METODOLOGI Waktu dan Tempat Penelitian Bahan Ekstrak Teh Hijau Hewan coba

Transkripsi

1 13 METODOLOGI Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan selama bulan Pebruari 2008 sampai dengan Mei 2008 di Laboratorium Hewan SEAFAST IPB dan Laboratorium Anatomi Fisiologi dan Farmakologi FKH IPB. Bahan Ekstrak Teh Hijau Teh hijau yang digunakan adalah teh hijau (Camellia sinensis) klon Gambung VII dengan kandungan katekin 15,9% dari berat kering (Santoso et al. 2006). Persiapan ekstrak dilakukan menurut SNI (Standar Nasional Indonesia) mengenai teh hijau. Sebanyak 16 gram teh hijau kering diseduh dengan 1 L air mendidih dan ditutup. Sepuluh menit kemudian, seduhan disaring dan didinginkan dalam suhu ruang. Ekstrak teh hijau kondisi asam dipersiapkan dengan menambahkan asam sitrat pada ekstrak teh hijau yang didapat dari proses menyeduh tadi secara titrasi sehingga didapat ph 4. Ekstrak teh hijau dan teh hijau kondisi asam dipersiapkan dan diberikan ad libitum sebagai air minum setiap hari, sedangkan sisa teh pada hari sebelumnya diukur volumenya lalu dibuang. Hewan coba Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 20 ekor tikus putih betina galur Sprague Dawley usia 8 minggu yang diperoleh dari Laboratorium Genetika Fakultas Peternakan IPB dengan berat badan 54.9 ± 1.58 gram (Lampiran XX). Tikus ditempatkan dalam kandang plastik yang berisi satu ekor tikus untuk setiap kandang. Kandang disusun dalam rak bertingkat 4, masingmasing berisi 5 kandang dalam ruangan dengan siklus gelap terang 12 jam. Suhu ruangan berkisar antara C. 13

2 14 Pakan tikus Dalam penelitian ini terdapat 2 jenis pakan, yakni pakan dengan komposisi standar berupa pelet dan pakan dengan komposisi tinggi lemak menurut Axen et al dengan modifikasi untuk menginduksi kelainan terkait sindroma metabolik. Sumber lemak yang digunakan untuk pakan standar adalah minyak jagung, sedangkan untuk pakan tinggi lemak adalah lemak kambing dan minyak jagung dengan perbandingan 6:1. Komposisi kedua jenis pakan dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Komposisi Pakan Tikus Percobaan (Axen et al.2006) Jenis Pakan Komposisi Tinggi Standar Lemak Kasein (g/kg) Minyak / lemak (g/kg) Mineral mix (g/kg) Serat (CMC) (g/kg) Vitamin mix (g/kg) Maizena (g/kg) Air (g/kg) Karbohidrat (%energi) Protein (% energi) Lemak (%energi) Energi (kal/g) Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kandang plastik, timbangan pegas, timbangan analitik digital, rat sfigmomanometer glukometer peralatan bedah, peralatan analisis laboratorium dan spektrofotometer Hitachi

3 15 Rancangan Penelitian Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan rancangan acak lengkap. Setelah adaptasi selama 2 minggu, tikus dibagi dalam 4 kelompok perlakuan, yakni diet standar seperti pada masa adaptasi (S), diet tinggi lemak dan air putih (TL), diet tinggi lemak dan ekstrak teh hijau (TLT), dan diet tinggi lemak dan ekstrak teh hijau kondisi asam (TLTA) selama (Gambar 5). Antar keempat kelompok tidak terdapat perbedaan bobot badan yang signifikan. Tikus ditimbang setiap minggu. Pada akhir minggu ke-10, seluruh tikus diperiksa tekanan darahnya dan dipuasakan selama 12 jam untuk selanjutnya dilakukan pemeriksaan kadar glukosa darah. Pada hari berikutnya, setelah dipuasakan selama 12 jam, tikus dikorbankan dan darah dari jantungnya diambil untuk dilakukan analisis kadar trigliserida dan kolesterol HDL serum. Lemak viseral (intraperitoneal) diambil untuk ditimbang. 20 ekor tikus adaptasi 2 minggu Kelompok S diet standar Kelompok TL diet tinggi lemak +air putih Kelompok TLT diet tinggi lemak + teh hijau Kelompok TLTA diet tinggi lemak + teh hijau kondisi asam -pengukuran bobot badan setiap minggu - pengukuran tekanan darah - pengukuran kadar gula darah - pengukuran kadar trigliserida - pengukuran kadar kolesterol HDL Gambar 5 Skema alur penelitian Data hasil pengukuran ditunjukkan dengan nilai rata-rata ± SD. Untuk menentukan adanya pengaruh dari perlakuan, signifikansi antara kelompok yang berbeda ditentukan dengan uji ANOVA 1 arah. Bila terdapat perbedaan yang signifikan, uji dilanjutkan dengan uji Tukey. Nilai P < 0,05 dinyatakan signifikan. Pengolahan data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak SPSS 11.5 for Windows.

