (QSAr)

18 3 HASIL DAN PEMBAHASAN Docking adalah metode yang digunakan untuk memprediksikan orientasi antara satu molekul dengan molekul yang lainnya ketika terjadi suatu gaya satu sama lain untuk membentuk suatu ikatan yang stabil (Langauer dan Rarey, 1996). Prinsipnya adalah teknik penempatan ligan ke dalam sisi aktif reseptor yang dilanjutkan dengan evaluasi molekul berdasarkan konformasi struktur dan sifat seperti elektrostatik (Kroemer, 2003). Simulasi docking dapat dipergunakan untuk memperoleh mekanisme kerja suatu senyawa kimia atau makromolekul seperti protein maupun peptida, dalam skala molekuler sehingga dimungkinkan untuk mendesain obat berbasis struktur (Ali et.al, 2007). Kegunaannya adalah pembuatan konformasi ligan-protein. Pada program penambatan, proses pencarian posisi dengan mengkondisikan ligan bersifat fleksibel dan protein bersifat kaku. Setiap posisi dievaluasi berdasarkan bentuk dan karakteristik seperti elektrostatik untuk menemukan posisi yang paling disukai (Okimoto et al. 2009) Enzim 12-Lipoksigenase (Reseptor) Tahap awal pada penelitian ini adalah pencarian struktur reseptor dan ligan. Reseptor adalah makromolekul yang digunakan sebagai target spesifik dari penambatan suatu ligan (obat, hormon, neurotransmiter), sedangkan ligan adalah senyawa dengan bobot molekul kecil yang terikat spesifik pada reseptor (Okimoto et al. 2009). Struktur ligan disiapkan menggunakan piranti lunak MarvinSketch, sedangkan struktur reseptor diunduh dari Protein Data Bank (PDB) pada website Tahap ini bertujuan untuk mempersiapkan reseptor dan ligan untuk dapat dilakukan simulasi docking. Protein Data Bank (PDB) adalah arsip dari data struktural makromolekular biologis yang mencakup lebih dari struktur. Data tersebut terdiri atas proyek yang menyumbangkan struktur, pengidentifikasi target, nama protein, organism sumber, status produksi (klon, ekspresi, dan kristalisasi), referensi terkait, serta link untuk proyek terkait. Protein target dapat dicari berdasarkan nama protein, nama pengidentifikasi target, sekuens yang mirip, program, atau organism asal. Hasil yang disimpan dalam format FASTA,.txt, dan.pdb (Kouranov et al. 2006). MarvinSketch merupakan aplikasi untuk menggambar struktur kimia yang dapat menampilkan karakteristik dari struktur tersebut dengan menggunakan menu-menu yang disediakan. Hasil yang didapatkan pada tahap ini adalah struktur enzim 12-lipoksigenase yang diunduh dari PDB dengan indeks 3D3L, sedangkan ligan yang digunakan adalah kurkumin enol, kurkumin keto, bisdemetoksikurkuimin, demetoksikurkumin, analog 1, dan analog 2 yang strukturnya dirancang melalui Marvin Sketch merujuk pada database NCBI (National Center for Biotechnology Information). Lipoksigenase yang terdapat pada manusia terdiri atas tiga bentuk isozim, yaitu 5-lipoksigenase (EC ), 12-liposkigenase (EC ), dan 15- lipoksigenase (EC ) (gambar 1a, 1b, 1c) (Brash 1999). Enzim 12- lipoksigenase merupakan protein globular dengan indeks pada PDB (Protein Data Bank) adalah 3D3L (A crystal structure of lipoxygenase domain of human

19 7 arachidonate 12-lipoxygenase, 12S-type (CASP Target)). Makromolekul 3D3L adalah struktur enzim 12-lipoksigenase yang berikatan dengan Fe (zat besi). Makromolekul 3D3L terdapat pada sitoplasma sel pada jaringan kulit manusia. Protein 3D3L merupakan monomer dengan dua subunit (gambar 1d), yang tiap subunitnya memiliki 663 residu asam amino. Kristal 3D3L memiliki resolusi 2,6 Å dan menempati volume sebesar 5,9 x 7,0 x 7,8 nm 3 (Tresaugues, 2008). Struktur protein 3D3L memiliki dua subunit, tetapi hanya digunakan salah satu subunitnya saja. Hal ini didasarkan pada penelitian Tresaugues (2008), yang melaporkan bahwa kedua subunit memiliki jumlah, urutan asam amino, sifat fisik serta asam amino pengikat ligan yang sama. (a) (b) (c) Gambar 1 Struktur (a) 5- lipoksigenase, (b) 12-lipoksigenase (c) 15-lipoksigenase, dan (d) molekul 3D3L Struktur protein yang diunduh dari PDB umumnya memiliki struktur protein yang masih mengandung molekul pelarut (air), dan residu lainnya. Dalam simulasi docking diperlukan struktur protein tersebut dihilangkan molekul ligan (d)

20 8 dan air. Penghilangan molekul ligan dan air digunakan untuk mendapatkan struktur sekunder 3D3L dan kemudian disimpan dalam format.pdb (gambar 1b). Struktur dari enzim 12-lipoksigenase yang telah siap untuk dilakukan simulasi docking (gambar 2) Struktur sekunder merupakan rantai polipeptida yang membentuk susunan yang ikatan hidrogen teratur di antara ikatan peptida. Struktur α-heliks dan β-sheet terbentuk akibat adanya ikatan hidrogen di dalam atau di luar rantai. Ikatan hidrogen memberikan stabilitas yang tinggi pada α-heliks dan β-sheet (Lehininger, 1982) Keterangan: : lembaran beta : spiral alfa : putaran : tidak ada struktur sekunder : spiral phi : spiral 3/10 : belokan : jembatan beda Gambar 2 Struktur sekunder enzim 12-lipoksigenase (sumber: Hasil pengamatan struktur sekunder (PDB) dapat diketahui bahwa enzim 12- lipoksigenase terdiri atas 44% α-heliks dan 4% β-sheet. Adapun 52% strukturnya merupakan struktur turn dan loop. Turn dan loop merupakan struktur sekunder yang menghubungkan struktur α-heliks dan β-sheet dengan panjang bervariasi dan bentuk tak beraturan (Ngili, 2013). Residu pada enzim 12-lipoksigenase yang dapat membentuk struktur turn maupun loop adalah prolin, treonin, atau serin. Prolin yang memiliki struktur imidazol sedangkan treonin dan serin memiliki struktur alifatik yang fleksibel untuk membentuk struktur loop dan turn. (Ngili, 2013) Berdasarkan plot Ramachandran digunakan terlihat bahwa enzim 12- lipoksigenase merupakan struktur yang stabil (gambar 3).

21 9 Ψ I II III Φ Gambar 3 Plot Ramachandran dari enzim 12-lipoksigenase menggunakan VMD Hasil yang didapatkan bahwa plot Ramachandran yang dimiliki oleh enzim 12-lipoksigenase menunjukan bahwa lebih dari 90% residu asam amino terdapat pada daerah hijau atau biru (kuadran I dan III). Adapun residu yang berada di luar wilayah hijau biru (kuadran II dan IV) merupakan asam amino yang memiliki halangan sterik yang besar, sehingga menurunkan jumlah konformasi yang terbentuk, seperti residu Glisin (Gly).. Sudut phi (Φ) dan psi (Ψ) menggambarkan koordinat tiga dimensi protein. Sudut phi terbentuk sepanjang ikatan N Cα, sedangkan sudut psi terbentuk sepanjang ikatan Cα C. Setiap residu asam amino memiliki sudut phi dan psi tertentu untuk membentuk struktur sekunder yang stabil. Asam amino yang berada pada koordinat I stabil pada struktur β-sheet paralel dan antiparalel, adapun koordinat II menggambarkan asam amino yang stabil pada α-helix (tangan kiri). Koordinat III merupakan asam amino yang stabil pada struktur α-helix (tangan kanan), sedangkan koordinat IV merupakan ditempati oleh asam amino dengan halangan sterik yang besar (Ngili, 2013) Kurkumin dan Analognya (Ligan) Ligan yang digunakan dalam penelitian ini adalah senyawa kurkumin dan analognya yaitu kurkumin enol dan keto, bisdemetoksikurkumin, demetoksikurkumin, analog 1, dan analog 2. Struktur ligan dapat diketahui dari website Sebelum dilakukan simulasi docking, ligan disiapkan dengan cara menggambar struktur dalam struktur dua dimensi kemudian diubah menjadi tiga dimensi dalam format.pdb menggunakan Marvin Sketch (gambar 4) Kurkumin dan analognya memiliki struktur dasar yang sama, dengan adanya dua gugus benzena dan rantai alifatik ditengahnya. Kurkumin keto memiliki gugus metoksi (OCH 3 ) dan hidroksi (OH) pada kedua gugus benzena, sedangkan pada rantai tengah adanya gugus diketon (CO) (gambar 4a). Kurkumin enol (gambar 4b) memiliki struktur yang sama dengan kurkumin keto, hanya berbeda pada rantai tengahnya, kurkumin keto menambahkan satu gugus hidroksi (OH) pada gugus diketon (CO) pada kurkumin keto. Struktur bisdemetoksikurkumin IV

