BAHAN DAN METODE. Secara garis besar penelitian ini dapat digambarkan pada skema seperti tertera

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Secara garis besar penelitian ini dapat digambarkan pada skema seperti tertera pada Gambar 1. PENGAMBILAN CONTOH TANAH 1. Contoh Tanah 2. Contoh Aka. ISOLASI DAN KOLEKSI 1. Medium Ca,(PO,), 2. Medium AlPO, SELEKSI JASAD RENIK 1. Tahap 1 2. Tahap 2 JASAD RENIK TERPILIH 1 TELAAH JASAD RENIK 1. Identifdcasi 2. Pembakuan populasi 3. Asam organik 4. Penumbuhan I UJI IN VITRO 1. Perc Perc I -- UJI RUMAH KACA I. Perc Pen. 4 r - I UJI LAPANG Perc.5, - I UJI EKOLOGI 1. Perc Perc. 7 Gambar 1. Skema penelitian

2 Kegiatan penelitian terdiri atas pengambilan contoh tanah dan akar, analisis awal contoh tanah, persiapan contoh tanah, isolasi dan koleksi jasad re& pelarut fosfat, seleksi jasad renik, identifikasi jasad renik dan analisis asam organik, serta pengujian jasad renik terpilih pada percobaan in vitro, rumah kaca dan lapang, serta telaah ekologi beberapa jasad renik unggul. Tempat dan Waktu Contoh tanah dan akar tebu diambil dari beberapa lokasi, diantaranya dari Lampung dan Sumatera Selatan yang dikategorikan bertanah masam, Sragen (Jawa Tengah) yang bersifat basa, dan Madura yang bersifat netral. Analisis kimia contoh tanah dan tanaman, isolasi jasad renik, seleksi jasad renik, uji in vitro, dan telaah ekologi dilakukan di Laboratorium Biologi Tanah, Faperta IPB. Percobaan Rumah Kaca (RK) dilakukan di dua tempat, yang pertarna di RK Jurusan Tanah, Faperta IPB dan RK Pusat Aplikasi Isotop dan Radiasi (PAIR) BATAN Pasar Jumat Jakarta. Percobaan Lapang dilakukan di areal Perkebunan Pabrik Gula Bungamaywg, Lampung Utara. Penetapan asam organik serta identifikasi jasad renik dilakukan di Laboratorium Ekofisiologi Pusat Penelitian Tanaman Pangan, Bogor, dan Laboratorium Bakteriologi & Mikologi FMIPA IPB, serta Laboratorium Diagnostik dan Bakteriologi FKH,IPB. Percobaan berlangsung selama 26 bulan, yang dimulai pada akhir Oktober 1991 dan berakhir pada Desember 1993.

3 Pengambilan Contoh Tanah dan Akar Contoh tanah diambil secara komposit dari kedalaman 0-20 cm, selanjutnya dibebaskan dari sisa-sisa tanaman, batu, kerikil, dan diaduk sampai rata. Contoh tanah dikering-udarakan di atas hamparan plastik di bawah naungan untuk menghindari sinar matahari langsung. Untuk memperoleh ukuran butir yang seragam, tanah diayak dengan saringan 2 mrn, selanjutnya dianalisis beberapa sifat kimianya. Contoh akar tebu diambil dari tanaman yang berumur antara 4-6 bulan, dari akar-akar muda yang aktif melakukan penyerapan hara dan air. Akar diambil dengan membongkar rumpun tebu, dan contoh akar dikumpulkan bersama batang tebu bagian bawah yang masih utuh terbungkus tanah. Isolasi Jasad Renik Pelarut Fosfat Metode Cawan Tuang, Contoh tanah. Sepuluh gram tanah yang akan diisolasi jasad reniknya dilarutkan dalam 90 ml larutan fisiologis (larutan NaCl 0.85 persen), selanjutnya diencerkan secara serial sampai tingkat pengenceran 1@ kali. Satu ml suspensi ini dibiakkan pada agar cawan yang mengandung medium Pikovskaya (komposisinya disajikan pada Tabel Lampiran 20) dan diinkubasikan pada suhu kamar selama 2 hari. Medium ini berwarna putih keruh karena Ca,(PO,),. Koloni yang dikelilingi zona

