FRAKSINASI SENYAWA AKTIF MINYAK ATSIRI KENCUR (Kaempferia galanga L) SEBAGAI PELANGSING AROMATERAPI SECARA IN VIVO LUSIANI DEWI ASSAAT

Transkripsi

1 FRAKSINASI SENYAWA AKTIF MINYAK ATSIRI KENCUR (Kaempferia galanga L) SEBAGAI PELANGSING AROMATERAPI SECARA IN VIVO LUSIANI DEWI ASSAAT SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

2 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Fraksinasi Senyawa Aktif Minyak Atsiri Kencur (Kaempferia galanga L) Sebagai Pelangsing Aromaterapi Secara In Vivo adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Juni 2011 Lusiani Dewi Assaat NRP G

3 ABSTRACT LUSIANI DEWI ASSAAT. Fractionation of Active Components from Kaempferia galanga L Essential oil as Aromatherapy for Antiobesity using In Vivo Analysis. Under direction of TUN TEDJA IRAWADI and IRMANIDA BATUBARA The purposes of this research were to separate constituents of kencur (Kaempferia galanga L) essential oil and to evaluate their active components as aromatherapy for antiobesity using in vivo analysis to the male Sprague-dawley rats. Volatile oil of dried rhizome of K. galanga L obtained by water distillation. Its chemical components determined using gas chromatography and mass spectrometry (GC- MS). The main components of volatile oil isolated were α-pinene, camphene, δ-3- carene, α-phellandrene, limonene, p-cymene 4-isopropyltoluene, 7,8- epoxytricyclo dodecana, 5-methyltricyclo undec-2-en-4-one, 2-propenoic acid,3- (4-methoxyphenyl)-, ethyl ester. Pure compound (2-propenoic acid,3-(4- methoxyphenyl)-, ethyl ester) was determined the structure by GC-MS and NMR analysis. A total of forty male Sprague-dawley rats were used for this study. They were divided into five groups i.e. (1) a normal control group, without treatment of both high cholesterol diet and inhalation, (2) a negative control group was treated by high cholesterol diet only, without inhalation treatment, (3) treated with high cholesterol diet followed by treatment with inhalation of crude oils, (4) Treated with high cholesterol diet followed by inhalation one of essential oils fraction, and (5) Treated with high cholesterol diet followed inhalation of 2-propenoic acid,3- (4-methoxyphenyl)-, ethyl ester. Treatment condition was achieved by five months. Rat s weight and stool were weighed every day during the treatment period. Blood cholesterol total (LDL, HDL and Triglyceride) level was determined in the end of treatment period. Duncan test analysis showed that percentage increase in body weight and liver weight has significant difference but fat weight wasn t significant difference. For blood test analysis HDL, Cholesterol, and Triglyceride level has significant difference. The conclusion were kencur essential oil has ethyl-para-methoxycinnamate as pure compound, based on in vivo test analysis fraction has potentially as antiobesity and crude oils and pure compound has potentially decreased cholesterol and triglyceride using aromatherapy method. Keywords : Kaempferia galanga L, aromatherapy, antiobesity, Ethyl-paramethoxycinnamate

4 RINGKASAN LUSIANI DEWI ASSAAT. Fraksinasi Senyawa Aktif Minyak Atsiri Kencur (Kaempferia galanga L) Sebagai Pelangsing Aromaterapi Secara In Vivo. Dibimbing oleh TUN TEDJA IRAWADI dan IRMANIDA BATUBARA. Lemak merupakan salah satu komponen makanan yang dibutuhkan oleh tubuh. Tetapi jika seseorang mengkonsumsi lemak secara berlebihan akan mengakibatkan terjadi penumpukan lemak tubuh yang disebut dengan kelebihan berat badan atau identik dengan obesitas. Obesitas dapat mengganggu penampilan dan memiliki resiko terhadap berbagai penyakit diantaranya hiperkolesterol, penyempitan pembuluh darah, diabetes, tekanan darah tinggi, dan penyakit jantung koroner (Giannessi et al, 2008). Oleh karena itu, penanganan atau pencegahan terjadinya obesitas sangat diperlukan sehingga dapat mencegah penyakit yang ditimbulkan oleh obesitas seperti tingginya kadar kolesterol darah. Terdapat pengobatan alternatif seperti aromaterapi yang dapat menjadi suatu pilihan. Aromaterapi merupakan pengobatan herba yang menggunakan bau-bauan dari minyak atsiri dari suatu tanaman. Kencur (Kaempferia galanga L) memiliki kandungan minyak atsiri sebesar 2-7% dari bobotnya (Rostiana dan Djazuli, 2007). Kencur merupakan tanaman tradisional yang lazim digunakan sebagai jamu, bumbu, mengobati bengkak, batuk, menghangatkan badan, dsb. Minyak atsiri dari kencur memiliki aktivitas biologis sebagai antimikroba Tewtrakul (2005). Namun kajian mengenai potensi minyak atsiri kencur sebagai pelangsing aromaterapi belum diamati secara luas. Oleh karena itu tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh senyawa aktif minyak atsiri kencur sebagai pelangsing atau penurun kolesterol aromaterapi secara in vivo. Pada penelitian ini, Sampel kencur segar yang berusia sekitar tahun diperoleh dari pasar induk Kramat Djati. Sampel yang digunakan memiliki kadar air 85.3% dan kadar abu 1,35 % berdasarkan bobot basah. Kencur kemudian didestilasi sehingga diperoleh destilat dan residu. Destilat adalah minyak atsiri kencur (rendemen 0.3% berdasarkan bobot basah). Minyak atsiri kencur memiliki parameter sebagai berikut: berwarna kuning agak keruh pada kondisi panas, indeks bias 1,4958 pada suhu 20ºC diukur menggunakan refraktometer Abbe- Atago NAR-3T. Densitas 0,9433 g/ml yang dibandingkan dengan densitas air 1,043 g/ml. Minyak atsiri kencur setelah dibiarkan lama pada suhu ruang atau semalam pada lemari es, terbentuk padatan berwarna putih seperti kristal yang berada di dasar botol penampung minyak atsiri. Demikian pula pada residu, setelah dibiarkan selama 1 x 24 jam terbentuk padatan berwarna putih seperti kristal yang berada di atas permukaan air. Kedua padatan ini kemudian dipisahkan dari destilat minyak atsiri dan residu kemudian ditampung dalam wadah yang berbeda untuk kemudian diidentifikasi lebih lanjut. Untuk selanjutnya kedua padatan ini diberi nama kristal fase air dan kristal fase minyak. Minyak atsiri kencur dipisahkan menggunakan kromatografi kolom untuk mengidentifikasi komponen-komponen yang terkandung di dalam minyak atsiri kencur. Fase diam yang digunakan adalah silika gel dan proses elusinya dilakukan secara gradien atau peningkatan kepolaran (n-heksana-kloroform sebagai fasa