22 10 dan demetoksikurkumin (gambar 4c dan 4d) memiliki struktur yang hampir mirip, keduanya memiliki gugus hidroksifenolik pada kedua gugus benzena. Rantai tengah kedua struktur tersebut memiliki gugus hidroksi dan keton. Namun pada demetoksikurkumin memiliki perbedaan dengan adanya tambahan gugus metoksi pada salah satu gugus benzena. (a) (b) (c) (d) Gambar 4 Struktur (a) kurkumin keto (b) kurkumin enol (c) bisdemetoksikurkumin (d) demetoksikurkumin Penggunaan ligan (kurkumin dan analognya) adalah merujuk pada aktifitas farmakologinya sebagai penghambat eznim 12-lipoksigenase. Kurkumin memilik efek farmakologi sebagai antiinflamasi dengan menghanmbat enzim 12- lipoksigenase (Nardo et al. 2009). Penelitian membuktikan bahwa respon imun oleh kurkumin memainkan peranan penting dalam pengobatan inflamasi (Srivastava et al. 2010). Kurkumin memperlihatkan aktivitas antiinflamasi dan antipoliferasi dengan menurunkan oksidatif reaktif (ROS/reactive ocygen species) (Ravindran et al. 2010). Kurkumin juga dilaporkan dapat menghambat pembentukan sel kanker, seperti kanker prostat, kanker payudara, dan kanker paru-paru (Nie et al. 1998), (Natarajan et al. 1997), (Soriano et al. 1999). Mekanisme antiinflamasi yang terlibat dalam potensi antikanker adalah: (1) penghambatan NF-kB dan COX-2 (peningkatan kadar COX-2 berhubungan dengan jenis kanker) (Surh et.al, 2001., Huang, et.al. 1991),(2) penghambatan metabolisme asam arakidonat melalui enzim lipoksigenase dan pengikatan radikal bebas oleh jalur enzimatik ini (Huang, et.al. 1991), (3) penurunan ekspresi inflamasi IL-1b, Il-6, dan TNF-α, yang mengakibatkan hambatan pertumbuhan sel kanker (Cho et.al, 2007), (4) penghambatan regulasi enzim seperti protein kinase C, yang dapat bertindak sebagai agen inflamasi dan proliferasi sel tumor (Liu et.al, 1993). Analog 1 dan 2 (gambar 5a dan 5b) merupakakan senyawa sintetik yang strukturnya mirip dengan kurkumin. Penelitian ini menggunakan dua analog kurkumin yang telah dimodifikasi oleh Ohtsu, H et.al. (2002). Penggunakan dua analog tersebut karena kedua analog tersebut mempertahankan topografi struktur kurkumin, sehingga diharapkan memiliki aktivitas biologi yang sama, selain itu modifikasi senyawa kurkumin diharapkan sebagai usaha untuk mengembangkan

23 11 kandidat obat baru. Analog kurkumin yang digunakan dalam penelitian ini dipilih yang memiliki gugus fungsi yang ditambahkan atau diganti dengan gugus hidroksi (-OH) atau metoksi (-OCH 3 ). Gugus fungsi pada analog dengan gugus yang lebih polar memungkinkan adanya interaksi yang lebih baik terhadap residu asam amino enzim 12-lipoksigenase. (a) (b) Gambar 5 Struktur (a) analog 1 (b) analog 2 beserta gugus fungsi yang diganti dan atau ditambahkan Ligan yang digunakan sebagai kontrol dalam penelitian ini merupakan obat antiinflamasi yang telah digunakan yaitu etodolak dan asam kaffeat. Kontrol lainnya merupakan asam arakidonat yang merupakan ligan alami dari enzim 12- lipoksigenase. (a) (b) (c) Gambar 6 Struktur (a) asam kaffeat (b) etodolak, dan (c) asam arakidonat Struktur asam kaffeat (gambar 6a) memiliki struktur yang rigid dengan adanya tiga buah rotatable bond (lampiran 6), dengan adanya gugus benzena dengan dua buah gugus OH yang tersubstitusi orto.struktur etodolak (gambar 6b) memiliki struktur yang rigid, dengan memiliki lima buah rotatable bond, yaitu ikatan yang dapat berotasi. Jumlah rotatable bond mempengaruhi fleksibilitas struktur dalam berinteraksi dengan residu dari reseptor, makin banyak rotatable bond, maka makin fleksibel senyawa tersebut. Struktur etodolak memiliki struktur benzena dan imidazol dengan tambahan gugus alkil dan karboksilat. Struktur

24 12 asam arakidonat (gambar 6c) merupakan asam lemak essensial yang tersusun dari 20 atom C dengan empat ikatan rangkap. Alasan penggunaan asam kafeat dan etodolak merujuk pada struktur dari keduanya yang memiliki cincin siklik yang dimiliki juga oleh kurkumin (gambar 6), asam kafeat dan etodolak dilaporkan menghambat spesifik pada enzim 12- lipoksigenase. Sifat Ligan Berdasarkan Aturan Lipinski Pemilihan ligan dan analognya serta kontrol yang digunakan dalam penelitian ini selanjutnya dilakukan analisis menggunakan aturan Lipinski. Aturan Lipinski dapat menunjukan tingkat hidrofob/hidrofilitas molekul obat sebelum dilakukan simulasi docking. Aturan Lipinski tersebut adalah (1) berat molekul kurang dari 500 Da (2) logp kurang dari 5, (3) jumlah donor ikatan hidrogen kurang dari 5, dan (4) jumlah akseptor ikatan hidrogen kurang dari 10 (Lipinski et.al, 1997). Berdasarkan data dari tabel 3 dapat dilihat bahwa kurkumin dan analognya memiliki berat molekul kurang dari 500 mg/mol, nilai hydrogen bond donor maupun acceptor, dan nilai log P yang memenuhi kriteria dari Aturan Lipinski. Tabel 1 Sifat ligan berdasarkan Aturan Lipinski Nama Struktur Kurkumin enol Kurkunin keto Bisdemetoksikurkumin Demetoksikurkumin Analog 1 Analog 2 Etodolak Asam kafeat Asam arakidonat Rumus Struktur C 21 H 20 O 6 C 21 H 36 O 6 C 19 H 16 O 4 C 20 H 18 O 5 C 22 H 22 O 6 C 24 H 26 O 6 C 17 H 21 NO 3 C 11 H 12 O 2 C 20 H 32 O 2 Berat Molekul 368, , , , , , , , ,4669 Log P 3,76 2,18 4,07 3,92 3,9 4,45 3,44 2,87 6,59 Jumlah donor ikatan hidrogan Jumlah akseptor ikatan hidrogen Sifat fisikokimia ligan berdasarkan aturan Lipinski digunakan untuk menentukan karakter hidrofobik/hidrofilik suatu senyawa untuk melalui membran sel secara difusi pasif. Nilai log P menyatakan koefisien kelarutan dalam lemak/air yang memiliki rentang -0,4 5. Berat molekul yang lebih dari 500 Da tidak dapat berdifusi menembus membran sel dengan cara difusi pasif. Semakin besar nilai log P, maka semakin hidrofobik molekul tersebut. Molekul yang memiliki sifat terlalu hidrofobik cenderung memiliki tingkat toksisitas yang tinggi karena akan tertahan lebih lama pada lipid bilayer dan terdistribusi lebih luas di dalam tubuh sehingga selektifitas ikatan terhadap enzim target menjadi berkurang. Nilai log P yang terlalu negatif juga tidak baik karena jika molekul tersebut tidak dapat melewati membran lipid bilayer. Jumlah donor dan akseptor ikatan hidrogen mendeskripsikan semakin tinggi kapasitas ikatan hidrogen, maka semakin tinggi energi yang dibutuhkan agar proses absorpsi dapat terjadi. Secara umum aturan