4 berwarna terang jernih menunjukkan adanya pelarutan Ca,(PO,)?. Koloni-koloni yang diinginkan selanjutnya dimurnikan. Contoh akar. Sejumlah akar tanaman tebu segar dibersihkan dari sisa-sisa tanah yang menempel dan dicuci. Sepuluh gram akar yang sudah bersih direndam dalam 90 ml larutan fisiologis steril, dikocok dengan kecepatan rpm selama 20 menit, selanjutnya diencerkan secara serial sampai 104 kali. Satu mililiter suspensi tersebut dibiakkan pada agar cawan yang mengandung medium Pikovskaya dm diinkubasikan pada suhu kamar selama 2 hari. Metode Penyuburan Isolasi dengan metode penyuburan dimaksudkan untuk memperoleh jasad renik yang mampu melarutkan AIPO, sebagai satu-satunya sumber fosfat dalam medium Pikovskaya yang dimodifikasi dengan penggantian Ca,(PO,), oleh AlPO, dan (NH,),SO, oleh urea (komposisinya disajikan pada Tabel Lampiran 20). Medium tersebut tidak berwarna dan mempunyai ph 4.1 sehingga agar dalam medium tersebut tidak dapat memadat. Oleh karena itu medium tersebut tidak dibubuhi agar dan metode pencawanan tidak dapat dilakukan. Metode ini memerlukan kontrol, yaitu sederetan medium AIP04 dengan tingkat pengenceran lo-' sampai 10' yang tidak mengandung suspensi tanah atau akar. Deretan yang lain adalah medium AIPO, dengan tingkat pengenceran yang

5 36 sarna, yakni lo-' sampai lo4 yang dibubuhi dengan satu mililiter suspensi akar (tingkat pengenceran lo-') atau tanah (tingkat pengencerean lo4) dan disiapkan lebi dari satu deret. Selanjutnya kultur diinkubasi pada suhu kamar selama 5 sampai 6 hari. Pada akhir inkubasi, deretan kontrol diuji dengan warna biru molibdat. Caranya sebagai berikut : dua mililiter kultur yang akan diuji dipipet ke dalam tabung reaksi, lalu dibubuhi dua mililiter larutan PB dan satu tetes larutan PC (komposisi larutan PB dan PC disajikan pada Tabel Lampiran 21). Jika larutan berwarna biru, berarti mengandung P larut yang telah membentuk senyawa fosfomolibdat tereduksi. Intensitas warna biru terlemah pada kontrol mempakan tingkat pengenceran yang dipilih untuk menguji kultur sampel. Jika pada tingkat pengenceran yang sama intensitas warm biru pada hltur sampel lebih tinggi dibanding kontrol, maka ha1 tersebut menunjukkan bahwa pada kultur sampel telah terjadi pelarutan AlPO, oleh jasad renik pelarut fosfat. Selanjutnya kultur samp J dibiakkan ke dalam cawan bermedium Pikovskaya padat, dan koloni yang muncul dimurnikan untuk dikoleksi. Koleksi Jasad Renik Isolat-isolat yang diperoleh dikoleksi dalam agar miring pada dua macam medium (Pikovskaya dan agar nutrien), disimpan pada suhu 4"C, serta diremajakan setiap dua bulan.

6 Isolat yang dikoleksi diberi nama yang terdiri dari 4 digit. Digit pertama 37 menunjukkan jenis jasad renik (1 = bakteri, 2 = cendawan). Digit kedua menunjukkan asal contoh (M = Madura; S = Sragen; L = Lampung; P = Sumatera Selatan). Digit ketiga menunjukkan keterangan sampel (T = tanah; A = akar). Digit keempat menunjukkan keterangan medium untuk isolasi (Ca = Pikovskaya Ca,(PO,),; A1 = Pikovskaya AlPO,). Sebagai contoh, isolat lmitica adalah bakteri pertama yang diperoleh dari contoh tanah pertama, asal Madura, medium Pikovskaya Ca,(PO,),. Sedangkan 2L,A2Al adalah cendawan ketiga yang diperoleh dari contoh akar tebu kedua, asal Lampung, medium Pikovskaya AlP04. Seleksi Jasad Renik Jasad renik yang berhasil dikoleksi selanjutnya diseleksi dalam dua tahap. Pada tahap pertama, jasad renik diuji untuk melarutkan senyawa P sukar larut (batuan fosfat dan AlPO,). / Pada seleksi tahap kedua, jasad renik yang 1010s seleksi tahap pertama diuji untuk meningkatkan P terekstrak dari tanah masam dan basa. Seleksi Tahap 1 : Seleksi kemampuan pelarutan batuan fosfat dan AlPO, Tahap ini bertujuan menyeleksi kemampuan jasad renik untuk melarutkan batuan fosfat dan AlPO, dalam medium buatan.

