PENDAHULUANPEMBUATAN KIT RIA MIKROALBUMINURIA UNTUK PEMERIKSAAN ALBUMINURIA ABSTRAK

Transkripsi

1 Risalah PertemlJan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan Apll:tasi Isolop dan RadiaSl; 2(XJ 1 PENDAHULUANPEMBUATAN KIT RIA MIKROALBUMINURIA UNTUK PEMERIKSAAN ALBUMINURIA Sukiyati Dj., Siti Darwati, Gina M., Djoharly Ch., Triningsih, Sulairnan, Puji Widayati, Sri Setiyowati, Veronika, dan Yulianti S. Pusat Pengembangan Radioisotop dan Radiofannaka, BA TAN, SeIpOng ABSTRAK PEMBUA TAN KIT RIA MlKROALBUMINURIA UNTUK PEMERIKSAAN ALBUMINURIA. Telah dilakukan pembuatan kit RIA mikroalbuminuria yang terdiri dari tracer 12~-HSA, standar albwnin, dan antisera albumin dari BARC (hldia). Tujuan dari penelitian adalah mencari formulasi kit mikroalbuminuria untuk metode RIA yang dapat digunakan untuk diagnosis albumin dalam kadar rendah (lebih rendah dari kadar albuminuria yang biasanya ditentukan dengan dipstik). Hasil penandaan 125I-HSA memberikan rendemen rata-rata 96,2%, dengan tingkat kemurnian radiokimia lebih besar dari 90% serta aktivitas jenis : (2,54:t 0,28) Ci/g HSA. Kemurnian radiokimia tracer 12~-HSA yang dibuat cukup tinggi, yaitu 96,2% serta ikatan non spesifik cukup rendah «1 %). Diperoleh pula bahwa persen ikatan maksimal (%B) cukup tinggi, yaitu 80,3%. Dibandingkan dengan 125I-HSA CIAE (China Institute Atomic Energy) 125I-HSA yang dibuat mempunyai kualitas yang lebih baik. Standar HSA untuk kit RIA mikroalbuminuria ditentukan menggunakan standar BARC (Bhaba Atomic Research Centre, hldia), dan diperoleh nilai yang cukup baik (penyimpangall masing-masing standar < 100/0). Sensitivitas kit yang dibuat cukup tinggi, yaitu 1,4 jlg/ml serta memberikan %CY untuk interassay di bawah 10%. Dari profil ketelitian diperoleh daerah keija jlg/ml. ABSTRACT THE PREPARATION OF WCROALBUMIN RADIOIMMUNO-ASSA Y KIT FOR URINARY ALBUMIN DETECTION. Preparation of microalbuminwia RadioinunWtoassay (RIA) kit which is comprised of 1251 HSA tracer, albumin standard and antisem has been done. The ptupose of this research is to prepare a good quality and high sensitivity of microalbwninwia RIA kit, which can detect low level of albuminuria in ~g/rnl level which can not be detected using existing dipstick method. The average radioiodination yield ofhsa was 96.25%, with radiochemical pwity more than 90%, and the specific activity was (2.54% :t 0.28%) Ci/g HSA. The maximwn binding of the tracer was reasonably high (more than 70%) and low non specific binding (NSB) of less than I % is observed. The deviation of the standard prepared is less thai} 10% for all level standards. Assay for sensitivity for five replications of zero standard gave the sensitivity of less than 1.4 ~ml. The working range of assay obtained from precision profile is ~rnl PENDAHULUAN Mikroalbuminuria adalah keadaan fisiologis seseorang di mana kadar albumin yang diekskresi ke dalam urine masih berada di bawah ambang kadar albwninuria. Pada kondisi tersebut albumin yang diekskresi ke dalam urine berkisar antara ~g/menit atau mg/1lari. Konsentrasi di alas nilai tersebut disebut proteinuri dan dinyatakan Nephropathy (gagal ginjal)[2, 3, 4, 5). Penentuan kadar albwnin dalam jumlah mikro «200 ~g/menit) pada pasien diabetes sangat penting untuk deteksi dini mikroalbumin sebelum menjadi diabetes nephropathy (gagal ginjal), agar dapat dilakukan pencegahan sebelunmya [2, 3, 4). Saat ini penentuan kadar albumin daillin urine dilakukan dengan metode DIPSFICK atau metode pengendapan dengan asam [I). Penentuan kadar albumin dengan cara DIPSFICK tidak sensitif, sehingga tidak dapat mendeteksi kadar albumin dalam mikroalbuminuria. Teknik RIA merupakan cara teknik barn yang cukup sensitif dad spesiflk untuk penentuan kadarmikroalbuminuria [1, 2, 3, 4]. Prinsip penentuan kadar mikroalbuminuria menggunakan metode RIA dapat dijelaskan sebagai berikut : Albumin 1251 berkompetisi dengan albumin dari urine penderita terhadap antisera albumin (antibodi) dalam jumlah terbatas. Setelah diinkubasi dalam waktu tertentu, dilakukan pemisahan antara albumin terikat antisera dengan albumin bebas menggwiakan pereaksi pemisah polietilengiikol (peg). Besarnya keradioaktifan fraksi terikat di cacah dengan pencacah gamma (1)[1]. Pembuatan dan penggunaan kit mikroalbuminuria di Bhabha Atomic Research Centre (BARC), India, barn sampai pada tahap uji klinis mikroalbumin di laboratorium belum sampai dipasarkan, sedangkan di China Atomic Energy (ClAE), China, kit mikroalbuminuria telah luas digunakan dan dipasarkan. Tujuan dari penelitian ini adalah membuat kit RIA mikroalbuminuria untuk memenuhi kebutuhan domestik dalam penentuan albumin dalam kadar rendah di dalam urine. Dalam makalah ini, dilaporkan penelitian pendahuluan untuk produksi kit RIA mikroalbuminuria. 137

2 Risa/ah Peltemuan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan.'\Olikasi Isolop dan Radiasi, 2(X) 1 BAHAN DAN METODE Bahan. Bahan dan pereaksi yang digunakan untuk pembuatan urine sintetis antara lain Na2HPO4 bebas air, KH2PO4.7H2O, NaCI, ~CI dan Urea masing-masing diperoleh dari E-Merck dad PT. Harum Sari. Obat suntik gentamycin sulfat anti septik untuk pengawet (40 1lg/2 ml) diperoleh dari PT Praja Ph. HSA (Albumin serum manusia) yang digunakan sebagai standar albumin adalah buatan Sigma. Oksidator iodogen untuk iodinasi HSA buatan Pierce, sedangkan BSA (albumin serum sapi) dad tris bufer masingmasing diperoleh dari E-Merck. Kloroform untuk melarutkan iodogen, n-butilalkohol, etil alkohol dan ~OH untuk uji kemurnian radiokimia dari E.Merck. Antisera HSA buatan BARC (India). Polietilengiikol untuk pemisahan serum albumin terikat dan bebas dari Sigma. Peralatan. Mini assay y-counter tipe G-20 buatan USA digunakan untuk pengukunm keradioaktifan, kolom Sephadex G-25 PD-I0 (pharmacia), Sentrifuga Allegra 21 Beckman digunakan untuk pemisahan fraksi J 251 -HSA dan 1251 bebas. Pembuatan coated tube iodogen. Ke dalarn tabung reaksi dilariitkan 2 mg iodogen dalam 2 ml kloroform. Untuk setiap iodinasi diarnbil 10 Ililarutan dan dimasukkan ke dalarn tabung reaksi pendek (volume 2 In!) untuk pelladdaan. Larutan iodogen di dalam tabung dikeringkan pada subu 37 C selama 5-6 jam di dalam incubator. Coated tube iodogen ditutup parafilm dan siap digunakan untuk penandaan (di simpan pada 4 C). KH2PO4, 2,5 g NaCl dan 5 g ~Cl, kemudian ditamballkan 900 mi aquabides. Campuran larutan selanjutnya disterilisasi dalam