25 13 Lipinski menggambarkan solubilitas senyawa tertentu untuk menembus membran sel oleh difusi pasif (Lipinski et.al, 1997). Hasil Analisis Docking Simulasi docking bertujuan untuk mengetahui orientasi antara kurkumin dan analognya terhadap enzim 12-lipoksigenase untuk membentuk ikatan yang stabil. Adapaun parameter kestabilan yang ditentukan adalah energi bebas Gibbs ( G) dan interaksi ikatan kimia yang terbentuk. Simulasi docking merupakan pendekatan untuk desain rasional obat menggunakan komputasi untuk menguji aktivitas biologis suatu senyawa. (Giraldo et.al, 2007, Reddy et.al, 2007) Docking merupakan metode simulasi untuk mengetahui orientasi antara ligan dengan reseptor. Proses docking terbagi atas dua jenis, yaitu blind docking dan oriented docking. Blind docking merupakan proses docking yang dilakukan tanpa mengetahui letak sisi aktif dari reseptor dengan tepat, sedangkan oriented docking merupakan proses docking yang dilakukan dengan telah mengetahui letak sisi aktif dari reseptor dengan tepat. Penelitian ini dilakukan dengan proses blind docking, karena belum mengetahui parameter grid box dari enzim 12- lipoksigenase. Reseptor yang digunakan bersifat rigid sedangkan ligan besifat fleksibel. (Giraldo et.al, 2007, Reddy et.al, 2007) AutoDock Vina adalah salah satu piranti lunak docking, dirancang untuk memprediksikan bagaimana molekul-molekul kecil seperti substrat atau inhibitor terikat pada reseptor dalam bentuk struktur 3D. Pada dasarnya, AutoDock Vina terdiri dari dua program utama, yaitu AutoDock yang membantu proses docking dari ligand ke sekumpulan grids yang mendiskripsikan protein yang dituju, AutoGrid yang membantu perhitungan grids tersebut. Hal ini dapat digunakan sebagai pedoman dalam perancangan struktur kimia agar diperoleh ikatan yang lebih baik lagi. Bahan yang telah siap dipreparasi dengan parameter AutoGrid, kemudian dilakukan validasi menggunakan kontrol. Setelah itu, dilakukan penambatan dan dilakukan analisis visual dengan piranti lunak tertentu (Lindstrom, et. al. 2008, O. Troot dan A.J Olson, 2010) Proses docking pada AutoDock Vina menggunakan algoritma Lamarckian Genetic Algorithm (LGA). Algoritma tersebut merupakan penggabungan antara algoritma Local Search dan Genetic Algorithm. Nilai energi hasil docking dipengaruhi oleh search run, yang merupakan pengulangan yang dilakukan dalam proses docking (Samira, 2009). Penelitan ini dilakukan pengulangan sebanyak 10 kali dalam sekali docking, sehingga akan dihasilan 10 pose pada ligan untuk mendapatkan energi bebas Gibbs ( G) terbaik (Lampiran 7) Sebelum dilakukan simulasi docking format.pdb pada ligan dan reseptor harus diubah ke dalam format.pdbqt. Format.pdb pada ligan dan reseptor menunjukan tidak adanya muatan pada molekul tersebut, sedangkan format.pdbqt menunjukan adanya muatan parsial pada masing-masing atom. Proses persiapan lain yang dilakukan sebelum dilakuan simulasi docking adalah persiapan ligan dengan mengetahui jumlah rotatable bond dari ligan. Hal ini digunakan untuk mengetahui fleksibilitas suatu ligan. Semakin banyak jumlah rotatable bond, ligan yang digunakan makin fleksibel (Lampiran 6). Proses lain yang perlu disiapkan adalah penentuan grid box untuk menentukan ruang rotasi ligan terhadap posisi reseptor. Penelitian ini menggunakan grid box yang besar, agar ligan dapat

26 14 berotasi bebas untuk mencari tempat paling stabil pada reseptor (Samira, 2009). Koordinat grid box yang digunakan adalah x=-0,722, y=-4,000 dan z=-6,889 Energi Bebas Gibbs ( G) Reseptor dengan Ligan Simulasi docking pada penelitian ini dilakukan dalam kondisi ligan fleksibel. Kondisi fleksibel digunakan untuk penyesuaian struktur ligan yang paling stabil berinteraksi dengan reseptor. Parameter kestabilan yang diamati adalah energi bebas Gibbs ( G). Semakin negatif nilai G menunjukan tingkat kestabilan yang baik antara ligan dan reseptor, sehingga ikatan yang terbentuk akan semkain kuat. Tabel 2 menunjukan energi bebas Gibbs ( G) hasil simulasi docking. Hasil simulasi docking berdasarkan nilai G menyatakan kurkumin dan analognya memiliki kestabilan yang baik. Hasil simulasi docking yang dilakukan sebanyak 10 kali memiliki 10 pose hasil docking yang memiliki energi ikatan masing-masing. Analog 2 memiliki kestabilan yang paling baik merujuk dari nilai G (-8,8 kkal/mol). Kurkumin dan analognya memiliki nilai G lebih rendah dari asam arakidonat yang merupakan ligan alami dari enzim 12-lipoksigenase (tabel 2) Hal ini menyatakan bahwa kurkumin dan analognya memiliki kestabilan yang lebih baik dibanding ligan alami (asam arakidonat). Kurkumin dan analognya dilaporkan menunjukan aktivitas antiinflamasi dengan menghambat metabolisme asam arakidonat melalui enzim lipoksigenase dan menghambat radikal bebas pada jalur enzimatik tersebbut (Huang et.al, 1991) Asam arakidonat akan menghasilkan leukotrien akibat reaksi enzimatik oleh enzim 12-lipoksigenase sehingga dapat terjadinya inflamasi. Senyawa kurkumin dan analognya dilaporkan dapat menghambat pembentukan leukotrien sehingga menghambat terjadinya inflamasi (Wong et.a, 200l) Sedangkan, etodolak dan asam kafeat memiliki nilai ( G) yang lebih tinggi dari pada senyawa kurkumin dan analognya. Hal ini dapat diartikan bahwa senyawa kurkumin dan analognya dapat berikatan lebih stabil terhadap reseptor enzim 12-lipoksigenase. Senyawa kurkumin dan analognya diprediksi memiliki aktivitas inhibitor terhadap enzim 12-lipoksigenase. Beberapa penelitian mengenai nilai G dari interaksi kurkumin dengan beberapa protein telah dilakukan. Penelitian Zukhrullah, et.al (2012) menyatakan bahwa interaksi kurkumin dengan siklooksigenase-2 menghasilkan nilai G sebesar -6,51 kkal/mol. Putra, et.al (2008) melaporkan nilai G kurkumin dengan reseptor estrogen alfa sebesar -11, 17 kkal/mol. Hal ini dapat dinyatakan bahwa nilai interaksi kurkumin dengan enzim 12-lipoksigenase termasuk stabil dan baik. Tabel 2 Energi bebas Gibbs ( G) hasil docking No. Nama Senyawa Energi Bebas Gibbs ( G (kkal/mol)) 1 Kurkumin enol -8,4 2 Kurkumin keto -8,3 3 Bisdemetoksikurkumin -7,8 4 Demetoksikurkumin -7,3 5 Analog 1-8,6 6 Analog 2-8, Etodolak Asam kaffeat Asam arakidonat -7,8-6,5-7,1

27 15 Ikatan Kimia Residu dengan Ligan Pengamatan interaksi residu (asam amino) bertujuan untuk mengidentifikasikan interaksi yang terjadi antara ligan dan reseptor. Ikatan hidrogen meruapakan interaksi yang dapat menstabilkan ikatan ligan dengan reseptor. Interaksi lain antara ligan dan reseptor yang dapat meningkatkan kestabilan konformasi adalah interaksi elektrostatik dan interaksi van der Walls. Pengamatan interaksi residu menggunakan piranti lunak PyMol untuk pengamatan 3D dan LigPlot untuk pengamatan 2D. Garis putus-putus mendeskripsikan ikatan hidrogen yang terjadi antara residu dengan gugus pada ligan. Ikatan Kimia Residu dengan Analog 2 Analog 2 merupakan ligan yang memiliki kestabilan yang baik dengan enzim 12-lipoksigenase dibandingkan dengan ligan lainnya karena memiliki nilai G yang lebih rendah (Tabel 2). Energi yang rendah menunjukan bahwa ligan tersebut stabil ketika berikatan dengan reseptor. Faktor-faktor yang menyebabkan analog 2 dan enzim 12-lipoksigenase memiliki interaksi kestabilan yang baik adalah adanya peran gugus fungsi, ikatan hidrogen (jumlah ikatan hidrogen dan panjang ikatan hidrogen) yang terbentuk, dan daerah interkasi hidrofob. (Giraldo et.al, 2007, Reddy et.al, 2007) Residu yang memiliki interaksi baik ikatan hidrogen maupun interaksi hidrofobik adalah Val (190), Leu (194), Leu (597), Ser (594), Glu (356), Gln (547), Cys (559), Ile (593), Gln (590), Phe (352), Leu (361), His (365), His (360). Pengamatan menunjukan adanya ikatan hidrogen yang terjadi antara Glu (356) dengan salah satu gugus keton pada analog 2 dengan jarak 3.01 Ā. Ikatan hidrogen tersebut terjadi dengan cara atom O pada gugus Glu (356) merupakan residu asam amino bermuatan negatif pada gugus karboksil (COO) dengan atom O dari gugus keton (CO) pada analog 2 (gambar 7). Gugus keton cenderung sebagai akseptor pada ikatan hidrogen, karena memiliki kecenderungan kuat untuk menarik elektron. Hal ini sesuai dengan laporan dari Mukhopadhyay et.al. (1982) yang menyatakan bahwa gugus keton merupakan daerah aktivitas farmakologi kurkumin sebagai antiinflamasi. Adanya residu asam amino hidrofobik seperti Val (190), Leu (194), Leu (597), Leu (361) dan adanya residu Phe (352), Ile (593), Ser (594), merupakan residu yang menjadi target interaksi dengan ligan. Interaksi hidrofobik merupakan interaksi antara gugus nonpolar molekul ligan dan daerah nonpolar reseptor. Interaksi hidrofobik mampu menstabilkan interaksi ligan-reseptor dengan menurunkan nilai G karena interaksi tersebut merupakan paduan antara ikatanikatan yang interaksinya lemah seperti ikatan van der Waals, dipol-dipol, dan elektrostatik. Daerah interaksi hidrofobik analog 2 dengan enzim 12-lipoksigenase sesuai dengan Penelitian dari Tasbichaty (2010) yang menyatakan bahwa residu Phe (352), Ile (593), Ser (594), dan Val (418) merupaan residu penting dalam pengkitan dengan ligan. Hal ini dikarenakan nilai RMSF (Root Mean Square Fluctuation) keempat residu tersebut memiliki fleksibilitas yang rendah. Analog 2 terikat stabil pada daerah hidrofobik tersebut yang menghasilkan nilai energi bebas Gibbs ( G) yang paling baik dibanding analog 1, yaitu sebesar (-8,8