7 38 Sebanyak 50 ml medium Pikovskaya cair ditempatkan dalam labu erlenmeyer 200 ml, disterilkan pada suhu 120 C selama 20 menit, menggunakan autoklaf. Satu miliiiter suspensi jasad renik diinokulasikan pada medium tersebut dan diinkubasikan pada suhu kamar selama 14 hari. Untuk bakteri, inkubasi dilakukan dengan pengocokan berkecepatan 100 rpm secara periodik dan cendawan diinkubasikan dalam keadaan diam. Pada akhir inkubasi, kultur disentrifugasi dengan kecepatan 7500 rpm pada suhu 25 "C selama 20 menit. Filtrat jernih yang diperoleh ditentukan ph dan P- larutnya dengan metode kolorimetri. Jika belum diperoleh filtrat jernih, maka filtrat dibubuhi dengan arang aktif dan disaring kembali. Seleksi dilakukan dengan dua kali ulangan dan jasad renik dipilih (diseleksi) atas dasar kemampuan yang menonjol dalam meningkatkan P-larut pada medium. Seleksi Tahap 2 : Seleksi kemampuan meningkatkan P-terekstrak dari tanah masam dan basa Tahap ini bertujuan menguji jasad renik yang 1010s dari seleksi tahap pertama untuk melihat kemampuamya dalam ha1 meningkatkan P-tersedia di tanah masam dan basa. Sebanyak 25 g tanah steril ditempatkan dalam tabung erlenmeyer 250 ml, lalu diinokulasi dengan satu mili liter suspensi jasad renik dan diinkubasi pa& suhu kamar selama 14 hari. Pada akhir inkubasi, dilakukan pengukuran ph H,O (10: 1). P larut air dan P ekstraksi Bray I untuk tanah masam dan Olsen untuk tanah yang bersifat

8 39 basa. Sterilisasi tanah dilakukan dengan radiasi sinar berdosis 30 kilo Gray selama 20 jam. Seleksi tahap kedua ini diulang dua kali, dan kemampuan isolat &lam meningkatkan P tersedia dijadikan dasar untuk pemilihan jasad renik yang unggul. Telaah Jasad Renik Identifikasi Jasad Renik Bakteri yang terpilih diidentifikasi dengan berpedoman pada Bergey 's Manual of Systematic Bacteriology Volume I tahun 1984 (Krieg dan Holt 1984), sedangkan identifikasi cendawan mengikuti petunjuk Burnett dan Hunter (1972), Raper, Fennel, dan Austwick (1965), serta Domsch, Gams, dan Anderson (1980). Pernbakuan Populasi / Kurva baku populasi jasad renik terpilih ditentukan untuk memudahkan teknik inokulasi pada percobaan-percobaan selanjutnya. Kurva ini menyatakan hubungan antara nilai rapat optis (Optical Density) suspensi jasad renik dengan Satuan Pembentuk Koloni (Colony Forming Unit) yang ditentukan dengan met& cawan hitung. Dengan demikian, maka inokulasi pada percobaan-percobaan yang akan dilakukan dapat menggunakan populasi jasad renik yang seragam.