5 gerak). Fraksinasi minyak atsiri kencur menghasilkan 11 fraksi. Fraksi 2 memiliki rendemen terbesar yaitu 28.42%. Oleh karena itu fraksi 2 ini dilanjutkan dengan analisis GC-MS untuk mengidentifikasi komponen yang terkandung di dalamnya, dan diuji aktivitasnya sebagai pelangsing aromaterapi secara in vivo. Hasil kromatogram GC-MS dari sampel minyak atsiri kencur memiliki 3 komponen utama yaitu δ-3-carene, 5-metiltrisiklo undek-2-en-4-one, dan 2-asam propenoat,3-(4-metoksifenil)-,etilester. Begitu pula dengan fraksi 2 hasil pemisahan menggunakan teknik kromatografi kolom, ternyata masih terdapat beberapa komponen di dalamnya dengan δ-3-carene sebagai komponen utamanya. Untuk kedua kristal yang diperoleh dari destilasi, baik kristal di fasa air ataupun kristal di fasa minyak memiliki komponen yang sama, yaitu senyawa 2-asam propenoat,3-(4-metoksifenil)-,etilester atau etil-p-metoksisinamat (nama trivial). Berdasarkan analisis 1 H-NMR, COSY, HMQC, dan HMBC menunjukkan bahwa kedua kristal tersebut merupakan senyawa yang sama. Oleh karena itu minyak atsiri kencur, fraksi 2, dan Kristal etil-p-etoksisinamat dilanjutkan dengan uji In Vivo dengan pemberian dengan cara inhalasi kepada hewan uji berupa tikus putih jantan galur Sprague-dawley. Tikus yang digunakan sebanyak 40 ekor yang dibagi menjadi 5 kelompok yaitu kelompok kontrol normal merupakan kelompok yang diberi pakan standar dan tidak diinhalasi. Kelompok kontrol negatif merupakan kelompok yang diberi pakan kolesterol tinggi dan tidak diinhalasi. Kelompok atsiri kasar diberi pakan kolesterol tinggi dan diinhalasi minyak atsiri kasar hasil destilasi uap dari rimpang kencur. Kelompok Fraksi 2 diberi pakan kolesterol tinggi dan diinhalasi menggunakan Fraksi 2 yang merupakan Fraksi dengan randemen terbanyak. Kelompok kristal diberi pakan kolesterol tinggi dan diinhalasi menggunakan Fraksi senyawa murni. Masa adaptasi dilakukan selama 2 minggu sebelum masa perlakuan. Hewan uji ditempatkan pada suatu kandang plastik bertutup kawat dengan 4 ekor tikus untuk setiap kandang. Selama masa adaptasi semua kelompok diberi pakan standar yang sama. Adapun pakan yang diberikan pada tikus adalah 20g/ekor/hari, karena konsumsi pakan tikus hanya g/ekor/hari. Selama masa adaptasi dan perlakuan hewan uji diberi minum menggunakan air minum dalam kemasan (AMDK) tanpa dibatasi (ad libitum). Minyak atsiri kasar, fraksi 2, dan kristal diinhalasikan terhadap hewan uji selama masa perlakuan dengan konsentrasi masing-masing 1% dalam aquades. Perlakuan ini dilakukan selama 5 minggu. Pemberian pakan dilakukan setiap hari, sehingga bobot pakan ditimbang setiap hari. Bobot badan tikus ditimbang setiap 1 minggu sekali. Pada akhir masa perlakuan, darah di ambil di bagian ekor tikus sebelum tikus dibius (anastesi) menggunakan eter teknis. Kemudian dibedah dan seluruh organ yang diperlukan ditimbang lalu disimpan di dalam formalin. Berdasarkan analisis secara fisik, perlakuan selama 5 minggu yang diberikan kepada tiap kelompok Fraksi 2 menunjukkan perbedaan yang signifikan untuk parameter persentase kenaikan bobot badan, bobot hati, dan pakan yang dikonsumsinya. Hanya parameter bobot lemak dan bobot pengeluaran feses dan urin yang tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antara Fraksi 2 dengan kelompok lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa terdapat pengaruh perlakuan terhadap perubahan fisik hewan uji. Oleh karena itu, uji in vivo menunjukkan bahwa Fraksi 2 berpotensi sebagai pelangsing aromaterapi. Analisis uji darah dimaksudkan untuk mengetahui profil lipid yang terdapat di darah. Darah diambil di bagian ekor hewan uji sesaat sebelum

6 dianastesi. Darah ditampung pada vial sebanyak 2 ml dan diberi label. Kemudian darah disentrifuga untuk memperoleh serum yang akan di uji HDL, kolesterol, dan trigliseridanya. Kadar kolesterol darah berbeda secara signifikan dengan pemberian perlakuan. Kelompok kontrol normal memiliki kolesterol darah yang terendah, dan kelompok kontrol negatif memiliki kolesterol darah yang tertinggi. Untuk kelompok perlakuan, dengan pemberian pakan lemak tinggi selama 5 minggu, perlakuan inhalasi mampu menurunkan kadar kolesterol darah yang berbeda signifikan dengan kelompok kontrol negatif. Dibandingkan dengan ketiga kelompok perlakuan (Fraksi2, atsiri kasar, dan kristal), perlakuan inhalasi menggunakan kristal kencur (etil-p-metoksisinamat) mampu menurunkan kadar kolesterol paling maksimal sehingga tergolong ke dalam kategori normal. Kadar kolesterol normal untuk hewan uji tikus adalah mg/dl (Suckow et al,2006). Untuk 2 kelompok perlakuan lainnya yaitu kelompok fraksi 2 dan atsiri kasar, walaupun kadar kolesterolnya berbeda nyata dengan kadar kolesterol normal, namun perlakuan tersebut berhasil menurunkan kadar kolesterol dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif. Kadar trigliserida normal untuk hewan uji tikus berada pada batas mg/dl (Suckow et al,2006). Data menunjukkan bahwa kadar trigliserida untuk kelima kelompok masih termasuk ke dalam kadar trigliserida normal. Meskipun normal, kelompok kontrol negatif memiliki kadar trigliserida yang berbeda signifikan dengan keempat kelompok lainnya. Kelompok yang diberi perlakuan (fraksi2, atsiri kasar, kristal), mampu menurunkan kadar trigliserida hingga sama dengan kelompok normal dan berbeda secara signifikan dengan kelompok kontrol negatif. Etil-p-metoksisinamat merupakan senyawa utama (penciri kencur) yang diperoleh dari minyak atsiri kencur. Hasil uji in vivo menunjukkan bahwa, Fraksi 2 berpotensi sebagai pelangsing aromaterapi, sedangkan minyak atsiri kencur dan etil-p-metoksisinamat berpotensi menurunkan kadar kolesterol dan trigliserida darah menggunakan metode aromaterapi. Kata kunci: Kaempferia galanga L, aromaterapi, etil-p-metoksisinamat

7 Hak Cipta milik IPB, tahun 2011 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa seizin IPB

8 FRAKSINASI SENYAWA AKTIF MINYAK ATSIRI KENCUR (Kaempferia galanga L) SEBAGAI PELANGSING AROMATERAPI SECARA IN VIVO LUSIANI DEWI ASSAAT Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kimia SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

9 Judul Tesis Nama NIM : Fraksinasi Senyawa Aktif Minyak Atsiri Kencur (Kaempferia galanga L) sebagai Pelangsing Aromaterapi secara In Vivo : Lusiani Dewi Assaat : G Disetujui Komisi Pembimbing Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS Ketua Dr. Irmanida Batubara, MSi Anggota Diketahui Ketua Program Studi Kimia An. Dekan Sekolah Pascasarjana IPB Sekretaris Program Magister Prof. Dr. Purwantiningsih S, M.Si Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr Tanggal Ujian: 27 Juni 2011 Tanggal Lulus:

10 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Alloh SWT atas segala karunia- Nya sehingga proposal penelitian ini berhasil diselesaikan. Judul penelitian ini adalah Fraksinasi Senyawa Aktif Minyak Atsiri Kencur (Kaempferia galanga L) Sebagai Pelangsing Aromaterapi Secara In Vivo. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS dan Dr. Irmanida Batubara, M.Si selaku pembimbing yang telah banyak memberi saran, arahan dan bimbingan selama penyusunan tesis ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ibu Dr. dr. Irma H. Suparto, MS selaku penguji luar komisi pembimbing yang telah memberikan saran dan arahan, serta Ibu Prof. Dr. Purwantiningsih S, M.Si selaku ketua program studi Kimia. Ungkapan terima kasih yang tak terhingga disampaikan kepada suami penulis Soleh atas kesabaran, dukungan moril dan materil serta doanya. Kepada anak-anak ku Khanza dan Rafi, serta kakak, dan adik-adik ku terima kasih atas segala doa dan kasih sayangnya. Untuk semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu, terima kasih atas segala bantuannya selama penelitian, semoga jasa dan semua amal kebaikannya mendapat imbalan yang berlipat ganda dari Alloh SWT. Karya ilmiah ini juga didedikasikan untuk Alm. Ayahanda H. Dudung Djoendulloh dan Alm. Ibunda Hj. Ai Sholihat, semoga Alloh memberikan tempat terindah di sana. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Juni 2011 Lusiani Dewi Assaat

11 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Tasikmalaya pada tanggal 10 Oktober 1980 dari ayah Dudung Djoendulloh dan ibu Ai Solihat. Penulis merupakan anak kedua dari tujuh bersaudara. Tahun 1999 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Tasikmalaya Jawa Barat dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk Universitas Pendidikan Indonesia melalui jalur Penelusuran Minat, Bakat, dan Kemampuan (PMDK). Penulis memilih mayor Pendidikan Kimia, Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Pada tahun 2009, penulis diterima di Program Studi Kimia pada Program Pascasarjana IPB. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Pendidikan Perguruan Tinggi (DIKTI). Penulis bekerja di Universitas Sultan Ageng Tirtayasa sejak tahun 2005.

12 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL vii DAFTAR GAMBAR.. DAFTAR LAMPIRAN.. ix xi PENDAHULUAN... 1 Latar Belakang. 1 Tujuan Penelitian.. 2 Hipotesis.. 2 TINJAUAN PUSTAKA... 3 Obesitas 3 Pelangsing 4 Aromaterapi. 5 Kencur. 6 Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis.. 7 GC-MS 8 Spektroskopi NMR. 9 Pengujian In Vivo.. 10 BAHAN DAN METODE.. 13 Alat dan Bahan 13 Metode. 13 Metode Analisis Darah 15 Metode Analisis Bobot Hati dan Bobot Deposit Lemak pada Hewan Uji Metode Analisis Data. 17 HASIL DAN PEMBAHASAN. 19 Kadar Air dan Kadar Abu.. 19 Isolasi Minyak Atsiri Kencur Menggunakan Distilasi Uap 19 Penentuan Eluen Terbaik 21 Fraksinasi Minyak Atsiri Kencur 22 Analisis GC-MS Minyak Atsiri Kencur, Fraksi 2, Kristal Fase Air, dan Kristal Fase Minyak. 24 Uji In Vivo Minyak Atsiri Kencur, Fraksi 2, dan Kristal Analisis Fisik.. 29 Analisis Uji Darah.. 32 SIMPULAN DAN SARAN. 37

13 DAFTAR PUSTAKA 39 LAMPIRAN.. 41

14 vii DAFTAR TABEL 1 Penggolongan bobot badan berdasarkan IMT. 4 2 Perbandingan komponen-komponen kencur perolehan Tewtrakul 2005 dan Sudibyo Hasil fraksinasi minyak atsiri kencur dengan kromatografi kolom (elusi gradien) Komponen yang terkandung dalam sampel berdasarkan analisis GC-MS 26 5 Hasil analisis spektrum 1 H-NMR.. 27

15 ix DAFTAR GAMBAR 1 Alur penelitian Metode analisis minyak atsiri yang berpotensi sebagai pelangsing aromaterapi pada hewan uji 14 3 Minyak dan kristal yang diperoleh dari hasil distilasi 20 4 Profil kromatogram minyak atsiri kencur dengan berbagai eluen tunggal dan eluen campuran Profil kromatogram hasil fraksinasi minyak atsiri kencur Kromatogram GC-MS dari sampel minyak atsiri kencur, fraksi 2, kristal fase air, dan kristal fase minyak Spektrum 1 H-NMR kristal fase air dan kristal fase minyak Hasil analisis NMR lengkap senyawa etil-p-metoksisinamat Struktur senyawa etil-p-metoksisinamat Rangkaian alat inhalator, pengumpulan darah dan organ Persentase kenaikan bobot badan hewan uji tiap minggu bobot pakan yang dikonsumsi, bobot feses dan urin hewan uji Bobot lemak dan hati hewan uji Kadar HDL dan kolesterol darah hewan uji Kadar trigliserida darah hewan uji

16 xi DAFTAR LAMPIRAN 1 Hasil determinasi sampel Penentuan kadar air dan kadar abu rimpang kencur Perhitungan randemen, indeks bias, dan densitas Spektrum MS δ-3-carene, etil sinamat, etil-p-metoksisinamat Spektrum COSY, HMQC, HMBC dari kristal fase air dan kristal fase minyak Komposisi pakan yang diberikan pada hewan uji 50 7 Statistik deskriptif, homogenitas, ANOVA, dan uji Duncan data persentase kenaikan bobot badan, bobot pakan yang dikonsumsi, dan bobot feses dan urin Statistik deskriptif, homogenitas, ANOVA, dan uji Duncan data bobot hati, lemak, HDL, kolesterol, dan trigliserida. 60

17 PENDAHULUAN Latar Belakang Lemak merupakan salah satu komponen makanan yang dibutuhkan oleh tubuh. Tetapi jika seseorang mengkonsumsi lemak secara berlebihan akan mengakibatkan terjadi penumpukan lemak tubuh yang disebut dengan kelebihan berat badan atau identik dengan obesitas. Obesitas merupakan keadaan berlebihnya lemak tubuh (Lebenthal & Damayanti 2007). Obesitas dapat mengganggu penampilan dan memiliki resiko terhadap berbagai penyakit diantaranya hiperkolesterol, penyempitan pembuluh darah, diabetes, tekanan darah tinggi, dan penyakit jantung koroner (Giannessi et al. 2008). Selain itu obesitas juga dapat mengganggu penampilan. WHO menyatakan bahwa obesitas adalah salah satu dari 10 faktor paling beresiko di seluruh dunia. Bahkan hal ini mulai mengancam negara-negara di benua Asia. Salah satunya di Indonesia pada tahun 2000, jumlah penduduk yang mengalami overweight mencapai 17,5 %, dan pasien obesitas 4,7 %. Oleh karena itu, penanganan atau pencegahan terjadinya obesitas sangat diperlukan sehingga dapat mencegah penyakit yang ditimbulkan oleh obesitas. Terapi non farmakologis seperti diet dan gerak badan lebih diutamakan untuk pencegahan obesitas, tetapi terapi nonfarmakologis seperti penggunaan obat sintetik ataupun obat herbal juga dilakukan untuk penanganan obesitas. Obat antiobesitas atau pelangsing memiliki fungsi mengurangi nafsu makan, merangsang pembakaran lemak, dan menghambat penyerapan lemak dalam batas tertentu (Birari & Bhutani 2007). Obat pelangsing yang ada di pasaran terdiri atas obat pelangsing sintetik dan obat pelangsing alami yang dibuat secara tradisional. Kedua jenis obat ini biasanya dikonsumsi secara oral. Namun jenis obat pelangsing yang sedang dikembangkan adalah obat pelangsing aromaterapi dari tanaman herbal. Kandungan tanaman herbal yang berpotensi sebagai pelangsing aromaterapi adalah minyak atsirinya (Maniapoto 2002). Kencur (Kaempferia galanga L) merupakan salah satu jenis rimpang yang lazim digunakan oleh masyarakat Indonesia. Kencur memiliki kandungan minyak atsiri yang beragam kadarnya tergantung pada tipenya. Kandungan minyak atsiri