4 16 Pengukuran Parameter Sindroma Metabolik Pengukuran Bobot Badan dan Lemak Viseral Pengukuran bobot badan dilakukan setiap minggu dengan menimbang tikus menggunakan timbangan pegas (Gambar 6). Pengukuran bobot jaringan lemak viseral dilakukan setelah tikus dikorbankan dengan mengambil lemak intraperitoneal abdomen dan menimbangnya memakai timbangan digital (Gambar 7a dan 7b). Gambar 6 Penimbangan Tikus (a) (b) Gambar 7 Pengambilan (a) dan penimbangan (b) lemak viseral Pengukuran Tekanan Darah Pengukuran tekanan darah dilakukan oleh dokter hewan, menggunakan sfigmomanometer Student dengan metode non invasive blood pressure (Gambar8a). Tikus ditempatkan dalam alat untuk memfiksasi, kemudian pada pangkal ekornya dipasang tail cuff untuk mendeteksi denyut aliran darah yang terhubung dengan oscillograph (Gambar 8b). Saat tikus telah tenang, alat dinyalakan. Penilaian hasil pengukuran dilakukan dengan membaca grafik yang tercetak oleh alat (CWE 2005).

5 17 (a) (b) Gambar 8 (a). Pengukuran Tekanan Darah Tikus dengan Metode Non Invasive Blood Pressure (b). Grafik Denyut Aliran Darah pada Ekor Tikus Pengukuran Kadar Glukosa Darah Pemeriksaan kadar glukosa darah dilakukan dengan metode enzimatik otomatis menggunakan glukometer Glucosure setelah tikus dipuasakan selama 12 jam. Sampel darah sebanyak satu tetes diperoleh dengan menusuk ujung ekor dengan jarum spuit steril sekali pakai. Sampel diteteskan pada strip uji disposibel yang terdiri atas membran yang mengandung reagen-reagen yang diperlukan untuk reaksi enzimatis. Heksokinase mengkatalisis reaksi adenosin trifosfat dan ion magnesium dengan glukosa pada sampel untuk menghasilkan glukosa 6 fosfat. Glukosa 6 fosfat adalah substrat untuk glukosa 6 fosfat dehidrogenase yang mengubah NAD pada strip menjadi NADH. Selanjutnya, diaforase mengkatalisis reaksi antara NADH dan tetrazolium untuk menghasilkan senyawa coklat formazan, yang secara langsung setara dengan konsentrasi glukosa plasma pada sampel. Refleksi cahaya dari strip uji yang mengandung hasil reaksi diukur untuk menghitung konsentrasi glukosa. Deteksi dilakukan oleh sebuah photocell. Terdapat hubungan kesetaraan antara jumlah cahaya yang direfleksikan dan jumlah glukosa yang terdapat pada sampel.

6 18 Pengukuran Kadar Trigliserida Serum Analisis untuk mengukur kadar trigliserida serum dilakukan menggunakan Triglyceride Analysis Kit merek Human. Sampel adalah serum yang berasal dari darah jantung yang diambil menggunakan spuit sesaat setelah tikus dimatikan dan dibedah. Kadar trigliserida ditentukan setelah reaksi hidrolisis enzimatik dengan lipase. Indikator yang digunakan adalah quinoneimin yang dibentuk dari hidrogen peroksida, 4-amino-antipirin dan 4-klorofenol di bawah pengaruh katalitik dari peroksidase. Prinsip reaksi: Trigliserida Gliserol + ATP Gliserol-3-fosfat + O 2 lipase GK GPO H 2 O aminoantipirin+ 4-klorofenol gliserol + asam lemak gliserol-3-fosfat + ADP dihidroksi aseton fosfat + H 2 O 2 POD quinoneimin + HCl + H2O Sampel serum atau standar diambil sebanyak 10 µl dan dicampurkan dengan 1000 µl pereaksi kit, kemudian dimasukkan ke dalam tabung lalu dicampurkan sampai homogen. Campuran diinkubasi pada suhu 37 C selama 5 menit, dan kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang (D) 500 nm. Perhitungan kadar trigliserida dilakukan dengan menggunakan rumus: Kadar Trigliserida (mg/dl): (absorbansi sampel ) x 200 mg/ dl (absorbansi standar) Analisis Kadar kolesterol HDL Serum Pengukuran kadar kolesterol HDL dilakukan dengan Cholesterol HDL Analysis kit. Sampel adalah serum yang berasal dari darah jantung yang diambil menggunakan spuit sesaat setelah tikus dimatikan dan dibedah. Pengukuran dilakukan dengan terlebih dahulu melakukan presipitasi terhadap lipoprotein densitas rendah (LDL dan VLDL) dan kilomikron. Presipitasi dilakukan dengan penambahan asam fosfotungstat dan ion magnesium(mgcl 2 ). Setelah proses sentrifugasi, HDL dalam supernatan diukur menggunakan pereaksi kit untuk pengukuran kadar kolesterol (CHOD-PAP).

7 19 a. Prosedur presipitasi Sebanyak 200 µl serum darah dicampurkan dengan 500 µl pereaksi presipitasi yang telah diencerkan dengan akuabides (rasio 4:1), kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Setelah sentrifugasi pada 1074 g (4000 rpm) selama 10 menit, dihasilkan supernatan yang siap untuk dianalisis. b. Prosedur analisis ul serum ul pereaksi yang telah diencerkan dengan akuabides, diinkubasi selama10 mnt, lalu disentrifugasi selama 10 menit pada 4000 rpm. - Sebanyak 100 ul supernatan yang dihasilkan dicampur dengan 1000 ul pereaksi (kolesterol esterase, kolesterol oksidase, fenol, 4-aminoantipirin, peroksidase dan buffer). - Campuran diinkubasi pada suhu 37 C selama 5 menit. - Absorbansi dibaca pada D=500 nm Perhitungan kadar kolesterol HDL: Kadar HDL (mg/dl): (absorbansi sampel) X 200 mg/dl (absorbansi standar)