9 40 Suspensi jasad renik di dalam medium kaldu nutrien diencerkan berurut 2, 3, 4, 8, dan 10 kali dan diukur nilai rapat optis (Optical Density) nya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 rim. Selanjutnya untuk masing-masing tingkat pengenceran, populasi jasad renik ditentukan dengan metode hitungan cawan. Populasi jasad renik dan nilai rapat optisnya dihubungkan dengan persamaan regresi linier, yang digunakan sebagai kurva baku populasi jasad renik di dalam medium tersebut. Penetapan Asam Organik Sejumlah 1.0 x 10'' sel jasad renik diinokulasikan pada 100 ml medium Pikovskaya batuan fosfat, diinkubasikan pada suhu kamar selama 3 hari dengan goyangan 100 rpm untuk bakteri dan inkubasi diam selama 5 hari untuk cendawan. Pada akhir inkubasi kultur disentrifugasi 7500 rpm, pada suhu 25 "C selama 20 menit. Filtrat yang diperoleh digunakan untuk menentukan kadar asam-asam organik berikut : asam sitrat, dsalat, format, suksinat, butirat, asetat, dan propionat. Penetapan ini dilakukan dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Pertumbuhan Jasad Renik Pertumbuhan jasad renik terpilih ditelaah dengan tujuan untuk mengetahui laju tumbuhnya dalam medium kaldu nutrien. Informasi yang diperoleh diperlukan dalam pelaksanaan percobaan selanjutnya. Sejumlah 1.0 x 10'' sel jasad renik diinokulasi-

10 41 kan pada 50 ml medium kaldu nutrien dan biakan diinkubasikan pada suhu kamar. Untuk bakteri, inkubasi dilakukan selama 48 jam di atas mesin pengocok berkecepatan 100 rpm, dan setiap 6 jam ditentukan populasinya dengan cara mengukur rapat optisnya. Di pihak lain, biakan cendawan diinkubasi selama 144 jam dalam keadaan diam, dan setiap 24 jam dibuat suspensi sporanya serta diukur rapat optisnya pada panjang gelombang 620 nm. Waktu generasi (generation time) atau waktu penggandaan (doubling time) jasad renik dihitung pada fase log, dengan menggunakan mmus : a b n = populasi sel awal = populasi sel setelah n generasi = jumlah generasi g t = waktu generasi = waktu yang diperlukan untuk pertumbuhan sel dari populasi a sampai b

11 0.301 x t g - log b - log a g t a b = waktu generasi = waktu inkubasi = populasi awal jasad renik = populasi akhir jasad renik Percobaan 1. Pengaruh Jasad Renik dan Bahan Organik Terhadap Ketersediaan P Tanah Basa Percobaan ini dilakukan dengan menggunakan kantung-kantung plastik yang masing-masing diisi 250 g tanah BKM (Berat Kering Mutlak), dengan sumber bahan organik sisa tanaman tebu yang diberikan pada dosis 0 dan 10 ton ha". Bahan organik bemkuran halus (40 mesh) dicampur merata dalam 250 g tanah BKM, didiamkan selama 6 hari, lalu diinokulasi dengan 11 jenis jasad renik terpilih, yang terdiri atas 9 bakteri, dan 2 cendawan. Sebagai kontrol, disiapkan kantungkantung berisi campuran yang sarna tanpa inokulasi. Jumlah sel yang diinokulasikan adalah 2.5 x 10" CFU per kantung plastik (1.0 x lo9 CFU g-' BKM tanah), dan inkubasi dilakukan selama 14 hari. Selama inkubasi, kadar air dipertahankan pada 70 persen kapasitas lapang.

12 43 Pada akhir inkubasi, dilakukan pengamatan terhadap ph air (10: 1). P larut air, dan P tersedia yang diekstraksi dengan NaHCO, (Olsen). Percobaan dilakukan pada tanah bersifat basa (Inceptis01 Sragen), yang disterilisasi dengan radiasi sinar y, tanpa tanaman, dan disusun dalam rancangan acak kelompok, 3 ulangan. Beda nilai tengah pengamatan diperbandingkan dengan uji jarak beganda Duncan. Percobaan 2. Pengaruh Jasad Renik, Bahan Organik dan Kapur Terhadap Ketersediaan P tanah Masam Percobaan dilakukan dengan menggunakan kantung-kantung plastik, yang berisi 250 g BKM tanah Ultisol Lampung. Bahan organik yang digunakan adalah sisa tanaman tebu dengan takaran 0 dan 10 ton ha-'. Kapur yang digunakan adalah CaCO, dengan dosis 0 dan satu kali Al,,, (2.8 ton ha-'). Bahan organik dan kapur dicampur merata dengan 250 g tanah BKM dan didiamkan selama 6 hari. Inokulasi dan inkubasi dilakukan dengan jasad renik-jasad renik yang sama dan cara yang sama seperti yang disebutkan pada Percobaan 1. Pada akhir inkubasi, pengamatan dilakukan terhadap ph air (10:1), P larut air, dan P Bray.