18 2 kencur sebesar 2-7 % dari bobotnya (Rostiana dan Djazuli 2007). Khasiat dari kencur telah banyak dilaporkan dalam berbagai penelitian. Serbuk kencur memiliki efek tonik terhadap mencit jantan (Nurhayati 2008) dan minyak atsiri kencur memiliki aktivitas biologis sebagai antimikroba (Tewtrakul 2005). Namun kajian mengenai potensi minyak atsiri kencur sebagai pelangsing aromaterapi belum diamati secara luas. Sebelumnya telah dilakukan kajian mengenai potensi minyak atsiri temulawak sebagai pelangsing aromaterapi (Anggraeni 2010). Hasilnya bahwa senyawa β-elemenona yang terkandung dalam minyak atsiri temulawak berpotensi sebagai pelangsing. Oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa yang terkandung dalam minyak atsiri kencur dan menganalisis potensi senyawa aktifnya sebagai pelangsing aromaterapi secara in vivo. Tujuan Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh senyawa aktif minyak atsiri kencur sebagai pelangsing dan penurun kolesterol aromaterapi secara in vivo. Hipotesis Hipotesis penelitian ini adalah minyak atsiri kencur memiliki senyawa aktif yang memiliki potensi sebagai pelangsing dan penurun kolesterol aromaterapi.

19 TINJAUAN PUSTAKA Obesitas Asupan makanan yang mengandung lemak tinggi memiliki kandungan trigliserida yang tinggi. Trigliserida di dalam tubuh akan dipecah oleh enzim lipase menjadi asam lemak dan gliserol. Proses ini dinamakan hidrolisis lemak yang terjadi di usus. Lemak kemudian diabsorbsi melalui sel-sel mukosa pada dinding usus dan diubah kembali menjadi lemak dan trigliserida. Lemak ini memiliki ukuran partikel yang kecil (kilomikron) dan dibawa ke dalam darah melalui cairan limfa. Dari darah lemak kemudian diangkut ke hati yang kemudian diangkut ke jaringan organ lainnya dan dimanfaatkan sebagai sumber energi, pertumbuhan, bahan baku hormon, dan sebagainya. Sisa asam lemak yang tidak dimanfaatkan oleh tubuh disimpan sebagai deposit lemak yang berfungsi sebagai cadangan makanan dalam tubuh. Jika deposit lemak di dalam tubuh terlalu berlebih maka akan menyebabkan obesitas atau identik dengan kegemukan. Penyebab kegemukan terjadi karena kebiasaan mengkonsumsi makanan siap saji dengan kandungan lemak dan kalori yang tinggi atau mengkonsumsi makanan yang kurang berserat, stres yang dilarikan pada makanan, dan faktor keturunan (Lebenthal & Damayanti 2007). Terdapat beberapa metode untuk menilai kelebihan berat badan. Diantaranya adalah metode densitometri, yaitu penentuan berat jenis tubuh dengan cara menimbang di bawah air, CT-scan dan MRI, yaitu penentuan lemak tubuh total dan pembagian lemak dalam tubuh, dan yang lebih praktis adalah Indeks Massa Tubuh (IMT). IMT dapat menentukan besarnya massa lemak tetapi tidak menerangkan pembagian lemak dalam tubuh. Nilai Indeks Massa Tubuh (IMT), atau Body Mass Index (BMI), atau Quatelet Index (QI) dapat dihitung dengan cara membagi bobot badan (kg) terhadap kuadrat tinggi badan (m 2 ). Berdasarkan harga IMT ini tingkat kegemukan digolongkan ke dalam 6 kategori seperti terlihat pada tabel 1.

20 4 Tabel 1. Penggolongan bobot badan berdasarkan IMT Kategori bobot badan IMT Kurang < 18.5 Normal Gemuk, overweight Gemuk, obesitas I Gemuk, obesitas II Obesitas hebat > 39.9 (Tjay dan Rahardja 2003) Selain menimbulkan permasalahan pada penampilan, obesitas juga sering menjadi penyebab berbagai penyakit antara lain hiperkolesterol, penyempitan pembuluh darah, diabetes, tekanan darah tinggi, dan penyakit jantung koroner (Giannessi et al. 2008). Oleh karena itu pencegahan dan penanganan kegemukan perlu dilakukan agar penyakit-penyakit yang ditimbulkan karena kegemukan dapat dihindari. Pelangsing Obat antiobesitas atau pelangsing memiliki fungsi mengurangi nafsu makan, merangsang pembakaran lemak, dan menghambat penyerapan lemak dalam batas tertentu (Birari & Bhutani 2007). Obat obatan yang biasa digunakan sebagai pelangsing adalah anoreksansia, yaitu zat-zat yang berdaya menekan nafsu makan dan digunakan untuk menunjang diet pada penanganan kegemukan. Selain itu obat-obatan lainnya adalah orlistat, dan hidroksisitrat (HCA). Kedua obat ini merupakan obat baru yang penggunaannya dimulai tahun Obat yang tergolong sintetis ini selain memberikan manfaat dalam penggunaannya juga memberikan efek samping. Diantaranya memberikan efek samping berupa gangguan lambung, usus, sakit perut, diare, dan kejang lambung. (Tjay dan Rahardja 2003). Selain obat-obatan sintetis juga banyak dikembangkan obat-obatan herba. Yamamoto et al (2000) melaporkan bahwa ekstrak etanol dari tanaman suku

