BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Materi Sampel Darah Kambing Primer Bahan dan Alat Analisis PCR

Transkripsi

1 13 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan mulai bulan Juni 2010 hingga Januari Lokasi pengambilan sampel darah dan susu kambing dilakukan di PT Fajar Taurus Dairy Farm dan PT Elang 45. Analisis keragaman gen dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler Bagian Pemuliaan dan Genetika Ternak Fakultas Peternakan IPB, sementara pengujian kualitas susu dan produk olahan susu dilaksanakan di Laboratorium Pengolahan Susu Bagian THT Fakultas Peternakan IPB dan Laboratorium Terpadu IPB. Materi Sampel Darah Kambing Ternak yang digunakan dalam penelitian ini adalah kambing Saanen dan Peranakan Etawah yang berjumlah 89 ekor. Pengambilan sampel darah dilakukan untuk masing-masing individu ternak kambing. Alat dan bahan untuk pengambilan sampel darah berupa venoject, vacutainer dan etanol. Ekstraksi DNA menggunakan metode fenol kloroform (Sambrook et al.1989). Primer Primer adalah DNA utas tunggal dengan ukuran pendek, biasanya 18 sampai 25 basa, yang akan menempel pada DNA cetakan pada tempat yang spesifik. Primer berguna untuk mengapit sekuen DNA target pada reaksi PCR. Pada penelitian ini, primer forward dan reverse untuk mengamplifikasi gen GH ditunjukkan pada Tabel 3. Tabel 3. Primer untuk amplifikasi gen GH No. Sekuens (5'-3') Pustaka 1. Forward GGA AGG GAC CCA ACA ATG CCA Kioka et al. 2. Reverse CTG CCA GCA GGA CTT GGA GC 1989 Bahan dan Alat Analisis PCR Bahan yang digunakan untuk PCR adalah DNA, pereaksi PCR (Master mix- Genaid) yang terdiri atas enzim tag DNA polymerase, 10x buffer, larutan MgCl 2, dntps, primer forward dan reverse fragmen gen GH. Peralatan yang

2 14 digunakan adalah pipet tip, mikropipet, microtube eppendorf, microsentrifuge dan mesin thermocycler. Bahan dan Alat Analisis PCR-SSCP Bahan yang digunakan untuk analisis PCR-SSCP adalah air destilasi steril, akrilamida 30%, 5 x TBE, TEMED (tetramethylendiamine) dan APS (ammonium persulfat) 10 %, loading dye dan marker 100 pb (Biorad). Alat yang digunakan adalah dua buah kaca untuk cetakan gel, pipet berskala, tabung reaksi, sisir khusus untuk sumur, pipet mikro Eppendorf 2 µl dengan tipsnya dan power supply 200 Volt. Bahan dan Alat Pewarnaan Perak Bahan yang digunakan adalah larutan yang terdiri atas 0.2 gram AgNO 3 ; 80 µl NaOH 10 N ; 0.8 ml NH 4 OH dalam 200 ml air destilasi, larutan 6 gram NaOH dengan 200 µl formaldehida dan asam asetat 200 µl dalam 200 ml air. Alat yang digunakan adalah gelas ukur, labu Erlenmeyer dan water-bath shaker. Bahan dan Alat Analisis Kualitas Susu Kambing dan Mentega Sampel susu diambil dari ternak kambing Saanen dan PE. Pengolahan susu yang dilakukan adalah pemisahan lemak susu dengan separator krim. Sebelum dilakukan pengolahan susu dilakukan pengujian terhadap kualitas susu segar. Bahan yang digunakan untuk analisis susu dan mentega susu kambing antara lain H 2 SO 4, alkohol 70%, Aquadest, NaOH 0.1 N, amilalkohol, fenolftalin, NaOH, kalium oksalat, K 2 SO 4, HgO dan formalin. Peralatan yang digunakan antara lain laktodensimeter, butirometer, pipet volumetric, ph-meter, inkubator, autoklaf, timbangan analitik, termometer, labu Kjeldahl, alat titrasi, alat-alat gelas, sentrifuse, wadah plastik, desikator, cawan porselen, tanur, alat ekstraksi Sokhlet, oven 105ºC dan penangas air.