13 44 Percobaan dilakukan pada tanah masam (Ultisol Lampung) yang disterilisasi dengan sinar 7 60Co berdosis 30 kilo Gray selama 30 jam, tanpa tanaman, clan disusun dalam rancangan acak kelompok, tiga ulangan. Beda nilai tengah diperbandingkan dengan uji Duncan. Fraksionasi P-anorganik Untuk mengetahui kemampuan jasad renik dalam melarutkan bentuk-bentuk P anorganik tanah masam, rnaka dilakukan pengamatan terpisah dengan cara menginoku-lasikan jasad renik yang bersangkutan sebanyak 1.0 x lo9 CFU gram-' tanah pada 100 g BKM tanah Ultisol, lalu diinkubasi pada suhu kamar selama 14hari pada kadar air 75 persen kapasitas lapang. Percobaan dilakukan dalam labu-labu erlenrneyer 300 rnl, yang diulang tiga kali. Pada akhir inkubasi, fraksi-fraksi P anorganik ditentukan dengan metode Chang dan Jackson yang dimodifikasi (Hesse, 1972). Metode fraksionasi disajikan pada Tabel Lampiran 22. Data yang diperoleh dianalisis dalarn rancangan acak lengkap, dan nilai rataannya diperbandingkan dengan uji jarak berganda Duncan.

14 Percobaan 3. Pengaruh Jasad Renik, Pupuk P dan Kapur Terhadap Efisiensi Serapan P-Pupuk Dengan Teknik Pengenceran Isotop UP Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh jasad renik terhadap efisiensi pemupukan fosfat pada tanaman tebu, yang dilakukan dengan menggunakan pot dalam rumah plastik. Varietas tebu yang digunakan adalah PS dan bibit dipilih dari tanaman sehat berumur enam bulan. Mata nomor 9 sampai 15 diambil dan disiapkan sebagai bagal mata satu (budset) dan dikecambahkan pada medium pasir tanpa pupuk selama 10 hari. Bibit yang seragam dipilih dan dipindahkan ke dalam pot percobaan sebanyak satu tunas pot-'. Perlakuan yang diberikan terdiri atas tiga faktor, yaitu jasad renik (5 jenis + 1 kontrol); pupuk P sebanyak lima taraf dengan dosis per ha sebanyak 0 kg P205, 45 kg P20S TSP, 90 kg P20S TSP, 90 kg P20, batuan fosfat (RP), dan 150 kg P,Os RP; dan kapur (CaCO,) dua taraf dengan dosis 0 dan 1 kali Al,,, (2.8 ton CaCO, ha' I). P radioaktif C2P) yang digunakan berada dalam bentuk senyawa TS32P dengan aktivitas jenis 0.15 mci gram-' P. Sebanyak 4 kg BKM tanah dicampur terlebih dahulu dengan kapur, diinkubasi selama 14 hari, selanjutnya diberi pupuk dasar (90 kg N ha-' dan 60 kg K ha"), perlakuan pupuk fosfat dan sel jasad renik sejumlah 5 x 1012 CFU. Tahap berikutnya adalah penanaman bibit tebu.

15 Percobaan disusun secara split-split plot (petak terbagi ganda) dalam 46 rancangan acak kelompok dengan dua ulangan. Sebagai petak utarna adalah pengapuran, sedangkan anak petak dan anak-anak petak berturut-turut adalah dosis pemupukan P dan jenis jasad renik. Penempatan anak petak dan anak-anak petak dilakukan secara acak. Tanaman di dalam pot dipertahankan sampai umur enam minggu, dan pada umur tersebut tanaman dipanen, diukur bobot keringnya, kadar P-total dan P-pupuk, efisiensi serapan pupuk P, dan nilai ekivalensi P tersedia dari batuan fosfat (RP) terhadap P tersedia TSP. Teknik perunutan P dari sumber RP dan efisiensi pupuk RP dihitung dengan pendekatan Nilai-A (IAEA, 1976; Zapata, 1990; Sisworo dan Sisworo, 1986), sebagai berikut : Aflanah + RP) = Jumlah P dalam tanah yang tersedia bagi tanaman, yang berasal dari P-tanah dan P-RP. Acr-10 = Jumlah P dalam tanah yang tersedia bagi tanarnan. P-pupuk diserap tanaman Efsiensi Pupuk P = - x 100% P- pupuk yang diberikan