autoclave pada suhu 120 c selama 30 medii. Setelah dingin lamtan basil sterilisasi dimasukkan ke dalam labu ukur 1 liter, kemudian ditambahkan 25 g urea dan dikocok, dan ditamballkan lagi aquabides sampai lamt, dan akhimya dimasukkan gentamycin 2 ml, kemudian di~bahkan aquabide sampai volume 1000 mi. Campuran dikocok perlahan-lahan dan siap digunakan. Lamtan disimpan pada SuI1U 0-4 C. Dua jenis lamtan urine sintetis yang dibuat masing-masing dengan menggunakan urea murni (100%) dad urea 40%. Pembuatan lamtan standar albumin. Konsentrasi lamtan standar yang dibuat adalah antara 0 ~g/mi -200 ~g/tn1 dail diberi label sebagai standar A = 0 ~g/tnl, B = 10 ~g/ml, C = 25 ~g/mi, D = 50 ~g/tnl, E = 100 ~g/mi dan F = 200 ~g/ml. Pembuatan standar diiakukan mulai dari standar tertinggi 200 ~g/mi sebagai standa:. F Standar yang lebih rendah A, B, C, D dan E dibuat dari standar F dengan pengenceran yang sesuai menggilllakan urine sintetis, di dalam labu takar 100 mi. Pembuatan pereaksi petnisah PEG 15 %. Ke dalam labu takar 100 mi dimasukkan 15 g PEG yang dilamtkc1ll dalam NaCl 1% dan volume dibuat sampai 100 mi. PEG 15% selalu dibuat barn (kurang dari 2 minggu) dandisimpan pada suhu 4 C. Penentuan standar P2RR dengan standar BARC. Untuk mengetahui ketepatan kadar standar P2RR yang dibuat, penentuan kadar standar diamati dengan menggunakan standar pembanding (Gold standar dari BARC, India). Sebagai penmut digunakan tracer dari CIAE (China) dan tracer dari P2RR. Penandaan HSA dengan 115L Ke dalam coated Pengujian kit RIA mikroalbuminuria I1sl. tube yang telah berisi 10 j.lg iodogen dimasukkan 50j.l1 Pengujian kit dilakukan dengan melakukan assay dan (100 j.lg) HSA dalam larutan dapar fosfat 0,2 M (I mg/0,5 ml), kemudian ditambahkan 2 j.li NaJ25I (:t 230 j.lci). Larutan diaduk dengan vorteks, dan reaksi dibiarkan berlangsung selmua 90 detik. Untuk menentukan kurva standar, profil ketelitian. kerja, nilai cuplikan kontrol dan %CV interassay. daernh menghentikan reaksi ditambahkan 250 ~ larutan ~ ~ v BASIL DAN PEMBAHASAN fosfat 0,2 M, kemudian carnpuran reaksi dimumikan menggunakan kolom Sephadex G-25 (PD-I0) dan dielusi dengan Iarutan dapar tris 0,1 N ph 7,4. Hasil Hasil penandaan 125I-HS. A yang dilakukan 3 kali memberikan efisiensi penandaa10 46,1%, 98,42% dan elusi ditampung dalarn tabung reaksi 4 mi, masingmasing 94%. Hasil penandaan pertaniia masih rendah karena sebanyak I ml untuk 12 tabung. Tiap-tiap pembuatan dan penyimpanan coated tube iodogen tabung reaksi kemudian dicacall dengan menggunakan gamma mini assay. Kemurnian radiokimia llasil penandaan di kurang baik, sehingga kemung! ~nan sifat oksidatornya kurang kuat pada waktu digun. akan dalam penandaan. Efisiensi penandaan yang kedua, memberikan basil yang analisis dengan kromatogafi menggunakan fasa diarn cukup baik (98,42%) dan, pada penandaan ketiga dengan kertas Whatman No.1 dan fasa gerak campuran n-butanol, etanol dan ~OH 0,1 M dengan perbandingan 3 : 2 : 1. Immunoreaktivitasnya ditentukan dengan protokol assay (TabeII.). Pembuatan urine sintetis. Urine sintetis digunakan untuk melarutkan HSA, dalam pembuatan standar HSA, pembuatan standar 0 dan untuk menentukan (%) NSB. Ke dalam botol 1 liter