28 16 kkal/mol). Selain itu adanya ikatan hidrogen menambah stabil ikatan antara analog 2 dengan beberapa residu asam amino pada enzim 12-lipoksigenase. (a) (b) Gambar 7 Interaksi dua dimensi (a) dan tiga dimensi (b) antara analog 2 dengan reseptor Ikatan Kimia Residu dengan Asam Arakidonat Residu yang memiliki kontak adalah Gly (309), Leu (311), Lys (310), Trp (647), Leu (645), Glu (226), Tyr (230), Leu (227), Leu (233). Hasil pengamatan memperlihatkan adanyaa satu ikatan hidrogen antara gugus amina (NH3) 3 pada Leu (311) sebagai donor proton dengan gugus hidroksi (OH) dari asam arakidonat sebagai akseptor proton (gambar 8). Asam arakidonat merupakan ligan alami dari enzim 12-lipoksigenasee tetapi tidak terikat stabil pada sisi aktif enzim 12- lipoksigenase. Nilai G asam arakidonat sebesar -7,1 kkal/mol, apabila dibandingkan dengan analog 2 maka nilai G lebih tinggi. Hal ini dapat dilihat dari struktur dari asam arakidonat yang memiliki struktur karbon lurus, berbeda dengan struktur analog 2 yang memiliki dua struktur aromatik pada strukturnya. Struktur aromatik mempengaruhi kestabilan pengikatan antara analog 2 dengan enzim 12- lipoksigenase. Selain itu struktur aromatik yang nonpolar pada anolog 2 dapat menarik residu-residu pada enzim 12-lipoksigenase, untuk membentuk interaksi hidrofobik. Hal ini dapat dilihat bahwa ada 13 residu asam amino yang berinteraksi hidrofobik dengan analog 2, berbeda dengan asam arakidonat yang hanya 9 residu asam amino. Konformasi stabil asam arakidonat tidak berada disekitar daerah residu hidrofob penarik ligan, sehingga kurang stabilnya interaksi ligan dengan reseptor. Ikatan hidrogen juga mempengaruhi lebih stabilnya interaksii analog 2 dibanding asam arakidonat. Jumlah ikatan hidrogen pada asam arakidonat dan analog 2 adalah satu buah. Namun, perbedaanya terjadi antara gugus fungsi yang terlibat dalam ikatan hidrogen dan panjang ikatan hidrogen. Gugus yang terlibat

29 17 dalam ikatan hidrogen pada analog 2 adalah pada gugus karboksil (COO) dengan atom O dari gugus keton (CO) lebih kuat terikat daripada gugus amina (NH 3 ) dan gugus hidroksi (OH). Kekuatan ikatan tersebut mempengaruhi panjang ikatan hidrogen, pada analog 2 panjang ikatan yang terbentuk adalah 3,01 Ā, sedangkan pada asam arakidonat sebesar 3,18 Ā. (a) (b) Gambar 8 Interaksi dua dimensi (a) dan tiga dimensi (b) antara asam arakidonat dengan reseptor Ikatan Kimia Residu dengan Etodolak Residu yang memiliki kontak adalah Leu (311), Gly (309), Glu (226), Leu (645), Leu (459), Trp (647), Tyr (230), Lys (310), Leu (233) (gambar 9) ). Etodolak merupakan bahan aktif yang biasa digunakan sebagai inhibitor enzim 12- lipoksigenase. Nilai G antara etodolak dengan enzim 12-lipoksigenase adalah sebesar -7,8 kkal/mol lebih tinggi dibandingkan dengan analog 2. Ikatan hidrogen pada etodolak berjumlah tiga buah yaitu pada kedua atom O1 dan O2 pada daerah karboksilat (COO). Atom O1 memiliki satu ikatan hidrogen dengan gugus OH pada Tyr (230) dengan panjang 3,09 Ā, sedangkan atom O2 memiliki dua ikatan dengan gugus OH pada Tyr (230) dengan panjang 3,08 Ā, dan dengan gugus COO pada Trp (647) dengan panjang 2,96 Ā. Etodolak memiliki lebih banyak ikatan hidrogen dari pada analog 2, tetapi belum mampu membuat nilai G lebih rendah. Hali ini dapat dipengaruhi oleh: (1) Residu hidrofob yang berada disekeliling ligan. Residu-residu penarik ligan tidak berada di sekeliling etodolak (2) jumlah residu hidrofob lebih sedikit dari analog 2 (3) struktur etodolak tidak memiliki struktur alifatik sehingga kurang fleksibel dalam berinteraksi dengan enzim 12- lipoksigenase. Fleksibilitas struktur etodolak dapat dilihat dari pengamatan 3D dimana strukturnya terlihat kaku. Berdasarkan jumlah rotatable bond, etodolak memiliki 5 buah lebih sedikit dari jumlah rotatable bond analog 2 berjumlah 10 buah.

30 18 (a) (b) Gambar 9 Interaksi dua dimensi (a) dan tiga dimensi (b) antara etodolak dengan reseptor Ikatan Kimia Residu dengan Asam Kafeat, Analog 1, dan Kurkumin Keto Residu yang memiliki kontak adalah Cys (221), Leu (227), Trp (647), Lys (310), Gly (309), Tyr (230), Asp (224), Glu (226) (gambar 10). Hasil pengamatan memperlihatkan tidak adanya ikatan hidrogen antara asam kaffeat dengan residu asam amino pada enzim 12-lipoksigenase. Nilai G asam kaffeat merupakan yang paling tinggi diantara ligan lainnya (-6,5 kkal/mol) diprediksi bahwa konformasi terhadap enzim 12-lipoksigenase kurang stabil. Hal ini disebabkan karena secara struktural asam kaffeat mempunyai gugus benzene 1,2-diol, inti hidrokarbon relatif rigid, sehingga tidak dapat membentuk atom yang bersifat nukleofilik atau elektrofilik untuk pembentukan ikatan hidrogen dengan ligan. Residu asam amino disekitar ligan asam kaffeat bukan merupakan residu pengikat ligan dan residu asam amino disekitar ligan jumlahnya hanya delapan buah, sehingga interaksi pengikatan ligan-reseptor lemah. Interaksi antara analog 1 dengan kurkumin keto memiliki persamaan interaksi hidrofob pada enam residu yaitu His (365), His (360), Val (190), Phe (352), Glu (356), Leu (361) (gambar 11 dan 12). Keenam residu tersebut merupakan residu penting dalam pengikatan ligan maupun binding site ligan. Apabila dibandingkan dengan interaksi hidrofob pada asam kaffeat, tidak ada residu yang sama pada analog 1 maupun kurkumin keto. Hal ini dapat menjadi salah satu asumsi kestabilan asam kaffeat lebih lemah dibanding analog 1 maupun kurkumin keto.

31 19 (a) (b) Gambar 10 Interaksi dua dimensi (a) dan tiga dimensi (b) antara asam kaffeat dengan enzim 12 lipoksigenase (a) (b) Gambar 11 Interaksi dua dimensi (a) dan tiga dimensi (b) antara analog 1 denganenzim 12 lipoksigenase Pengamatan menunjukan tidak adanya ikatan hidrogen yang terjadi antara analog 1 dan kurkumin keto. Ikatan kimia yang memungkinkan terjadi adalah ikatan-ikatan lemah seperti ikatan van der Waals, yang memiliki energi sekitar 0,4 sampai 40 kj/mol (Companion, 1991). Interaksi hidrofoik dengan banyak residu berperan dalam kestabilan ligan-reseptor.

32 20 (a) (b) Gambar 12 Interaksi dua dimensi (a) dan tiga dimensi (b) antara kurkumin dengan reseptor Nilai energi bebas Gibbs ( G) yang rendah dari analog 1 (-8,6 kkal/mol) maupun kurkumin keto (-8,3 kkal/mol) dari pada asam kafeat dihasilkan dari interaksi hidrofob ligan-protein. Struktur ligan analog 1 maupun kurkumin keto juga mempengaruhi kestabilan dikarenakan adanya struktur alifatik yang memiliki fleksibilitas yang lebih tinggi sehingga dapat menghasilkan konformasi yang stabil dengan energi paling minimum. Ikatan Kimia Residu dengan Kurkumin Enol, Bisdemetoksikurkumin, dan Demetoksikurkumin Residu asam amino yang memiliki kontak dengan kurkumin enol. Residu yang memiliki kontak adalah Cys (559), Ile (593), Gln (590), Ser (594), Glu (356), His (360), His (365), Leu (361), Arg (189), Val (190), Leu (597), Phe (352) (gambar 13). Terdapat tiga ikatan hidrogen yang menyebabkan kurkumin enol memiliki nilai G yang kecil yaitu pada gugus hidroksi (OH) pada dua gugus amina (NH 3 ) residu Arg (189), masing-masing memiliki jarak 3,17 dan 3,08 Ā. Ikatan hidrogen salah satu faktor yang menentukan kestabilan dari konformasi ligan-reseptor dengan menghasilkan G sebesar -8,4 kkal/mol. Residu asam amino yang memiliki kontak dengan bisdemetosi kurkumin. Residu yang memiliki kontak adalah Leu (311), Lys (310), Gly (457), Asn (308), Tyr (230), Leu (645), Leu (459), Trp (647), Glu (226) (gambar 14). Nilai G yang dihasilkan sebesar -7,8 kkal/mol. Secara umum gugus keto (CO) pada bisdemetoksikrukumin memiliki ikatan hidrogen pada Trp (647) dan Tyr (230), sedangkan ikatan hidrogen lainnya terjadi pada hidroksi (OH) dengan Leu (311), ketiga ikatan hidrogen tersebut mempengaruhi ikatan antara ligan-reseptor.