21 5 polong-polongan Nomame herba dapat dijadikan sebagai antiobesitas karena menghambat aktivitas kerja enzim lipase. Aromaterapi Aromaterapi adalah istilah untuk suatu pengobatan alternatif yang menggunakan bau-bauan atau wangi-wangian yang berasal dari senyawa-senyawa aromatik. Hasil penelitian Maniapoto (2002) melaporkan bahwa manfaat dari aromaterapi umumnya berkaitan dengan kondisi fisik, mental, emosional, dan spiritual. Sedangkan Hongratanaworakit (2004) melaporkan bahwa aroma memberikan efek fisiologis dan psikologis bagi manusia. Denyut jantung, tekanan darah, aktivitas elektrodermal, electroencephalogram, gelombang otak, dan kedipan mata dapat digunakan sebagai indikasi untuk mengukur pengaruh aroma terhadap fisiologis manusia. Bahan yang digunakan untuk aromaterapi biasanya dari cairan tanaman yang mudah menguap atau disebut sebagai minyak atsiri. Minyak atsiri merupakan zat yang memberikan aroma pada tanaman dan memiliki komponen yang mudah menguap (volatil) pada beberapa tanaman dengan karakteristik tertentu. Setiap senyawa penyusun minyak atsiri memiliki efek tersendiri, dan campurannya dapat menghasilkan rasa yang berbeda. Secara kimiawi, minyak atsiri tersusun dari berbagai senyawa, namun suatu senyawa tertentu biasanya bertanggung jawab atas suatu aroma tertentu. Buchbauer (1993) melaporkan bahwa minyak atsiri telah digunakan sebagai minyak wangi, kosmetik, bahan tambahan makanan, dan obat. Penelitian Maniapoto (2002) menyatakan bahwa minyak atsiri memiliki potensi sebagai obat yang penggunaannya berkaitan dengan aromaterapi contohnya pelangsing aromaterapi. Perolehan minyak atsiri temulawak dari rimpang temulawak (berdasarkan bobot basah) menggunakan destilasi uap sebesar 0,2003%. Kandungan minyak atsiri temulawak yang dianalisis menggunakan GC-MS adalah xantorizol, kamfor, borneol, zingiberena, γ-elemena, germakrena-b, β-farnesena, α-kurkumena, α- cedrena, β-seskuifelandrena, β-elemenona. Hasil penelitian menunjukkan melaporkan bahwa senyawa β-elemenona yang terkandung dalam minyak atsiri temulawak berpotensi sebagai pelangsing aromaterapi (Anggraeni 2010).

22 6 Kencur Kencur diklasifikasikan ke dalam kingdom Plantae, divisi Spermatophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Monocotyledonae, ordo Zingiberales, family Zingiberaceae, genus Kaempferia, dan spesies K. galanga Linn. Sehingga kencur ini dikenal dengan nama Kaempferia galanga Linn. Kencur merupakan bahan baku berbagai industri sebagai obat tradisional, obat herbal terstandar, kosmetik, bumbu, bahan makanan, dan minuman penyegar. Di masyarakat kencur telah banyak dimanfaatkan untuk mengobati bengkak, reumatik, batuk, sakit perut, ekspektoran (memperlancar pengeluaran dahak), infeksi bakteri, dan menghangatkan badan. Tanaman kencur banyak ditemukan di daerah Jawa, selain itu mulai dikembangkan pula pembukaan areal tanam di luar Jawa, antara lain di Kalimantan Selatan. Secara botanis, kencur dapat dikelompokkan ke dalam dua tipe, yaitu berdaun lebar dan berdaun sempit. Kencur berdaun lebar biasanya memiliki rimpang yang besar, sedangkan kencur berdaun sempit berimpang kecil. Kencur berdaun lebar banyak dibudidayakan di Jawa Barat terutama di daerah Bogor, sedangkan di Jawa Tengah dan Jawa Timur, petani umumnya menanam kencur berdaun sempit. Kencur berimpang kecil memiliki kandungan minyak atsiri lebih tinggi daripada kencur berimpang besar (Rostiana dan Djazuli 2007). Tewtrakul et al (2005) melaporkan bahwa komponen utama kencur adalah etil-p-metoksisinamat, metil sinamat, karvona, eukaliptol, dan pentadekana. Sedangkan sumber lain menyebutkan bahwa komponen utama kencur adalah β- pelandrena, α-terpineol, etilsinamat, dan dihidro-β-seskuipelandrena (Sudibyo 2000). Di bawah ini adalah tabel perbandingan komponen-komponen kencur perolehan Tewtrakul (2005) dan Sudibyo (2000).

23 7 Tabel 2. Perbandingan komponen-komponen kencur perolehan Tewtrakul 2005 dan Sudibyo 2000 Dari tabel tersebut terlihat bahwa komponen yang terkandung dalam kencur berbeda, hal ini disebabkan karena adanya perbedaan iklim dan kondisi geografis dari area pengambilan sampel yang berbeda sehingga berpengaruh terhadap produksi dari komponen minyak atsirinya (Tewtrakul et al. 2005). Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan komponen yang didasarkan pada distribusi diferensial dari komponen sampel diantara 2 fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Dengan adanya fase diam maka campuran pelarut akan terpisah sepanjang kolom berdasarkan pada perbedaan laju migrasi dari berbagai macam pelarut. Metode pemisahan yang paling umum digunakan adalah kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Kromatografi kolom merupakan teknik analisis yang digunakan dalam penentuan jumlah komponen yang terdapat pada suatu campuran senyawa, pemisahan, dan pemurnian komponen senyawa tertentu dari campurannya. Pada pemisahan kromatografi kolom, suatu pelarut

24 8 pengelusi dialirkan secara kontinu melewati kolom, kemudian komponenkomponen dari campuran senyawa yang dipisahkan keluar dari kolom, dikumpulkan, dan difraksinasi. Umumnya, silika gel digunakan sebagai fase diam kromatografi kolom, karena memiliki luas relatif yang besar. Proses elusinya dapat berupa elusi isokratik ataupun elusi gradien (Harvey 2000). Hasil pemisahan dengan kromatografi kolom dapat dianalisis lebih lanjut menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan jenis kromatografi partisi yang menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam yang keras sebagai fase diam. Fase diam KLT tersebut seringkali mengandung substansi yang dapat berpendar dalam sinar ultraviolet. Kemudian fase gerak pada KLT merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Pergerakan zat relative terhadap garis depan pelarut dalam sistem kromatografi lapis tipis dapat didefinisikan sebagai nilai Rf, yaitu perbandingan jarak tempuh zat dengan jarak tempuh garis depan pelarut. Teknik pemisahan kromatografi kolom dan KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa yang terkandung dalam minyak atsiri. Identifikasi senyawa yang terkandung dalam minyak atsiri tersebut dapat dilakukan dengan menggunakan metode GC-MS. GC-MS GC-MS (Gas chromatographic mass spectroscopy) atau kromatografi gas merupakan instrumen untuk identifikasi senyawa organik yaitu penentuan bobot molekul dan penentuan rumus molekul. Alat ini merupakan gabungan antara kromatografi gas dengan spektrometer massa. Komponen dasar dari instrumen GC-MS berupa gas kromatografi inlet, kamar ionisasi, penganalisa massa, detektor, dan rekorder. Kromatografi gas (GC) merupakan kromatografi partisi dari salah satu jenis kromatografi kolom modern yang digunakan untuk memisahkan senyawa yang mudah menguap (volatil) dan tidak mengalami dekomposisi akibat pemanasan. Sistem pemisahan pada GC umumnya didasarkan pada perbedaan tekanan uap dari masing-masing komponen yang akan