3 15 Metode I. Identifikasi Keragaman Molekuler a. Pengambilan Sampel Darah (Sulandari & Zein 2003) Pengambilan sampel darah kambing dilakukan menggunakan venoject pada bagian vena jugularis sebanyak 2 ml. Sampel darah selanjutnya dicampur dengan etanol 70% untuk menghindari kerusakan sel-sel darah. b. Ekstraksi DNA ( Sambrook 1989) DNA diekstraksi dengan menggunakan metode fenol kloroform (Sambrook et al.1989). Sampel darah total yang disimpan dalam etanol 95% disentrifugasi 3500 rpm selama 5 menit. Endapan sel-sel darah yang diperoleh dicuci dengan buffer TE sebanyak 2 kali. Sekitar 100 µl sel-sel darah yang telah bebas dari etanol disuspensikan dengan 1xSTE sampai volume mencapai 350 µl. Sel-sel darah kemudian dilisis dengan 20 µl proteinase K (10 mg/ml) dan 40 µl 10% SDS. Campuran ini dikocok pelan-pelan selama 2 jam pada suhu 55 o C. Pemurnian DNA dilakukan dengan metode fenol-kloroform, yaitu dengan menambahkan 1/10 volume 5 M NaCl, 1 x volume larutan fenol, dan 1 x volume kloroform iso amil alkohol (24:1), kemudian dikocok pelan-pelan pada suhu ruang selama 2 jam. Fase DNA dipisahkan dari fase fenol dengan sentrifugasi pada kecepatan 7000 rpm selama 5 menit. Molekul DNA diendapkan dengan menambahkan 1/10 x volume 5 M NaCl dan 2 x volume etanol absolut. Endapan DNA yang dihasilkan selanjutnya dicuci dengan etanol 70% kemudian diendapkan lagi dengan kecepatan 7000 rpm selama 5 menit. Sisa etanol dibuang dan diuapkan dengan menggunakan pompa vakum. DNA selanjutnya dilarutkan dengan 80 µl 80% buffer TE. c. Amplifikasi Gen dengan Tehnik PCR Teknik PCR dilakukan untuk memperbanyak (amplifikasi) fragmen gen menjadi 2 n copy. Dengan perbanyakan ini maka fragmen gen target dapat divisualisasikan pada gel elektroforesis.

4 16 Reaksi PCR dilakukan dengan volume total 25 µl dari campuran larutan yang terdiri atas 2 µl DNA genom, 1 U enzim taq polimerase dan 10X buffernya (New England Biolab); 2 mm dntp mix; 2.5 mm MgCl 2 dan dh 2 O steril. Kondisi reaksi PCR dalam mesin thermocycler dirancang dengan suhu pradenaturasi 94 o C selama 4 menit, selanjutnya 30 siklus reaksi yang terdiri atas denaturasi 95 o C selama 30 detik, annealing (suhu spesifik primer) selama 1 menit, perpanjangan 72 o C selama 1 menit. Pemanjangan akhir pada suhu 72 o C selama 5 menit. Suhu annealing untuk primer gen GH 60 o C. d. Genotiping Teknik PCR-SSCP (Tegelstrom 1992) Genotiping dengan teknik SSCP menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid 10%. Gel dibuat dengan cara pencampuran 14 ml air destilata; 2.5 ml larutan 5 x TBE; 8,3 ml larutan akrilamid 30%; 15 µl larutan TEMED dan 150 µl APS 10%. Sebanyak 2 µl produk PCR dicampur dengan + 25 µl loadying dye (bromthymol blue 0.01%, xilene cyanol 0.01 dan gliserol 50%). Elektroforesis dilakukan pada tegangan konstan 200 volt selama 16 jam. Setelah elektroforesis selesai, gel diambil untuk dilakukan pewarnaan perak. d. Visualisasi Pita DNA (Tegelstrom 1992) Visualisasi pola pita hasil SSCP menggunakan metode silver stainning atau pewarnaan perak. Tahapan pewarnaan perak yaitu gel dicuci secara bertahap sebagai berikut: dengan larutan AgNO gram, 80 µl NaOH 10 N, 800µl ammonia dalam 200 ml air destilasi selama 8 menit, kemudian dibilas dengan air destilasi selama 2 menit. Proses memunculkan pita dalam gel melalui gel perendam dalam larutan yang terdiri atas 6 gram NaOH/200 ml air destilata selama 6 menit ditambah 200 µl formaldehid. Setelah pita muncul, larutan asam asetat dituangkan untuk penghentian aktifitas oksidasi perak oleh formaldehida. II. Analisis Kualitas Susu Segar Analisis kualitas susu segar meliputi pemeriksaan BJ, kadar lemak, kadar protein dan bahan kering tanpa lemak.