33 21 (a) (b) Gambar 13 Interaksi dua dimensi (a) dan tiga dimensi (b) antara kurkumin enol dengan enzim 12 lipoksigenase (a) (b) Gambar 14 Interaksi dua dimensi (a) dan tiga dimensi (b) antara bisdemetoksikurkumin dengan enzim 12 lipoksigenase Berdasarkan interaksi antara bisdemetoksikurkumin dengan enzim 12- lipoksigenase, ada sekitar tujuh residu yang sama dengan residu yang berinteraksi asam arakidonat (lampiran 2). Hal ini menyatakan bahwa lokasi konformasi stabil dari bisdemetoksikurkumin sama dengan lokasi konformasi stabil dari asam

34 22 arakidonat. Terdapat tujuh residu yang sama yaitu Leu (311), Lys (310), Gly (457), Tyr (230), Leu (645), Trp (647), Glu (226). Berdasarkan lokasi konformasi stabil, bisdemetoksi merupakan satu satunya ligan diluar kontrol yang memiliki kesamaan lokasi dengann asam arakidonat. (a) (b) Gambar 15 Interaksi dua dimensi (a) dan tiga dimensi (b) antara demetoksikurkumin dengan enzim 12 lipoksigenase Residu asam amino yang memiliki kontak dengan demetosikurkumin. Residu yang memiliki kontak adalah Gln (590), Ile (593), Leu (597), Leu (194), Leu (193), Val (190), Arg (189), Glu (369), Leu (366), His (365), His (360), Phe (352) (gambar 15). Demetoksikurkumin memiliki empat ikatan hidrogen, dua buah pada gugus keton (CO), dan dua buah gugus hidroksi (OH). Berdasarkan hasil pengamatan interaksi antara reseptor dengan ligan yang dapat dianalisis adalah jarak ikatan masing masing ligan dengan gugus fungsi yang berperan (tabel 3) Pengamatan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik bertujuan untuk mengetahui interaksi antara ligan dan reseptor enzim 12-lipoksigenase. Menurut IUPAC ikatan hidrogen adalah suatu interaksi elektrostatik antara atom hidrogen yang terikat pada atom elektronegatif dengan atom elektronegatif lainnya. Ikatan hidrogen dapat terjadi antara intermolekul dan intramolekul. Rentang ikatan hidrogen yang baik adalah berada pada 2,5-3,5 Ā. Pengamatan ikatan hidrogen menggunakan piranti lunak LigPlot ++. Interaksi yang terjadi antara ligan dan reseptor enzim 12-lipoksigenase tidak hanya ikatan hidrogen, karena adanya keterbatasan piranti lunak, hanya ikatan hidrogen yang dapat diketahui. Ikatan kimia selain ikatan hidrogen dapat terjadi akibat ligan yang fleksibel berinteraksi dengan reseptor. Interaksi dapat berupa interaksi non kovalen atau non ikatan (non-bonded interaction) yang terjadi antara ligan dan reseptor dapat meningkatkan afinitas ligan terhadap reseptor. Ikatan yang paling umum terjadi adalah interaksi elektrostatik dan ikatan van der Waals.

35 23 Tabel 3 Ikatan hidrogen dan interaksi asam amino Senyawa Hasil Simulasi Docking Jarak ikatan (Ā) Kurkumin enol Kurkumin keto Bisdemetoksikurkumin Demetoksikurkumin Analog 1 Analog 2 Etodolak Asam kafeat Asam arakidonat ,07 3,13 2, ,01 2,96 3,08 3,09-3,18 Asam amino dan gugus fungsi yang berikatan Arg (189) NH 3 -OH Arg (189) NH 3 -OH - Trp (647) NH 3 -CO Tyr (230) OH-CO Leu (311) NH 3- OH Arg (189) NH 3 -OH Arg (189) NH 3 -OH His (360) NH 3 -CO His (365) NH 3 -CO - Glu (356) COO-CO Trp (647) COO-COO Tyr (230) OH-COO Tyr (230) OH-COO - Leu (311) NH 3 -CO Ikatan hidrogen dan asam amino yang berinteraksi antara reseptor enzim 12- lipoksigenase. Semua ligan kecuali kurkumin keto, analog 1, dan asam kafeat tidak ditemukan ikatan hidrogen, kemungkinan ikatan yang terjadi adalah ikatan elektostatik atau van der Waals. Ikatan hidrogen dapat membantu kestabilan antara ligan dan protein target. Data pada table 5 dapat disimpulkan bahwa jarak ikatan hidrogen yang terbentuk antara ligan dengan reseptor pada rentang 2,5-3,5 Ā (tabel 3) Gambar 16 Struktur kutkumin enol (a), bisdemetoksikurkumin (b), dan demetoksikurkumin (c) dengan gugus hidroksi (OH) dan keton (CO) yang berperan pada ikatan hidrogen

36 24 Secara umum, ikatan hidrogen kurkumin dan analognya dipengaruhi oleh gugus fungsi OH pada struktur aromatik, dan gugus fungsi CO pada struktur rantai tengah pada residu Arg (189) (gambar 16). Hal ini sesuai dengan laporan dari Mukhopadhyay et.al (1982) yang menyatakan bahwa gugus hidroksi pada struktur aromatik dan gugus keton pada rantai tengah struktur kurkumin memiliki aktivitas farmakologi. Penelitian ini sejalan dengan pernayataan tersebut bahwa terdapat ikatan hidrogen pada gugus-gugus fungsi tersebut ( tabel 3) Toksisitas Ligan Berdasarkan QSAR Eksplorasi dan usaha mensinteis dan mendesain stuktur senyawa aktif sebagai kandidat obat yang aman terus dikembangkan. Dalam mengetahui kandidat obat dari suatu senyawa tertentu perlu dilakukan uji toksisitas agar aman digunakan oleh manusia. Pengujian toksisitas secara in silico diharapkan berguna untuk membantu uji toksisitas dalam skala laboratorium agar lebih efektif dan efisien dalam penggunaan waktu, pendanaan serta mengurangi faktor coba-coba. Pengujian toksisitas secara in silico dapat mengurangi penggunaan hewan sebagai bahan uji karena adanya masalah etika (Antonio, et.al, 2009). Industri kimia dn farmasi mengidentifikasikan senyawa baru yang diusulkan sebagai bahan aktif obat sebelum diproduksi dalam skala industri Prediksi sifat toksisitas ligan bertujuan untuk mengetahui karakter daya toksisitas dari masing-masing ligan. Toksisitas ligan dapat diprediksi dengan metode QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship). Prediksi toksisitas dengan metode QSAR berdasarkan bentuk dan struktur molekul suatu senyawa dapat dimungkinkan untuk memprediksi jenis efek yang ditimbulkan. Prediksi yang digunakan adalah adanya hubungan kuantitatif antara sifat mikroskopis (struktur molekul) dengan sifat makroskopis (Lee et.al, 1996) Toksisitas ligan diprediksi menggunakan piranti lunak ToxTree 2.6. Tabel 4 Prediksi toksisitas berdasarkan aturan Benigni/Bossa No Prediksi Toksisitas KE KK BDK DK A1 A2 ED AK 1 Peringatan struktur untuk sifat genotoksik karsinogenik 2 Peringatan struktur untuk sifat nongenotoksik karsinogenik 3 Potensi karsinogen berdasarkan QSAR 4 Potensi mutasi oleh S.typhimurium berdasakan QSAR 5 Tidak bersifat genotoksik karsinogenik 6 Tidak bersifat nongenotoksik karsinogenik Ket: KE: Kurkumin enol KK: Kurkumin keto BDK: Bisdemetoksi kurkumin DK: Demetoksi kurkumin A1: Analog 1 A2: Analog 2 ED: Etodolak AK: Asam kaffeat