16 Percobaan 4. Pengaruh Jasad Renik, Pupuk P dan Kapur Terhadap Beberapa Sifat Agronomi Tanaman Tebu (Percobaan Rumah Kaca) Percobaan ke 4 ini terdiri dari deretan percobaan yang sama dengan Percobaan 3, dengan pola rancangan dan perlakuan yang sama, kecuali dalam ha1 taraf perlakuan pupuk fosfat (TSP). Fosfat yang digunakan untuk percobaan bukan radioaktif, dan hanya diberikan dalam empat taraf, yaitu : 0, 90 (TSP), 90 (RP), dan 150 (RP) kg PzO, ha-'. Secara teknis percobaan ini dilaksanakan tepat sama dengan Percobaan 3. Tanaman tebu dipertahankan sampai umur tiga bulan (16 minggu), kemudian diamati tinggi, bobot kering, dan kandungan N, P, serta K nya. Percobaan 5. Pengaruh Jwad Renik, Pupuk P dan Kapur Terhadap Beberapa Sifat Agronomi Tanaman Tebu (Percobaan Lapang) Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh jasad renik terhadap pertumbuhan, serapan hara, dan produksi tebu di lapang. Percobaan ini dilakukan pada pada tanah Ultisol di areal perkebunan Pabrik Gula Bungamayang, Lampung Utara.

17 48 Jasad renik terlebih dahulu ditumbuhkan pada kaldu nutrien, kemudian dicampur dengan gambut steril (sterilisasi dengan radiasi) sebagai bahan pembawa, dan diinkubasi pada suhu kamar selama 14 hari. Pada akhir inkubasi ditetapkan populasi sel jasad renik pada setiap gram bahan pembawa. Varietas tebu yang digunakan adalah PS Bibit dipilih dari tanaman sehat berumur 6 bulan, diambil mata nomor 9 sampai 15, dan disiapkan sebagai bagal mata dua. Perlakuan percobaan terdiri atas tiga faktor, yaitu jasad renik (5 jenis + 1 kontrol); pemupukan P sebanyak empat taraf dengan dosis 0,90 (TSP), 90 (RP), 150 (RP) kg P20, ha-'; dan kapur dengan dosis 0 dan 1 kali Al,. Dosis isolat yang diberikan adalah 7.5 x 10" CFU plot-', dengan dua kali ulangan. Percobaan disusun secara split-split plot dalam pola rancangan acak kelompok dengan 2 ulangan. Sebagai petak utama, anak petak, dan anak-anak petak berturutturut adalah perlakuan kapur (K), fosfat (P), dan Isolat (I). Luas plot yang digunakan adalah (6 x 7.5) m2, dengan jumlah bibit 15 mata m-'. Jasad renik diberikan sebagai alas bibit. Pada umur empat bulan, pengamatan dilakukan terhadap tinggi, jumlah tunas, bobot kering pada sampel (2x3) m2, serta kadar N, P, dan K jaringan tebu. Di pihak lain tanaman tebu di luar petak sampel pada setiap plotnya dipertahankan sampai umur 11 bulan dan diamati kadar sukrosa serta bobot tebunya.

18 Data yang diperoleh dianalisis secara faktorial, dan nilai rataannya diperbandingkan dengan uji jarak berganda Duncan. 49 Karakter Jasad Renik Terhadap Antibiotik Untuk mengetahui nasib jasad renik yang diinokulasikan ke dalam tanah, maka dua jasad renik diberi tanda (marker) terlebih dahulu sebelum diinokulasikan ke dalam tanah. Marker tersebut adalah sifat resisten jasad renik terhadap campuran dua macam antibiotik pada dosis yang tinggi. Karakter isolat terhadap antibiotik yang perlu diketahui adalah sifat resistensinya terhadap antibiotik tertentu, yang dilanjutkan dengan melipatgandakan sifat resiten tersebut. Uji Kepekaan Terhadap Antibiotik Kegiatan ini dilakukan untuk menguji kepekaan jasad renik terhadap lima macam antibiotik, yaitu eritromisin, penisilin, khloramfenikol, teramisin, dan streptomisin. Satu mililiter suspensi jasad renik masing-masing ditumbuhkan dalam medium kaldu nutrien yang mengandung antibiotik 10, 20, 40, 60, 80, 90, dan 100 ug ml-', dengan ulangan dua kali. Suspensi ini diinkubasikan pada suhu kamar selama tiga