25 9 dipisahkan. Fase diam GC dapat berupa padatan atau cairan. Sedangkan fase geraknya berupa gas pembawa yang bersifat inert seperti He, N 2, dan H 2 (Skoog et al. 2004). Instrumentasi GC yang menggunakan spektrometer massa (MS) sebagai detektor dapat digunakan untuk memisahkan campuran komponen dalam suatu sampel (GC komponen) sekaligus mengidentifikasi komponen-komponen tersebut pada tingkat molekuler (MS komponen). Oleh karena itu, prinsip kerja GC-MS lebih baik daripada prinsip kerja dan analisis dari GC. Senyawa-senyawa yang terpisah dari analisis GC akan keluar dari kolom dan mengalir ke dalam MS. MS kemudian mengidentifikasi senyawa-senyawa tersebut berdasarkan bobot molekul senyawanya. Molekul-molekul analat yang bersifat netral diubah menjdi ion-ion dalam fase gas. Ion-ion yang dihasilkan kemudian dipisahkan menurut rasio massanya untuk menghitung rasio (m/e) yang didasarkan pada suatu proses yang analog dengan disperse cahaya oleh prisma pada panjang gelombang tertentu. Spektrum massa dari analat yang muncul dibandingkan dengan spectrum pada library MS sehingga akan diketahui bobot molekul dari analat tersebut. Hal ini disebabkan spektrum massa adalah gambaran antara limpahan relatif lawan perbandingan massa/muatan (m/e atau m/z) (Skoog et al. 2004). Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance) Spektroskopi nuclear magnetic resonance atau resonansi magnet inti (RMI) termasuk ke dalam spektroskopi absorpsi seperti halnya dengan spektroskopi inframerah atau spektroskopi ultraviolet. Dasar dari spektroskopi nmr adalah absorpsi radiasi elektromagnetik dengan frekuensi radio oleh inti atom. Frekuensi radio berkisar 0.1 sampai 100 MHz atau sama dengan panjang gelombang antara 3000m dan 3m. Inti atom hidrogen atau proton mempunyai sifat-sifat magnet. Bila suatu senyawa mengandung hidrogen diletakkan dalam bidang magnet yang sangat kuat dan diradiasi dengan radiasi elektromagnetik maka inti atom hidrogen dari senyawa tersebut akan menyerap energi melalui suatu proses absorpsi yang

26 10 dikenal dengan resonansi magnet. Absorpsi radiasi terjadi bila kekuatan medan magnet sesuai dengan frekuensi radiasi elektromagnetik. Spektrometer resolusi tinggi memiliki komponen pokok magnet, tempat sampel, generator FR, osilator FR, detektor FR, dan rekorder. Adapun prinsip kerja NMR adalah sampel diletakkan diantara 2 kutub magnet dan disinari denga gelombang radio. Bila proton-proton membalik dari keadaan paralel ke keadaan anti paralel, penyerapan energi akan dideteksi oleh suatu indikator daya atau power. Pada spektrometer nmr frekuensi radionya dibuat tetap pada 60 MHz, sedangkan medan magnet luar diubah-ubah dalam suatu jangka kecil dan frekuensi absorpsi energinya direkam. Jadi spektrum nmr ialah grafik dari benyaknya energi yang diserap dengan kuat medan magnet. Spektrum nmr merupakan nilai pergeseran kimia dari berbagai tipe proton yang relatif terhadap kedudukan pembanding tetrametilsilan (TMS). TMS digunakan sebagai pembanding eksternal karena memiliki beberapa keuntungan tidak mudah ereaksi, mudah menguap, larut dalam kebanyakan pelarut organik dan memberikan puncak absorpsi tunggal yang tajam pada pergeseran kimia 0 ppm. Pengujian In Vivo Pengujian secara in vivo merupakan model pengujian potensi sampel dalam tubuh mahluk hidup seperti tikus, mencit, kelinci, dan kera. Yamamoto et al. (2000) menyatakan bahwa ekstrak herba Nomame dapat menghambat enzim lipase CT II sehingga efektif untuk mengatasi kegemukan pada tikus Sprague dawley. Pramono et al. (2000) melakukan pengujian antiobesitas secara in vivo terhadap Rattus norvegicus (tikus putih) dan menyatakan bahwa lendir daun jati belanda dapat menghambat aktivitas enzim lipase pankreas. Selain secara oral, pengujian secara in vivo juga umum digunakan untuk analisis sampel di bidang aromaterapi. Pengggunaan hewan model dalam pengujian in vivo harus disesuaikan dengan tujuan penggunaannya. Hewan model juga harus memiliki karakteristik mudah diperoleh dan dipelihara, mudah ditangani, mudah direproduksi dalam kondisi laboratorium, dan memiliki karakteristik genetik yang terdefinisi dengan

27 11 baik. Tikus merupakan hewan uji kedua terbesar yang digunakan sebagai hewan model setelah mencit. Tikus yang biasa dijadikan sebagai hewan model berasal dari jenis Sprague dawley, Wistar, dan Long evans. Jenis Sprague dawley dan Wistar merupakan jenis yang lazim digunakan di Indonesia. Jenis kelamin dari hewan model juga perlu dijadikan pertimbangan. Umumnya, pengujian in vivo menggunakan hewan uji jantan untuk menghindari adanya pengaruh hormonal seperti hormon estrogen terhadap kondisi tubuhnya. Karena hormon estrogen dapat mempengaruhi konsentrasi kolesterol darah dalam tubuh hewan uji yang selanjutnya berpengaruh terhadap kegemukan hewan uji tersebut.

28

29 BAHAN DAN METODE Alat-alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan adalah peralatan gelas, neraca analitik, pembakar Bunsen, rangkaian alat distilasi uap, kolom kromatografi, pipa kapiler, GC-MS, alat bedah, rangkaian alat inhalasi. Bahan-bahan yang digunakan adalah rimpang kencur, akuades, n-heksana, metanol, aseton, kloroform, dietil eter, etil asetat, silika gel, batu didih, pakan standar tikus, pakan kolesterol tinggi tikus, larutan pereaksi kolesterol, larutan pereaksi trigliserida. Metode Metode penelitian yang dilakukan mengikuti Gambar 1: Gambar 1. Alur penelitian

30 14 Pada tahap preparasi sampel, sampel kencur segar yang berusia sekitar tahun diperoleh dari pasar induk Kramat Djati. Sampel dideterminasi di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI-Bogor (Lampiran 1), diuji kadar air, dan kadar abu. Isolasi minyak atsiri kencur dilakukan dengan menggunakan destilasi. Minyak atsiri yang diperoleh disimpan dalam botol tertutup. Untuk memisahkan senyawa-senyawa yang terkandung dalam destilat minyak atsiri kencur, terlebih dahulu dilakukan penentuan eluen terbaik menggunakan KLT. Selanjutnya fraksinasi dilakukan menggunakan kromatografi kolom. Fraksi-fraksi yang telah diperoleh dianalisis jumlah nodanya. Fraksi dengan rendemen terbanyak, fraksi murni, dan distilat minyak atsiri kencur dianalisis menggunakan GC-MS untuk menentukan kandungan senyawanya. Ketiga sampel ini disimpan di dalam botol untuk kemudian diujikan pada hewan uji untuk mengetahui potensinya sebagai pelangsing atau penurun kolesterol aromaterapi. Metode analisis minyak atsiri yang berpotensi sebagai pelangsing aromaterapi pada hewan uji digambarkan dalam Gambar 2. Gambar 2. Metode analisis minyak atsiri yang berpotensi sebagai pelangsing aromaterapi pada hewan uji