37 25 Aturan Benigni/Bossa memiliki beberapa parameter yaitu peringatan struktur yang bersifat karsinogenik yang diturunkan dan tidak diturunkan, adanya potensi mutasis oleh S.Typhimurium dengan prediksi uji Ames, dan adanya sifat karsinogen yang diturunkan atau tidak diturunkan berdasarka prediksi uji in vitro. Prediksi toksistas berdasarkan aturan Benigni/Bossa didasarkan pada keberadaan sifat mutagen dan karsinogen berdasarkan gugus-gugus dari struktur kimia masing-masing ligan (Benigni et.al, 2008) (tabel 4). Sifat toksisitas berdasarkan aturan Benigni/Bosa menggambarkan bahwa struktur dari analog 2 diprediksi merupakan bahan karsinogenik yang tidak diturunkan. Berdasarkan analisis gugus fungsi, yang menyebabkan analog 2 bersifat karsinogenik adalah adanya gugus asam n-alkilkarboksilat. Gugus asam n-alkilkarboksilat akan menyediakan radikal bebas yang dapat mengganggu sistem tubuh. Berikut ini adalah lokasi gugus yang berperan, pada gambar 16 Gambar 17 Gugus yang berperan dalam sifat karsinogen pada analog 2 Analog 2 merupakan ligan yang bersifat karsinogen, untuk mengetahui batas aman sifat karsinogennya perlu dilakukan uji lanjutan tentang tingkat toksisitas senyawa tersebut melalui aturan Cramer (1978). Aturan Cramer menjelaskan tingkat toksisitas senyawa melalui oral dibagi ke dalam tiga kelas. Kelas I (rendah) merupakan senyawa dengan tingkat toksisitas rendah berdasarkan struktur kimia dan efisiensi metabolisme yang baik di dalam tubuh. Kelas II (menengah) berdasarkan pada senyawa yang tidak terlalu toksik seperti kelas I, namun memiliki struktur yang memiliki efisiensi metabolisme yang tidak baik seperti kelas III. Kelas III (tinggi) berdasarkan pada tingginya tingkat toksisitas dari gugus fungsi yang reaktif pada struktur senyawa tersebut. Berdasarkan aturan Cramer, analog 2 termasuk ke dalam kelas III, yang termasuk jenis senyawa dengan tingkat toksisitas yang tinggi. Oleh karena itu analog 2 tidak dapat digunakan sebagai kandidat obat, karena bersifat toksik walaupun dalam konsentrasi rendah. Toksisitas analog 2 juga dipengaruhi oleh logp dari aturan Lipinski. Nilai log P dari analog 2 adalah 4,45 yang hampir mendekati angka 5. Nilai log P tersebut memiliki sifat terlalu hidrofobik cenderung memiliki tingkat toksisitas yang tinggi karena akan tertahan lebih lama pada lapisan lipid pada membrane sel dan terdistribusi lebih luas di dalam tubuh. Nilai log P mempengaruhi kelarutan ligan agar dapat berdifusi menembus membran sel (Lipinski et.al, 1997) Diskusi Umum Simulasi docking dapat mengetahui orientasi antara kurkumin dan analognya terhadap enzim 12-lipoksigenase untuk membentuk konformasi interaksi yang paling stabil. Kestabilan konformasi interaksi dapat diketahui melalui energi yang diperlukan untuk melakukan interaksi ( G). Nilai G yang makin rendah

38 menyatakan bahwa interaksi antara kurkumin dan analognya makin stabil. Paramater kestabilan juga dilihat dari interaksi yang terjadi antara ligan dan reseptor, diketahui melalui ikatan hidrogen, ikatan hidrofob dan interaksi kimia lain yang membentuk kestabilan antara ligan dan reseptor. Prediksi toksisitas dengan QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) dapat memberikan prediksi toksisitas ligan berdasarkan struktur suatu senyawa. Potensi kurkumin dan analognya sebagai inhibitor enzim 12-lipoksigenase dapat diperoleh dari nilai G dan interaksi yang terbentuk antara ligan dengan reseptor. Potensi ligan yang akan dijadikan kandidat suatu obat harus memiliki prediksi toksisitas dengan QSAR yang aman baik secara mutagen dan karsinogen. Kandidat obat yang akan dikembangkan dengan pengujian lebih lanjut (in vivo dan in vitro) diharapkan memiliki kestabilan yang baik antara ligan dengan reseptor serta tidak memiliki prediksi toksisitas yang buruk baik secara mutagen maupun karsinogen. Berdasarkan hasil yang didapatkan kurkumin dan analognya memiliki konformasi yang stabil dibandingkan dengan kontrol yang digunakan (asam arakidonat, etodolak, dan asam kaffeat). Beberapa faktor yang menyebabkan nilai G yang lebih rendah dari kontrol adalah: (1) kurkumin dan analognya terikat stabil pada residu residu pengikat ligan Phe (352), Ile (593), Ser (594), dan Val (418), (2) terikat pada residu binding site enzim 12-lipoksigenase His (360), His (365), His (540), Asn (544), dan Ile (663) (3) truktur kurkumin dan analognya yang memiliki topografi struktur yang relatif sama, sehingga daerah pengikatan dengan residu hidrofobik yang relatif sama (4) gugus fungsi yang terlibat adalah OH dan CO yang tepat pada daerah aktivitas farmakologi kurkumin. Analog 2 merupakan ligan paling stabil dalam hal stabilitas terikat pada residu enzim 12-lipoksigenase. Kestabilan tersebut dilihat dari G (-8,8 kkal/mol) dan konformasi ligan terikat pada residu residu pengikat ligan dengan adanya ikatan hidrogen. Namun, analog 2 yang diprediksi dengan QSAR bersifat toksik pada gugus asam n-alkilkarboksilat. Sebagai kandidat inhibitor enzim 12- lipoksigenase, analog 2 tidak dapat digunakan walaupun ligan tersebut adalah ligan paling stabil terikat pada enzim 12-lipoksigenase. Bisdemetoksikurkumin merupakan kandidat senyawa yang memiliki lokasi konformasi kestabilan yang sama dengan ligan alami (asam arakidonat). Hal ini dapat menyatakan bahwa bisdemetoksikurkumin berpotensi pada penghambatan enzim 12-lipoksigenase dengan terikat pada binding site asam arakidonat. Hasil simulasi docking dan prediksi QSAR didapatkan bahwa kurkumin, bisdemetoksikurkumin, dan demetoksikurkumin yang terdapat pada kunyit dan temulawak berpotensi sebagai inhibitor enzim 12-lipoksigenase. Hal ini dapat menyatakan bahwa ketiga ligan tersebut memiliki interaksi yang baik dan prediksi toksisitas yang aman. Kunyit dan temulawak yang mengandung bahan aktif kurkumin dapat dinyatakan bahwa kedua tanaman herbal tersebut berpotensi sebagai antiinflamasi dan aman untuk dikonsumsi oleh masyarakat. Dalam perkembangannya, kunyit dan temulawak dilaporkan memiliki beberapa manfaat antara lain sebagai antioksidan (Majed, et al. 1995, Rao, et al. 1993), antikanker (Huang, et.al. 1995, Aggrawal, et.al, 2003, Shisodia, et.al, 2007, Kunnumakkara, et.al, 2008a, Kunnumakkara, et.al, 2008b), antivirus (Bourne, 1999), anti-hiv (Mazmuder et.al, 1997, Barthelemy, et.al, 1998, Jagetia, et.al, 2007), hepatoprotektif dan neproprotektif (Goel, et.al, 2008). Beberapa 26

39 negara seperti India, Cina, dan negara-negara Asia Tenggara seperti Indonesia, memanfaatkan zat warna kuning dari kunyit sebagai bahan tambahan makanan, bumbu, maupun obat-obatan yang tidak berakibat toksik (Meiyanto, 1999). Kunyit diketahui berpotensi sebagai antiinflamasi (Jankun, et.al. 2000, Jankun et.al. 2006, Huang et.al. 1995, Aggrawal, et.al, 2008). 27

40 4 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Kurkumin dan analog 1 memiliki interaksi dengan kestabilan yang baik terhadap enzim 12-lipoksigenase. Gugus fungsi yang berperan dalam interaksi ligan-reseptor secara umum adalah gugus OH pada struktur aromatik (benzena), dan gugus fungsi CO pada struktur rantai tengah. Residu yang berperan dalam interaksi ligan dengan reseptor pada asam amino Arg (189). Simulasi docking dapat memberikan informasi bahwa kunyit dan temulawak yang digunakan oleh masyarakat selama ini terbukti secara ilmiah memiliki potensi sebagai antiinflamasi. Saran Analog 2 yang merupakan senyawa modifikasi yang harus dihindari untuk disintesis dan digunakan karena terbukti bersifat karsinogen. Struktur senyawa kontrol yang digunakan disarankan mirip dengan struktur ligan yang akan diuji. Penelitian ini dapat dilakukan dengan melakukan eksplorasi dan modifikasi ligan yang dapat digunakan sebagai inhibitor enzim 12-lipoksigenase yang lebih aman. Selain itu disarankan melakukan simulasi dinamika molekuler untuk menguji interaksi dari kompleks enzim 12-lipoksigenase dengan kurkumin dan analognya. Pengujian in silico dan in vitro digunakan sebagai langkah lanjutan untuk menguji potensi dari kurkumin dan analognya sebagai antiinflamasi.