5 17 a. Analisis Berat Jenis (Standar Nasional Indonesia 1992) Pengukuran berat jenis dilakukan dengan alat laktodensimeter. Sebanyak 100 ml susu pada suhu antara 20 0 C dimasukkan kedalam gelas ukur. Laktodensimeter dicelupkan perlahan-lahan. Nilai berat jenis dapat dibaca pada skala yang tertera pada laktodensimeter, kemudian dilakukan penyetaraan pada suhu C. Setiap perbedaan 1 0 C diatas atau di bawah C maka nilai berat jenisnya ditambah atau dikurangi b. Analisis Kadar Lemak (Standar Nasional Indonesia 1992) Pengukuran kadar lemak menggunakan metode Gerber. Sebanyak 10 ml asam sulfat pekat dimasukkan kedalam butirometer, kemudian ditambahkan 10.5 ml susu secara hati-hati melalui dinding mulut butirometer dan ditambahkan 1 ml amilalkohol. Setelah butirometer ditutup dengan sumbat karet dan dihomogenkan, butirometer dimasukkan ke dalam penangas air pada suhu 60 º C selama ± 10 menit. Tahap selanjutnya adalah sentrifugasi dengan menggunakan sentrifuge Gerber dengan kecepatan 1200 rpm selama 5 menit, kemudian butirometer dimasukkan kembali kedalam penangas air minimal 2 menit. Butirometer dipegang vertikal dan karet penutup diatur, sehingga tepat pada suatu garis pada skala butirometer dan dibaca persen kadar lemaknya. c. Analisis Kadar Protein (Standar Nasional Indonesia 1992) Dua puluh lima mililiter susu, 1 ml larutan kalium oksalat dan 0.25 fhenolftalin dimasukkan kedalam gelas beker, dicampur hingga homogen, dibiarkan selama 2 menit. Setelah homogen, campuran dititrasi dengan larutan NaOH dari buret sampai warnanya sama dengan warna standar (merah muda), kemudian larutan formalin sebanyak 2.5 ml ditambahkan kedalam campuran yang telah dititrasi, lalu dikocok hingga warna merah muda hilang, dibiarkan selama 1 menit. Campuran dititrasi kembali dengan NaOH sampai berwarna merah muda. Dihitung dan dicatat jumlah NaOH yang terpakai (p ml). Blanko dibuat dengan 10 ml aquades ditambah 0.4 ml kalium oksalat jenuh, 2 ml formalin 40% serta 2-3 tetes fenolftalein 1%, lalu dititrasi dengan larutan NaOH 0.1 N sampai terbentuk warna merah muda dan dicatat banyaknya NaOH 0.1 N yang terpakai (q ml).

6 18 Kadar Protein dihitung dengan rumus berikut: % protein = ( p-q ) x 1.95 (faktor formol untuk susu kambing) d. Bahan Kering dan Bahan Kering Tanpa Lemak (Standar Nasional Indonesia 1992) Perhitungan dilakukan setelah kadar lemak dan berat jenis diperoleh dengan rumus: BK = 1.23 L (BJ 1) BJ BKTL = BK L Keterangan : BK : Bahan Kering BKTL : Bahan Kering Tanpa Lemak L : Lemak BJ : Berat Jenis III. Analisis Kualitas Mentega Analisis kualitas kimia mentega yang dilakukan meliputi nilai ph, bilangan peroksida, kadar lemak, kadar protein, kadar abu, kadar air dan rendemen. a. Nilai ph (Association of Official Analytical Chemist 1995) Pengukuran nilai ph dilakukan dengan ph meter. Sebanyak 50 gram sampel mentega dilelehkan, kemudian suhunya diturunkan sesuai dengan suhu ruang. ph meter terlebih dahulu distandarisasi dengan buffer untuk ph 4 dan ph 7. Pengukuran dilakukan dengan mencelupkan elektroda ph meter kedalam sampel dan skala di baca setelah jarum penunjuk berada pada posisi tetap. b. Bilangan Peroksida (SNI ) Sebanyak 5 gram sampel ditimbang dan diletakkan dalam labu Erlenmeyer. Ditambahkan 30 ml pelarut (terdiri atas 60% asam asetat glasial dan 40% kloroform), lalu dihomogenkan. Ditambahkan 0.5 ml larutan potasium iodida jenuh lalu dihomogenkan, didiamkan selama 2 menit dalam ruangan gelap. Ditambahkan 30 ml air destilata dan selanjutnya larutan di titrasi dengan larutan sodium tiosulfat 0.1 N.