dimasukkan berturut-turut 64 g Na2HPO4 7 H2O, 15 g terjadi penurunan basil penandmill (94 %). Hal ini disebabkan kajrena menunumya daya oksidasi dari oksidator iodogen. Sebaiknya coated tube iodogen digunakan maksimaii 2 minggu setelah pembuatan, sebab sifat oksidasinya telah menunm bila digllilakan lcbih dari waktu tersebut. Hasil perbandingan kualitas tracer P2RR dengan CIAE tersebut menu."1jukkan bahwa tracer P2RR memberikan kemurnian radiokimia cukup baik dan imunoreaktivitas lebil' tinggi dari tracer CIAE karena 138

3 Risa/ah Peltemuan //miah Pene/ilian dan Pengembangan l1/1/ikasi /SOIOp dan Radiasi 2(x) 1 kemungkinan tracer CIAE seialu tiba di P2RR sudah hampir daluwarsa (expired), tetapi tracer CIAE mempunyai NSB yang relatif agak rendah dari tracer P2RR. Oleh karena tracer China mempunyai B/f rendah dan telah hampir expired, maka untuk selanjutnya hanya digunakan tracer P2RR (Tabel 2). Hasil uji banding standar P2RR dengan standar BARC menggunakan tracer dari P2RR (standar BARC sebagai gold standard) didapat NSB untuk standar India (0,8%) lebih kecil dari standar P2RR (0,9%), tetapi ikatan B/f untuk standar 0 standar P2RR lebih baik (80,3%) dibanding standar BARC (76,2%). Dari basil pengujian standar menggunakan standar BARC, India diperoleh penyimpangan yang cukup besar dari beberapa standar, terutama bila digunakan urea dengan kadar 100% sebagai pelarut (matriks). Penggunaan urea 40% memberikan penyimpangan lebih kecil dibandingkan urea 100% (Tabel 3) untuk itu urea 40% digunakan sebagai matriks. Dari kurva standar (Gambar 2) dapat dilihat bahwa pada daerah barns antara mikroalbuminuria dan nephropathy (~ 200 ~g/ml), kecondongan kwva cukup tajam yang menwljukkan ballwa kepekaan assay cukup baik di daerah tersebut. Dari profil ketelitian (Gambar 3) dapat dilihat bahwa daerah kerja yang memberikan %CV < 10% cukup lebar yaitu ~g/ml. Dari basil penentuan nilai 0 dengan 5 kali replikasi, diperoleh sensitivitas (nilai rata-rata 0 :f: 2 SD) yang cukup baik yaitu 1,4 ~g/ml. Diperoleh pula bahwa nilai semua cuplikan kontrol yang mewakili nilai rendah. medium dan tinggi berada pada daerah rentang nilai yang seharusnya (Gambar 4). Dari basil pengujian yang dilakukan, dapat dikatakan bahwa kit RIA mikroalbuminuria yang dibuat mempunyai kualitas cukup baik, nalnun untuk dapat diaplikasikan secara klinis, masih perlu dilakukan validasi untuk menentukan kehandalan dari kit RIA mikroalbuminuria tersebut. KESIMPULAN Hasil pembuatan kit mikroalbuminuria 125 I telah memberikan basil yang cukup baik. namun untuk dapat diaplikasikan secara klinis untuk penentuan mikroalbuminuria, masih perin dilakukan pengujian dan validasi terhadap kit RIA mikroalbuminuria yang dibuat.. DAFTAR PUSTAKA 1. M.G.R. RAJAN, Dr., "Radioimmunoassay kit For UrinaryAlburnin"'. For the detection and quantitative determination of rnicroaibuminuria for the used by the IAEA participants of RAS/6/208. Diabetic Nephropathy Thematic Progamme on Health Care. 2. G.C. VIBRETI et al. "Microalbuminuria ~S a predictor of clinical nephropathy in ill;oulindependent diabetes mellitus." Lancet: (1982) H.H. PARVING et aj. "Early detection of patient at risk of developing diabetic nephropathy longitudinal