41 DAFTAR PUSTAKA Aggarwal BB, Kumar A, Bharti AC Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies. Anticancer Res. 23, Ali, H. I Antitumor studies. Part 3: Design, synthesis, antitumor activity, and molecular docking study of novel 2-methylthio-, 2-amino and 2-(Nsubstituted amino)-10-alkyl-2-deoxo-5-deazaflavins. Bioorganic & Medicinal Chemistry Annual Reports in Medicinal Chemistry, 1-10 Barthelemy, S., L. Vergnes, M. Moynier, D. Guyot, Labidalle, and E. Bahraoui Curcumin and curcumin derivatives inhibit Tat-mediated transactivation of type 1 human immunodeficiency virus long terminal repeat. Research in Virology149, Berman, H.M, Westbrook, J., Feng, Z, Gilliland, G., Bhat, T.N., Weissig, H., Shidyyalov, I.N., Bourne, P.E The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research Vol 28, Brash, Alan Lipoxygeneses: Occurrence, Functions, Catalysis, and Acquisition of Substrate. The Journal of Biological Chemistry, 34, Chen, Q,Y., Duniec, Z.M., Liu, Biu., Hagmann, W., Gao, Xiang., Shimoji, Katsuichi, Marnett, J.L., Johnson, C.R., Honn, K.V Endogenous 12(S)-HETE production by tumor cell and its role in metastasis. Cancer Research 54, Cho J.W, Lee K.S, Kim C.W Curcumin attenuates the expression of IL- 1beta, IL-6, and TNF-alpha as well as cyclin E in TNF-alpha-treated HaCaT cells; NF-kappaB and MAPKs as potential upstream targets. Int J Mol Med. 19, Companion, A.L Ikatan Kimia edisi kedua. ITB Press, Bandung Constantinides,P General Pathobiology. Appleton & Lange, Norwalk, Connecticut. Delano, W.L PyMOL User Guide. Duvoix, A, Blasius, Delhalle, Schnekneburger, Morceau, Henry, Dicato, Diederich Chemopreventative and therapeutic effects of curcumin. Cancer Letters, 223, Edwita, A.P Analisis Dinamika Molekuler Senyawa Kompleks 12- Lipoksigenase dengan Kurkumin dan Dua Turunannya. Skripsi Sarjana Farmasi. Departemen Farmasi, FMIPA, UI: Depok\ Goel A., Kunnumakkara A.B, Aggarwal, B.B Curcumin as Curecumin : From Kitchen to Clinic. Biochem Pharmacol. 75: Henderson W.R., Jr The role of leukotrienes in inflammation. Ann Intern Med. ;121: Huang M.T, Lysz T, Ferraro T Inhibitory effects of curcumin on in vitro lipoxygenase and cyclooxygenase activities in mouse epidermis. Cancer Res. 51, Huang, M.T., Ma, W., Lou, Y.R., Lu, Y.P., Chang, R., Newmark, L.N., and Conney, A.H Inhibitory Effect of Curcumin on Tumorigenesis in

42 Mice, Proceeding International Symposium on Curcumin Pharmacochemistry, August 1995, Yogyakarta, Indonesia Huerta, L., Haseltine, F., Liu, Y., Gregory, D., Seto, B (2001). NIH Working Definition of Bioinformatics and Computational Biology. Jagetia. G.C., Aggarwal, B.B Spicing up of The Immune System by Curcumin. J Clin Immunol. 27: Jankun, E.S., McCabe N.P., Selman. S.H., Jankun. J Curcumin inhibits lipoxygenase by binding to its central cavity: theoretical and X-ray evidence. International Journal of Molecuklar Medicine 6, Jankun, Jerzy., Aleem, A.M., Malgorzewicz, Sylvia., Szkudlarek, M., Zavodszky, M.I., DeWitt, L.D., Feig, M., Selman, S.H., Jankun, E.S Synthetic curcuminoids modulate the arachidonic acid metabolism of human platelet 12-lipoxygenase and reduce sprout formation of human endothelial cells. Mol Cancer Ther 5, Kertia, N dan Sudarsono, 2005, Prospek Manfaat Rimpang Temoe Lawak bagi Kesehatan, Seminar Nasional Obat Tradisional, Dies Fakultas Farmasi UGM tanggal 25 September 2005 di Yogyakarta. Kouranov, A., Xie, L., Cruz, la, J.d., Chen, L., Westbrook, J.,et al The RSCB PDB Information Portal for Structural Genomic, Nucleic Acid Research, Kroemer, R.T Molecular modelling probes: docking and scoring, Biochemical Transactions. 31, Kumar, Abbas, Fausto (eds) Robbin s and Cotran Pathologic Basis Of Disease. Elsevier Saunder, Philadelpia, Pennsylvania. 7 th ed. Kunnumakkara, A.B (a)., Anand, P., Aggarwal, B.B Curcumin Inhibots Proliferation, Invasion, Angiogenesis and Metastasis of Different Cancers Through Interaction with Multiple Cell Signaling Proteins Kunnumakkara, A.B (b)., Diagaradjane, P., Guha, S., Deorukhar A., Shentu, S., Aggrawal, B.B., et,al Curcumin Sensitizes Human Colorectal Cancer Xenografts in Nude Mice to Gamma-Raiation by Targeting Nuclear FactorkappaB-Regulated Gene Products. Clin Cancer Res Lee, K.W., Kwon, S.Y., Hwang, S., Lee, J.U., Kim, H., Quantitative Structure Activity Relationship (QSAR) Study on C-7 Subtituted Quinolone, Bull. Korean Chem. Soc., 17, Lehninger, A.L Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga, Jakarta Lengauer T, Rarey M Computational methods for biomolecular docking. Curr OpinStruct Biol. Jun;6(3): Review. PubMed PMID: Lindstrom, W., Morris, G.M., Weber, C., Huey, R Using AutoDock 4 for Virtual Screening. La Jolla Majeed M., Badmaev V., Shivakumar U, and Rajendran R Curcuminoids- Antioxidant Phytonutrients. Nutriscience Publishers, Inc., Piscataway, New Jersey Mazumder, A., N. Neamati, S. Sunder, J. Schultz, H. Pertz, E. Eich, and Y. Pommier Curcumin analogs with altered potencies against HIV-1 integrase as probes for biochemical mechanisms of drug action. Journal of Medicinal Chemistry 40,

43 31 Meiyanto, E Kurkumin sebagai obat kanker: Menelusuri mekanisme aksi. Majalah Farmasi Indonesia10 (4), Mogul, R. dan Holman, T.R Allosteric inhibitors of lipoxygenase. United States Patent. 18, Mukhopadhyay, A., N. Basu, N. Ghatak and P.K. Gujral, Antiinflammatory and irritant activities of curcumin analogues in rats. Agents Actions, 12, Nardo, De, Nardo CM, De, Nguyen T, Hamilton JA, Scholz GM Signaling crosstalk during sequential TLR4 and TLR9 activation amplifies the inflammatory response of mouse macrophages. J. Immunol. 183, Natarajan, R., Esworthy, R., Bai, W., Gu, J.L., Wilczynski, S., Nadler, J.L Increase 12-lipoxygenase expression in breast cancer cell an tissues. Regulation by epidermal growth factor. J.Clin. Endocrinol. Metab 82, Nie, D., Hillman, G.G., Geddes, T., Tang, K., Pierseon, C., Grignon, D.J and Honn, K.V Platelet-type 12-lipoxygenase in human prostate carcinoma stimulates angiogenesis and tumor growth. Cancer Res, 58, Nogrady, T, 1985, Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, Oxford O. Trott dan A.J Olson AutoDock Vina.Improving The Speed and Accuracy of Docking with A New Scoring Function, Efficient Optimaization and Multithreading. Journal of Computational Chemistry Ohtsu, H., Xiao, Z, Ishida, J., et.al Curcumin Analogues as Novel Androgen Receptor Antagonists with Potential as Anti-Prostate Cancer Agents. J.Med Chem, 45, Okimoto, N., Futasugi, N., Fuji, H., Suenaga, A., Morimoto, G., et.al High Performance Drug Discovery: Computational Screening by Combining Docking and Molecular Dynamics Simulation, PLoS Computational Biology. Vol Pollock,S dan Safer, H.M Bioinformatics in The Drug Discovery Proccess. Putra, I.G.N, Nurcahata, B.M, Rachmatika, B., et,al Kurkumin dan Analognya sebagai Selective Estrogen Receptor Modulators (SERMS): Kajian Berdasarkan Metode Docking pada Reseptor Estrogen Alfa. Pharmacon 9 (1), 6-13 Rao, C.V Antioxidant activity of curcumin and related compounds. Lipid peroxide formation in experimental inflammation. Cancer Res. 55,259 Ravindran J, Prasad S, Aggarwal BB NF-kappaB and cancer: how intimate is this relationship. Mol Cell Biochem.336(1-2): Ritmaleni dan S. Ari Sintesis tetrahidro pentagamavunon-0. Majalah Farmasi Indonesia 21(2) Samira Karya Sarjana Utama Kimia: Perancangan Peptida Siklis sebagai Inhibitor Potensial untuk Enzim NS3-NS2B Protease Virus Dengue secara In Silico Melalui Molecular Docking. Departemen Kimia FMIPA-UI Shisodia, S., Chaturvedi, M.M., Aggarwal B.B Role of Curcumin: The Indian Solid Gold. Adv Exp MEdi Biol, 595, 1-7