7 19 Keterangan : A = ml sodium tiosulfat yang dipakai N = normalitas sodium tiosulfat B = bobot equivalen oksigen G = berat sampel (gram) Bilangan peroksida = A x N x B x 100/ G c. Kadar Lemak (Association of Official Analytical Chemist 1995) Labu lemak yang ukurannya sesuai dengan alat ekstraksi Soklet yang akan digunakan dikeringkan dalam oven, didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Lima gram contoh ditimbang dalam selongsong lemak kemudian ditutup dengan kertas bebas lemak secukupnya, kemudian direflux selama 6 jam. Pelarut yang ada dalam labu didestilasi kemudian pelarutnya ditampung. Selanjutnya labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven selama 2 jam sampai berat tetap dan didinginkan dalam desikator. Labu beserta lemak tersebut ditimbang. Kadar lemak (%) = bobot labu lemak akhir bobot labu lemak awal x 100% Bobot sampel (g) d. Kadar Protein (Association of Official Analytical Chemist 1995) Metode yang digunakan adalah mikro Kjeldahl. Sampel sebanyak 0.1 gram dimasukkan kedalam labu Kjeldahl, lalu ditambahkan 1 g K 2 SO 4, 40 mg HgO dan 20 ml H 2 SO 4. Sampel yang diperoleh selanjutnya dididihkan sampai larutan menjadi jernih (sekitar 1 jam). Larutan jernih yang diperoleh ini dipindahkan ke dalam destilasi. Labu Kjeldahl dicuci dengan air (1-2 ml), kemudian air cuciannya dimasukkan kedalam alat destilasi dan ditambahkan 8-10 ml larutan NaOH-Na 2 S Dibawah kondensor diletakkan labu Erlenmeyer yang berisi 5 ml larutan H 3 BO 3 dan 2-4 tetes indikator (campuran metil merah 0.2 % dalam alkohol dan metil biru 0.2 % dalam alkohol dengan perbandingan 1:2) ujung kondensor harus terendam dalam larutan H 3 BO 3. Isi labu Erlenmeyer diencerkan sampai 50 ml, lalu dititrasi dengan HCl 0.02 N sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Blanko dipersiapkan dengan cara yang sama, tetapi sebagai ganti mentega digunakan aquades.

8 20 % N = (ml HCL ml blanko) x N HCL x x 100 % Berat sampel (g) % protein = % N x 6.38 e. Kadar Abu (Association of Official Analytical Chemist 1995) Pengukuran kadar abu menggunakan metode pengabuan dalam tanur. Sejumlah 5 gram sampel dimasukkan dalam cawan porselen yang telah dikeringkan dan telah diketahui beratnya. Terlebih dahulu sampel dipanaskan pada hot plate untuk menguapkan sebanyak mungkin zat organik yang ada (sampai sampel tidak berasap lagi). Cawan selanjutnya dipindahkan kedalam tanur dan dipanaskan pada suhu 300º C sampai semua karbon berwarna keabuan, kemudian suhu dinaikkan sampai 450º C selama 5 jam (sampel berwarna putih). Cawan dari tanur didinginkan dan ditimbang berat abu yang dihasilkan. Kadar abu (%) = bobot abu x 100% bobot sampel f. Kadar Air (SNI ) Cawan dikeringkan pada suhu 105º C selama 1 jam, diangkat dan didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang. Sampel yang akan ditentukan kadar airnya ditimbang sebanyak 5 gram dan dimasukkan kedalam cawan. Cawan yang berisi sampel dimasukkan ke dalam oven bersuhu 105º C sampai mencapai berat konstan (6 jam). Kadar air dihitung berdasarkan persamaan berikut: Kadar air (%) = bobot sampel awal-bobot sampel akhir x 100% Bobot sampel awal g. Rendemen Mentega (Association of Official Analytical Chemist 1995) Besar rendemen dihitung berdasarkan persentase berat produk yang dihasilkan terhadap berat awal bahan yang digunakan. Rendemen mentega (%) = Bobot mentega x 100% Bobot susu segar

9 21 IV. Pembuatan Mentega Proses pembuatan mentega diawali dengan pemisahan antara krim dan skim susu menggunakan cream separator (merek Elecream). Krim yang diperoleh selanjutnya digunakan sebagai bahan baku pembuatan mentega. Diagram alir pembuatan mentega disajikan pada Gambar 1. Pemisahan Krim Pasteurisasi 85 C-15detik Dinginkan hingga 7 C Churning 5-10ºC Kneading Mentega Gambar 1 Diagram alir proses pembuatan mentega (Hunziker 2008) Analisis Data Frekuensi Alel dan Genotipe Keragaman genotipe tiap-tiap individu dapat ditentukan dari pita-pita DNA gen yang ditemukan. Masing-masing sampel dibandingkan berdasarkan pola migrasi pita yang sama dan dihitung frekuensi alelnya. Frekuensi alel dihitung berdasarkan rumus Nei & Kumar (2000) sebagai berikut:

10 22 x i 2n Keterangan : x i = frekuensi alel, n ii = jumlah genotipe dari alel ke-i, dan n ij = jumlah alel ke-i terpaut alel ke-j (j i). Frekuensi genotipe dapat diperkirakan dengan menghitung perbandingan jumlah genotipe pada populasi. Menggunakan asumsi sebelumnya, maka frekuensi genotipe A i A i (Χ ii ) dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut : ii 2n ji n ij Keterangan: Χ ii = frekuensi genotipe n ii = individu yang bergenotipe A i A i n = jumlah total sampel Χ ii= n ii / n Kualitas Susu dan Mentega Analisis perbedaan kualitas susu dan mentega antar genotipe gen GH menggunakan metode analisis General Linear Model (GLM) dengan bantuan software SAS 9.1.