31 15 Hewan uji yang digunakan adalah tikus putih jantan galur Sprague-dawley (Yamamoto et al. 2000). Tikus yang digunakan sebanyak 40 ekor berusia 8 minggu dengan bobot badan gram. Tikus dikelompokkan menjadi 5 kelompok. Setiap kelompok berjumlah 8 ekor yang ditempatkan di dalam kotak plastik bertutup kawat yang berisi 4 ekor tikus untuk setiap kotak. Jadi setiap kelompok ditempatkan dalam 2 kotak. Adapun penggolongan kelompoknya yaitu kelompok kontrol normal, kontrol negatif, atsiri kasar, Fraksi 2, dan kristal. Kelompok kontrol normal merupakan kelompok yang diberi pakan standar dan tidak diinhalasi. Kelompok kontrol negatif merupakan kelompok yang diberi pakan kolesterol tinggi dan tidak diinhalasi. Kelompok atsiri kasar diberi pakan kolesterol tinggi dan diinhalasi minyak atsiri kasar hasil destilasi uap dari rimpang kencur. Kelompok Fraksi 2 diberi pakan kolesterol tinggi dan diinhalasi menggunakan Fraksi 2 yang merupakan Fraksi dengan rendemen terbanyak. Kelompok kristal diberi pakan kolesterol tinggi dan diinhalasi menggunakan Fraksi senyawa murni.. Masa perlakuan dilakukan selama 5 minggu. Pemberian pakan dilakukan setiap hari, sehingga bobot pakan ditimbang setiap hari. Bobot badan tikus ditimbang setiap 1 minggu sekali. Pada minggu ke-5, setelah perlakuan selesai, dilakukan analisis secara fisik meliputi parameter persentase kenaikan bobot badan, bobot lemak dan hati. Adapun analisis uji darah meliputi kadar kolesterol, trigliserida dan HDL darah hewan uji. Metode analisis darah Metode analisis darah diawali dengan pengumpulan darah pada minggu ke- 5 setelah masa perlakuan. Darah diambil di bagian ekor hewan uji. Darah disentrifuga kemudian dipisahkan serum darahnya (bagian cairan jernih) dan disimpan dengan baik di lemari pendingin. Uji analisis darah yang dilakukan adalah analisis profil lipid meliputi pengukuran kadar kolesterol, kadar trigliserida, kadar high density lipoprotein (HDL). Berikut adalah cara kerja analisis profil lipid yang dilakukan di Pusat Studi Satwa Primata (PSSP) IPB:

32 16 1. Pengukuran kadar kolesterol total Serum darah sebanyak 0,01 ml dipipet ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan larutan pereaksi kolesterol sebanyak 1 ml. Serapannya diukur pada panjang gelombang 500 nm terhadap blanko. Sebagai blanko digunakan pereaksi kolesterol 1 ml dan akuades 0,01 ml. Pengukuran serapan standar sama dengan pengukuran serapan sampel, tetapi serum darah diganti dengan standar kolesterol. Kadar kolesterol total dihitung menggunakan rumus: Keterangan : C = kadar kolesterol (mg/dl) A = serapan C Standar = kadar kolesterol standar Larutan pereaksi kolesterol dari PT. Rajawali Nusindo terdiri dari buffer ph 6.5, fenol, 4-aminofenazon, kolesterol esterase, kolesterol oksidase, peroksidase, sodium azida, standar kolesterol. 2. Pengukuran Kadar Trigliserida Serum darah sebanyak 0,01 ml dipipet ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan larutan pereaksi trigliserida sebanyak 1 ml. Serapannya diukur pada panjang gelombang 500 nm terhadap blanko. Sebagai blanko digunakan pereaksi trigliserida 1 ml dan akuades 0,01 ml. Pengukuran serapan standar sama dengan pengukuran serapan sampel, tetapi serum darah diganti dengan standar trigliserida. Kadar trigliserida total dihitung menggunakan rumus: Keterangan : C = kadar trigliserida (mg/dl) A = serapan C Standar = kadar trigliserida standar Larutan pereaksi trigliserida dari PT. Rajawali Nusindo terdiri dari buffer ph 7.5, 4-klorofenol, gliserolkinase, peroksidase, lipase, ATP, 4- aminoantipirin, ion magnesium, gliserol-3-fosfat oksidase, standar trigliserida.

33 17 3. Pengukuran kadar HDL Serum darah sebanyak 0,02 ml dipipet ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 0,5 ml larutan pengendap kemudian disentrifuga. Pisahkan supernatannya sebanyak 0,01 ml, kemudian ditambahkan larutan pereaksi kolesterol sebanyak 1 ml ke dalam supernatan. Serapannya diukur pada panjang gelombang 500 nm terhadap blanko. Sebagai blanko digunakan pereaksi kolesterol 1 ml dan akuades 0,01 ml. Kadar HDL dihitung menggunakan rumus: Keterangan : C = kadar HDL (mg/dl) A = serapan C Standar = kadar kolesterol standar Metode analisis bobot hati dan bobot deposit lemak pada hewan uji Metode analisis bobot hati dan bobot deposit lemak dilakukan pada minggu ke-5 setelah masa perlakuan. Masing-masing tikus dari setiap kelompok perlakuan dikeluarkan hati dan deposit lemaknya. Kemudian ditimbang bobot hati dan deposit lemaknya. Adapun lemak yang diambil adalah lemak pada perut bagian bawah, dan lemak yang membungkus organ di bagian perut. Metode analisis data Data yang diperoleh dari percobaan akan dianalisis dengan metode rancangan acak lengkap (RAL) dan ANOVA (analysis of variance) pada tingkat kepercayaan 95% (taraf α 0.05). Nilai P<0.05 menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang nyata terhadap respon yang diukur. Uji lanjut yang digunakan adalah uji Duncan. Semua data ini dianalisis dengan program SPSS 16.

34

35 HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air dan Kadar Abu Sampel kencur segar yang berusia sekitar tahun diperoleh dari pasar induk Kramat Djati. Sampel kemudian ditentukan kadar air dan abunya. Penentuan kadar air dilakukan untuk mengetahui kandungan air di dalam suatu sampel. Selain itu kadar air pun berguna untuk mengetahui ketahanan penyimpanan suatu sampel. Sampel akan relatif lebih tahan lama jika mengandung kadar air < 10 %, karena pada kadar tersebut sampel terhindar dari mikroba (Winarno 1995). Pada penelitian ini, sampel yang merupakan rimpang kencur segar memiliki kadar air 85.3 % (Lampiran 2). Hal ini dikarenakan sampel selanjutnya akan diproses melalui distilasi uap sehingga diperoleh minyak atsiri kencur. Maka pemilihan sampel segar merupakan pilihan yang terbaik agar meminimalkan kerusakan dan kehilangan komponen atsiri yang diperoleh karena minyak atsiri mengandung komponen yang volatil (mudah menguap). Penentuan kadar abu juga dilakukan pada sampel. Kadar abu ini berguna untuk mengidentifikasi kandungan mineral-mineral logam pada sampel. Batas maksimum kadar abu tanaman herbal yang dapat digunakan sebagai obat adalah 5% (Dalimartha 2005). Kadar abu sampel ini adalah 1,35 % berdasarkan bobot basah (Lampiran 2). Kadar abu ini masih di bawah batas maksimum kadar abu tanaman herbal yang dapat digunakan sebagai obat, oleh karena itu sampel ini dapat digunakan sebagai obat. Isolasi Minyak Atsiri Kencur Menggunakan Destilasi Isolasi minyak atsiri dari kencur dilakukan menggunakan destilasi dengan pelarut akuades. Untuk memperoleh 1,2-1,7 ml minyak atsiri kencur dibutuhkan 500g kencur segar, kemudian kencur didestilasi selama 3 jam. Selama proses distilasi suhu pelarut diatur pada ºC, yaitu suhu pada saat air mendidih. Ketika mendidih, uap air akan membawa komponen-komponen minyak atsiri yang kemudian tersimpan di penampung. Pada penampung akan langsung