44 32 Silverman, R. B., The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, Academic Press, San Diego, New York, USA Soriano, A.F., Helfrich, B., Chan, D.C., Heasley, L.E., Bunn, P.A, Jr., Chou, T.C Synergistic effects of new chemopreventive agents and conventional conventional cycotoxic agents against human lung cancer cell lines. Cancer Res 59, Srivastava JK, Shankar E, Gupta S. Chamomile A herbal medicine of the past with bright future. Molecular Medicine Report. 3(6), Steczko J, Donoho GP, Clemens JC, Dixon JE, Axelrod B Conserved histidine residues in soybean lipoxygenase: functional consequences of their replacement. Biochemistry Supardjan, A.M Kurkumin: Pengembangan dari Obat Tradisional ke Obat Modern. Pidato Pengukuhan Jabatan Guru Besar. Fakultas Farmasi, UGM: Yogyakarta Surh YJ, Chun KS, Cha HH Molecular mechanisms underlying chemopreventive activities of anti-inflammatory phytochemicals: downregulation of COX-2 and inos through suppression of NF-kappa B activation. Mutat Res : Tasbichaty, F.T Analisis Simulasi Dinamika Molekuler Kompleks 12- Lipoksigenase dengan Beberapa Senyawa Antiinflamasi Golongan Kurkumin Hasil Penambatan Molekuler. Skripsi Sarjana Farmasi. Departemen Farmasi, FMIPA, UI: Depok Underwood JCE General and Systemic Pathology. Churchill Livingston, Utami, C.A Screening Aktivitas Antiinflamasi Senyawa Aktif yang Terkandung pada Beberapa Tanaman Obat Indonesia melalui Penambatan Enzim 12-Lipoksigenase secara in silico. Skripsi Sarjana Farmasi. Departemen Farmasi, FMIPA, UI: Depok Wallace, A.C., Laskowski, R.A., Thornton, J.M LigPlot: A Program to Generate Schematic Diagrams of Protein-Ligand Interactions. NCBI 8(2) Wang YJ, Pan MH, Cheng AL Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products. J Pharm Biomed Anal.15, Wong, Benjamin C.Y., Wang, Wei Ping., Cho, Chi Hin., Fan, Xiao Ming., Lin, Chia Mi., Kung, Hsiang Fu., Lam, Shiu Kum Lipoxygenase inhibitor induced apoptosis in human gastric cancer cell. Carcinogenesis, 22, Yuwono, T dan Oetarai R.A Stabilitas PGV-0 (Pentagamavunon-0) sebagai obat Antiinflamasi dalam bentuk sediaan larutan cair. Majalah Farmasi Indonesia 15 (1), Zukhrullah M, Aswad M, Subehan Kajian Beberapa Senyawa Antiinflamasi: Docking Terhadap Siklooksigenase-2 secara In Silico. Majalah Farmasi dan Farmakologi 16 (1), 37-44

45 LAMPIRAN 33

46 34 Lampiran 1 Jenis 20 asam amino No Nama asam amino Singkatan Alanine Arginine Asparagine Aspartic acid Cysteine Glutamine Glutamic acid Glysine Histidine Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (C) Gln (Q) Glu (E) Gly (G) His (H) 10 Isoleucine Ile (I) 11 Leucine Leu (L) 12 Lysine Lys (K) 13 Methionine Met (M) 14 Phenylalanine Phe (F) 15 Proline Pro (P) 16 Serine Ser (S) 17 Threonine Thr (T) 18 Tryptophan Trp (W) 19 Tyrosine Tyr (Y) 20 Valine Val (V)

47 35 Lampiran 2 Kontak residu dengan ligan No. Nama Senyawa Kontak Residu 1 Kurkumin enol Cys (559), Ile (593), Gln (590), Ser (594), Glu (356), His (360), His (365), Leu (361), Arg (189), Val (190), Leu (597), Phe (352) 2 3 Kurkumin keto Bisdemetoksikurkumin Leu (361), Val (190), Cys (559), Phe (352), Gln (590), Ile (593), Leu (597), Glu (356), His (360), His (365) Leu (311), Lys (310), Gly (457), Asn (308), Tyr (230), Leu (645), Leu (459), Trp (647), Glu (226) 4 Demetoksikurkumin Gln (590), Ile (593), Leu (597), Leu (194), Leu (193), Val (190), Arg (189), Glu (369), Leu (366), His (365), His (360), Phe (352) 5 Analog 1 Arg (189), His (365), Val (190), Leu (361), Glu (356), Gln (590), Ser (594), Gln (547), Phe (352), Ile (593), His (360), Leu (193) 6 Analog 2 Val (190), Leu (194), Leu (597), Ser (594), Glu (356), Gln (547), Cys (559), Ile (593), Gln (590), Phe (352), Leu (361), His (365), His (360) 7 Etodolak Leu (311), Gly (309), Glu (226), Leu (645), Leu (459), Trp (647), Tyr (230), Lys (310), Leu (233) 8 9 Asam kafeat Asam arakidonat Cys (221), Leu (227), Trp (647), Lys (310), Gly (309), Tyr (230), Asp (224), Glu (226) Gly (309), Leu (311), Lys (310), Trp (647), Leu (645), Glu (226), Tyr (230), Leu (227), Leu (233)

48 36 Lampiran 3 Persiapan Ligan dan Protein Target Berikut ini adalah prosedur pencarian struktur protein target enzim 12- lipoksigenase: 1. Membuka situs internet Gambar 1 Tampilan situs internet 2. Mencari nama protein target pada bagian Search Everything, dapat menuliskan PDB ID (contoh: 3D3L), nama molekul (contoh: 12- lipoxygenase), atau nama peneliti Gambar 2 Tampilan untuk mencari nama protein target

49 37 3. Menetapkan protein target yang akan diunduh, pada penelitian ini menggunakan protein target dengan PDB ID 3D3L 4. Mengunduh protein target pada bagian Download Files PDB File. (Text). Protein target diunduh dengan format.pdb 5. File hasil unduhan berupa struktur protein 3D3L dalam format.pdb. File tersebut disimpan pada direktori kerja yang telah disiapkan.

50 38 Berikut ini adalah prosedur mempersiapkan struktur ligan. Rujukan struktur ligan dapat diperoleh dari 1. Membuka piranti lunak MarvinSketch Menggambar struktur yang akan diujikan pada simulasi docking Menu-menu yang disediakan pada MarvinSketch dapat digunakan untuk menggambar struktur 2D.

51 3. Simpan struktur ligan 2D yang telah siap dengan cara File Save Beri nama file Pilih File Type.cml 4. Simpan struktur ligan dalam bentuk 3D dengan cara File Save as Beri nama file Pilih File Type.pdb 5. File tersebut disimpan pada direktori kerja yang telah disiapkan 39

52 40 Lampiran 4 Simulasi Docking 1. Buka file protein target yang diinginkan File Read Molecule Pilih molekul yang akan dibuka (contoh: protein3d3l.pdb) 2. Tambahkan hidrogen polar pada protein target Edit Hydrogens Add Polar Only

53 41 3. Ubah struktur reseptor ke dalam format.pdbqt Klik Grid Macromolecule Choose Pada pilihan choose macromolecule klik Protein Select Molecule. 4. Tentukan ukuran grid untuk docking Klik Grid Grid Box 5. Periksa kesesuaian grid dockig Catat Semua Parameter pada Grid Option.

54 6. Buka file koordinat ligan Klik Ligan Open Pilih file ligan (ligan.pdb). Untuk menyembunyikan pengamatan protein (hanya menampilkan ligan saja), dapat dilakukan dengan tombol hide pada tab PMV Molecules 42

55 7. Lakukan seleksi untuk ikatan yang dapat mengalami rotasi Klik Ligan Torsion Tree Choose Torsion 43

56 44 8. Simpan struktur ligan dalam format.pdbqt Klik Ligan Output Save as PDBQT simpan dengan nama yang diinginkan Save Setelah protein target dan ligan telah siap, maka langkah selanjutnya adalah melakukan simulasi docking. Prosedur yang dilakukan berikut ini sesuai dengan Tutorial Workshop Komputasi Genomik dan Proteomik, ITB (Tim Biokimia ITB, 2013) 1. Siapkan file parameter a. Membuat file yang berisi parameter grid menggunakan notepad dan disimpan dengan nama conf.txt b. Isi parameter (sesuai grid box) Penulisan berikut ini harus sesuai: receptor = protein.pdbqt ligand = ligand.pdbqt center_x = center_y = center_z = size_x = 70 size_y = 68 size_z = 50 Penulisan tersebut harap memperhatikan spasi dan tanda titik

57 45 2. Buka command prompt (Windows) atau terminal (Linux) Masuk ke direktori kerja tempat penyimpanan seluruh file keperluan docking. Perintahnya adalah dengan menggunkan command cd (change directory) Cd Nama_Direktori\Nama_Sub_Direktori Ralat: bagian akhir seharusnya --config conf.txt log log.txt Penulisan script pada command prompt jangan sampai salah. 3. Amati hasil running simulasi docking

58 46 Lampiran 5 Pengamatan interaksi hasil docking Berikut ini adalah prosedur penggunaan program LigPlot ++ sesuai dengan Tutorial Workshop Komputasi Genomik dan Proteomik, ITB (Tim Biokimia ITB, 2013): 1. Buka program LigPlot++ (klik ganda LigPlus.jar) 2. Buka file struktur hasil docking yang telah diubah format ke dalam format.pdb 3. File Open PDB Pilih molekul yang ingin dijadikan fokus representative (ligan) Run

59 47 Lampiran 6 Hasil Deteksi Rotatable Bond Ligan Ket: Ikatan dengan warna hijau menunjukan ikatan yang dapat berotasi a. Kurkumin Enol Rotatable bond: 10 buah b. Kurkumoin Keto Rotatable bond : 12 buah c. Bisdemetoksikurkumin Rotatable bond : 8 buah

60 48 d. Demetoksikurkumin Rotatable bond : 9 buah e. Analog 1 Rotatable bond : 10 buah f. Analog 2 Rotatable bond : 10 buah

61 49 g. Etodolak Rotatable bond : 5 buah h. Asam Kaffeat Rotatable bond : 3 buah i. Asam Arakidonat Rotatable bond : 15 buah

62 50 Lampiran 7 Nilai G Ligan dengan Reseptor a. Kurkumin Enol b. Kurkumin Keto c. Bisdemetoksikurkumin

63 51 d. Demetoksikurkumin e. Analog 1 f. Analog 2

64 52 g. Etodolak h. Asam Kafeat i. Asam Arakdionat RIWAYAT HIDUP