study of urinary albumin excretion, Acta Endocrinologica (1982) 100, MOGENSEN C. "Microalbumin a predictor of clinical diabetic nephropathy (review). Kidney Int. 3 1,(1987) MARK E. COOPER.," Pathogenesis, prevention, and treabnent of diabetic nephropathy"., The Lancet vol. 352, Juli 18, (1998). Tabell. Protokol RIA kit mikroalbuminuria 1251 I ::~I;i) ;~tandar 2: 25 2~ 252: 25,: 25,2~ 25 ~~ 25,2~ 25 ;~ ~k Sam 1 ( I) ! "SA 1251 (~) ~ I antisera (~) Vortex, inkubasi pada 37 C selama 1 jam atau 2 jam pada suhu kamar I PEG 15% (~) Sentrlfuge pada 3000 x g selama 25 menit Dekantasi supematan Cacah 139

4 Risalah Pertemuan Ilmiah Penelitian dan Pengembangan Aplikasi Isotop din Radias~ 2(x) t Tabel 2. Perbandingan kualitas tracer P2RR dengan tracer ClAE Keterangan NSB = % Ikatan tidak spesifik -- Btr = % Ikatan cacahan standar 0 dibagi cacahan total Tabel3. Perbandingan standar P2RR dengan pembanding standar BARC (India) menggunakan pelarot urine sintetis dengan: A. (Urea 40%) dan B. (Urea 100%) Keterangan : NSB = Non spesifik binding tracer untuk pengujian dari P2RR N (pengulangan) = 4 kali Catatan: Dari basil pengamatan pelarut urine sintetis yang 40% Tabel 4. Nilai cuplikan kontrol menggwtakan kit RIA mikroalbuminuria 140

5 141 Risalah Pertemuan Ilmiah Penelitian dan Pengembangan.I\Olikasi Isolop dan Radias~ 2(XJ ~ ! 20CKX u ~ ~1251-HSA o+-~ 11.: 3' 4.:~:.~ -;-:,:' ~.:.:. :.: I,,j~: 2 ;1:~":~'2 "'4 "I Jumlah Tabling Gambar 1. Hasil penandaan HSA dengan 1251 Keterangan : Iodinasi HSA menggunakan oksidator iodogen, kemumian radiokirnianya > 90% !:: aj * " 30 CV% I """" 10 -, ol Gambar 3. Profil Ketelitian (imprecision profile) Kit RIA Mikroalbuminuria Catatan : daernh kerja yang memberikan %CY < 10% cukup lebar yaitu (10 ->500 ~g/ml)

6 Risalah Pertemuan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan Aplikasi Isolop dan Radias~ 2{XJ I Gambar 4. 'Control chart" Interassay kit microalbuminuria 1251 DISKUSI s UHARNI S AD I 2. Kendatipun mungkin lebih mahal, namun keunggulan teknik RIA (Mikroalbuminuria) cukup 1. Dengan kit yang anda buat apakah telah dicoba pacta banyak : pemeriksaan di laboratorium? 3. Lebih peka (bisa mendeteksi konsentrnsi albumin < 2. Dibandingkan yang standar China dan India 20 mg/ml) pengerjaannyapun relatip lebih cepat. bagaimana hasilnya? MARIA LINA SUKIY AT! DJ 1. Dalam penyediaan kit RIA Mikroalbuminuria, digunakan urine sintetis sedangkan untuk aplikasinya dengan pure urine apakah basil yang 1. Belurn, akan dilakukan kalau kita sudah yakin betul dengan kualitasnya. 2. Bila standar China tersedia akan kita coba bandingkan dengan standar kita. YUMIAR TI didapatidak menunjukan perbedaan? 2. Apakah pemah dicoba dengan menggunakan pure urine bagaimana hasilnya dibandingkan dengan penggunaan urine sintesis? 1. Berapa perkiraan harga 1 set kit tersebut? 2. Bagaimana dibandingkan dengan harga metoda konvensional (untuk pemeriksaan lab)? SUKIY A TI DJ 1. Harga pasti belum diketahui, namun beberapa komponen kit harganya cukup mahal, terutalna dari Chin:t SUKIY A TI DJ 1. Komposisi urine sintetis sudah digunakan dengan urine asli, jadi hasilnya tidak menunjukan perbedaan. 2. Belum pemah, Insya Allah akan kami coba melakukannya. 142