19 hari dan diamati kekeruhannya. Dua jenis antibiotik dipilih berdasarkan resistensi jasad renik terhadap antibiotik tersebut. 50 Arnplifikasi Sifat Resisten terhadap Antibiotik Sifat resisten terhadap dua macam antibiotik yang dimiliki oleh ke dua bakteri tersebut diadaptasikan ke dalam medium yang mengandung campuran antibiotik terpilih. Lima mililiter suspensi jasad renik masing-masing ditumbuhkan dalam medium yang mengandung campuran dua macam antibiotik (1: 1) pada konsentrasi 50 ug ml-' (disebut suspensi I), digoyang dengan kecepatan 100 rpm selama tiga hari dan ditentukan populasinya dengan metode cawan hitung pada medium agar nutrien. Dengan cara yang sama, lima mililiter suspensi I ini ditumbuhkan juga dalam medium yang mengandung 100 ug mi-' campuran antibiotik, digoyang 100 rpm selama 5 hari dan ditentukan populasinya. Peningkatan adaptasi tersebut dilakukan secara bertahap, dengan konsentrasi campuran antibiotik 50, LOO, 250, 400, 550, 700, 850, dan 1000 Jasad renik yang mampu beradaptasi dengan campuran dua macam antibiotik dosis tertinggi selanjutnya disebut sebagai mutan, yang digunakan sebagai jasad renik uji pada Percobaan 6 dan 7. Penelitian ini menguji dua macam jasad renik, dengan menggunakan dua kali ulangan untuk setiap tahapan kerja.

20 Percobaan 6. Uji Stabilitas Mutan Pada Medium Tanpa Antibiotik Percobaan ini dilakukan dengan tujuan untuk menguji stabilitas resistensi jasad renik yang ditumbuhkan pada medium yang tidak mengandung antibiotik. Percobaan dilakukan dalam erlenmeyer 250 mi yang berisi 50 ml medium kaldu nutrien tanpa antibiotik. Ke dalam medium tersebut, diinokulasikan satu mililiter ml suspensi jasad renik mutan, yang selanjutnya digoyang dengan kecepatan 100 rpm. Pada hari ke 5, 10, 15, 20, 25, dan 30, populasi jasad renik ditentukan dengan metode cawan hitung pada dua macam medium, yaitu agar nutrien berantibiotik dan agar nutrien tanpa antibiotik. Sebagai kontrol dilakukan deretan percobaan yang sama, tetapi menggunakan medium kaldu nutrien berantibiotik dengan kandungan campuran antibiotik 500 ug 1. Percobaan ini menggunakan dua jasad renik mutan dengan dua ulangan. Percobaan 7. Uji Ekologi jasad Renik di Dalam Tanah Percobaan ini disusun untuk menelaah nasib jasad renik yang diinokulaikan ke dalam tanah, yaitu untuk mengetahui kemampuan jasad renik bertahan hidup dan berkembang biak bersama-sama dengan jasad renik lain di dalam tanah.

21 52 Percobaan dilakukan pada 100 g tanah Ultisol Lampung di dalam labu erlenrneyer 300 ml. Satu mililiter suspensi jasad renik mutan, diinolukasikan dalam tanah tersebut dan disimpan di ruang gelap. Pemantauan jasad renik dilakukan pada hari ke 5, 10, 15, 20, 25, dan 30 dengan menggunakan metode cawan hitung pada dua macam medium, yaitu agar nutrien tanpa antibiotik dan agar nutrien yang mengandung campuran dua macam antibiotik terpilih (1: 1) dengan tingkat konsentrasi 500 ug ml-'. Percobaan menggunakan dua macam jasad renik, dengan dua ulangan. Data yang diperoleh diperbandingkan terhadap kontrolnya.