36 20 terbentuk 2 lapisan, yaitu destilat dan residu. Destilat adalah minyak atsiri kencur, sedangkan residu adalah lapisan air yang berada di bawah minyak atsiri kencur. Oleh karena destilat dan residu ini memiliki perbedaan fase, yaitu fasa minyak dan air, maka keduanya dapat dengan mudah dipisahkan. Gambar 3. Minyak(pertama dan kedua dari kiri) dan Kristal (ke-3 dan 4 dari kiri) yang diperoleh dari hasil distilasi Rendemen minyak atsiri yang dihasilkan dari sampel ini sebesar 0.3%. Indeks bias minyak atsiri sebesar 1,4958 pada suhu 20ºC diukur menggunakan refraktometer Abbe-Atago NAR-3T. Densitas minyak atsiri kencur sebesar 0,9433 g/ml yang dibandingkan dengan densitas air sebesar 1,043 g/ml (Lampiran 3). Pembandingan minyak atsiri kencur dengan air ini bertujuan sebagai faktor koreksi. Minyak atsiri kencur hasil distilasi diidentifikasi lebih lanjut menggunakan GC-MS (Gas Chromatograph-Mass Spektrometer), kemudian diuji aktivitasnya sebagai pelangsing aromaterapi secara in vivo. Karena dari hasil distilasi ini diperoleh kristal dan diduga bahwa kristal tersebut adalah senyawa murni, maka kedua kristal diidentifikasi lebih lanjut menggunakan GC-MS dan NMR (Nuclear Magnetic Resonance). Untuk tahapan kerja selanjutnya minyak atsiri kencur yang diperoleh dari hasil destilasi dilanjutkan ke kromatografi kolom untuk memperoleh fraksi dengan rendemen terbanyak dimana sebelumnya minyak atsiri kencur tersebut ditentukan terlebih dahulu eluen terbaik menggunakan KLT. Penentuan Eluen Terbaik Penentuan eluen terbaik dilakukan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dengan fase diam silika G 60 F 254 dari Merck dan menggunakan beberapa pelarut dengan rentang non polar ke semi polar. Di bawah ini adalah profil kromatogram minyak atsiri kencur setelah dielusi menggunakan beberapa pelarut, kemudian dianalisis di bawah lampu UV λ 254 nm.

37 21 H K DE EA Ac M K:H K:H K:H K:H H:EA H:EA H:M 4:6 1:1 6:4 7:3 1:1 9:1 9:1 Ket : H : n-heksana K : kloroform DE : dietil eter EA : etil asetat Ac : aseton M : metanol K:H : kloroform:n-heksana H:Ea : n-heksana:etil asetat H:M : n-heksana:methanol (H:M) Gambar 4. Profil kromatogram minyak atsiri kencur dengan berbagai eluen tunggal dan eluen campuran. Gambar di atas adalah profil kromatogram minyak atsiri kencur dengan berbagai eluen secara berturut-turut dari kiri ke kanan n-heksana (H); kloroform (K); dietil eter (DE); etil asetat (EA); aseton (Ac); metanol (M); dan eluen campuran berturut-turut kloroform:n-heksana (K:H); n-heksana:etil asetat (H:EA); n-heksana:methanol (H:M). Maka dapat diambil suatu kesimpulan bahwa pelarut tunggal n-heksana menghasilkan jumlah noda terbanyak dan terpisah, yaitu 6 noda dibandingkan dengan pelarut tunggal lain dan campuran 2 pelarut. Oleh karena itu n-heksana dipilih sebagai eluen terbaik karena menghasilkan jumlah noda terbanyak dan terpisah (Skoog et al 2004). Maka eluen terbaik ini akan dijadikan dasar dalam penentuan fraksi hasil pemisahan minyak atsiri kencur menggunakan kromatografi kolom.

38 22 Fraksinasi Minyak Atsiri Kencur Minyak atsiri kencur dipisahkan menggunakan kromatografi kolom untuk mengidentifikasi komponen-komponen yang terkandung di dalam minyak atsiri kencur. Fase diam yang digunakan adalah silika gel dan proses elusinya dilakukan secara gradien (peningkatan kepolaran), karena dengan menggunakan peningkatan polaritas sistem eluen, semua komponen dalam sampel tersebut akan terbawa lebih cepat keluar kolom (Harvey 2000). Sampel sebanyak 2 g dimasukan ke dalam kolom diameter 2 cm dan panjang 30 cm. Sampel kemudian dielusi menggunakan dua pelarut n-heksana dan kloroform dengan berbagai perbandingan. Fraksi yang sudah terpisahkan kemudian ditampung dalam vial sebanyak 5 ml. Kemudian dianalisis menggunakan teknik KLT dengan silika G 60 F 254 sebagai fase diam, dan fase gerak berupa eluen terbaik dari hasil analisis sebelumnya yaitu pelarut tunggal n-heksana. Di bawah ini profil KLT hasil fraksinasi minyak atsiri kencur menggunakan kromatografi kolom. Gambar 5 Profil kromatogram hasil fraksinasi minyak atsiri kencur. Dengan panduan dari profil KLT di atas, vial-vial yang memiliki noda sama kemudian digabungkan menjadi satu fraksi, sehingga diperoleh 11 fraksi. Setiap vial memiliki bau khas yang berbeda-beda. Bau khas tersebut menandakan senyawa atsiri yang sudah terfraksinasi dan terbawa oleh eluen. Di bawah ini adalah tabel hasil fraksinasi minyak atsiri kencur menggunakan kromatografi kolom.

39 23 Tabel 3. Hasil fraksinasi minyak atsiri kencur dengan kromatografi kolom (elusi gradien) Tabel di atas menunjukkan bahwa fraksinasi minyak atsiri kencur menghasilkan 11 fraksi. Fraksi 2 memiliki rendemen terbesar yaitu, 28.42%. Karena Fraksi 2 ini merupakan fraksi dengan rendemen terbanyak, dan memiliki bau khas yang berbeda dengan minyak atsiri kencur, maka Fraksi 2 dilanjutkan dengan analisis GC-MS untuk mengidentifikasi komponen yang terkandung di dalamnya, dan diuji aktivitasnya sebagai pelangsing aromaterapi secara in vivo. Analisis GC-MS Minyak Atsiri Kencur, Fraksi 2, Kristal Fase Air, dan Kristal Fase Minyak Identifikasi minyak atsiri kencur, Fraksi 2, kristal fase air, dan kristal fase minyak dilakukan dengan menggunakan Agilent Technologies 6890 Gas Chromatograph with Auto Sampler and 5973 Mass Selective Detector and Chemstation data system. Dengan parameter operasinya sebagai berikut, gas pembawa Helium, kolom menggunakan HP WAX 25 (m) X 0.25 (mm) I.D X 0.25 (µm) Film Thickness, temperatur kolom ºC, temperatur interface 280ºC, temperatur sumber ion 230 ºC, volume injek 1µL, dan mode laju alir konstan. Kondisi spektrometer massanya adalah energi ionisasi 70 ev, mode