AKTIVITAS PENGHAMBATAN TIROSINASE DARI EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN BINAHONG (Anredera cordifolia (Tenore) Steen)

Transkripsi

1 1 AKTIVITAS PENGHAMBATAN TIROSINASE DARI EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN BINAHONG (Anredera cordifolia (Tenore) Steen) SKRIPSI Untuk memenuhi sebagai persyaratan Mencapai Derajat Sarjana S-1 QORI WAHYUNINGSIH FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO 2013

2 2 AKTIVITAS PENGHAMBATAN TIROSINASE DARI EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN BINAHONG (Anredera cordifolia (Tenore) Steen) SKRIPSI Untuk memenuhi sebagai persyaratan Mencapai Derajat Sarjana S-1 QORI WAHYUNINGSIH FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO 2013 i

3 3 ii

4 4 iii

5 5 PERNYATAAN Yang bertanda tangan dibawah ini, saya: Nama : Qori Wahyuningsih Nim : Program studi : Farmasi Fakultas/Universitas : Farmasi / Universitas Muhammadiyah Purwokerto Menyatakan dengan sebenar- benarnya bahwa skripsi ini adalah hasil dari proses penelitian saya yang telah dilakukan sesuai dengan prosedur penelitian yang benar dengan arahan dari dosen pembimbing dan bukan hasil penjiplakan dari hasil karya orang lain atau terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan sepanjang pengetahuan penulis juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan orang lain kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka. Demikian pernyataan ini, dan apabila kelak dikemudian hari terbukti ada unsur penjiplakan, maka saya bersedia mempertanggung jawabkan sesuai dengan ketentuan yang berlaku. Purwokerto, Agustus 2013 Yang menyatakan, Qori Wahyuningsih iv

6 6 MOTTO Kegagalan hanya terjadi bila kita menyerah dan Jadikanlah kekecewaan masa lalu menjadi senjata sukses di masa depan v

7 7 PERSEMBAHAN Ucapan terima kasih dan sujud syukur atas kehadirat Allah SWT, atas segala rahmat, nikmat dan karunia dan hidayahnya dengan kerendahan hati dan ketulusan hati, saya persembahkan karya ini kepada: Abah dan Umi H. Irsyad Asro (Alm) dan Hj. Nurhidayah yang selalu mendoakanku, terima kasih atas dukungan, bekal dan kasih sayang yang tulus dan selalu memberiku semangat baik moral, spiritual dan materi. Serta untaian doa yang tidak pernah akan putus. Kakak- kakakku Terima kasih atas dukungan motivasi dan perhatiannya selama ini, semoga selanjutnya saya bisa menjadi adik yang lebih baik dan berguna bagi keluarga. Calon Pendamping Hidup Yang tercinta Riski Mukjizatulloh, S.H yang telah mengisi hidupku, memberiku perhatian, semangat dan materi serta setia menemaniku dalam suka maupun duka. Pembimbing Bu Binar Asrining Dhiani, M.Sc.,Apt dan Ibu Indri Hapsari, M.Si.,Apt selaku pembimbing saya selama proses skripsi ini. Terimakasih atas segala hal yang telah diberikan kepada saya. Teman Seperjuangan Terima kasih selalu menemani saya, teruntuk Siti Nuryanti (Bunda), terimakasih atas semangat dan perhatiannya.terimakasih buat kesabarannya membantu dalam menyelesaikan skripsi saya.dan terimakasih juga buat Amalia buat kerjasamanya dan doanya selama penelitian skripsi ini. Teman- Teman Farmasi Angkatan 2009 dan Assasains Terimakasih atas kebersamaannya, buat teman- teman sepertimas aan, unul, ana, erma, elent, agil, sandra, lita, wina, sukhaebah dan lusi mbot. Dan tidak lupa juga terimakasih buat Damar kartika ratri yang telah senantiasa mendengarkan keluh kesah saya selama 4 tahun ini. vi

8 8 Mantan Penghuni Kost Terimakasih buat mba pipin, lisna dan semua anak fiumy kost, serta terimakasih juga buat komplotan anak kos Nyeplik sepertiiqlimasahara, Yuli, Wulan, Wiwi, Titi dan semua teman kost yang tidak bisa saya sebutin satu persatu, terimakasih atas do anya selama ini. vii

9 9 INTISARI QORI WAHYUNINGSIH. Aktivitas Penghambatan Tirosinase Dari Ekstrak Etil Asetet Daun Binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steen). Dibawah bimbingan BINAR ASRINING DHIANI dan INDRI HAPSARI. Latar Belakang: Paparan sinar matahari (UV) dan paparan radikal bebas dapat menyebabkan kulit menjadi kering dan rusak, sehingga proses penuaan dini dapat berlangsung cepat. Sinar UV sangat berperan penting dalam pembentukan pigmen melanin dalam tubuh (Winarsih, 2007). Binahong (Anredera cordifolia) termasuk dalam famili Basellaceae merupakan tanaman yang dikenal mempunyai aktivitas antioksidan yang baik. Sediaan kosmetik pemutih mengharapkan efek antioksidan dan penghambatan melanin. Ekstrak etanol daun binahong tidak memberikan efek sebagai inhibitor tirosinase (Rahayu,2012). Tetapi belum ada laporan ilmiah mengenai aktivitas penghambatan tirosinase ekstrak etil asetat daun binahong. Tujuan Penelitian: Menentukan apakah ekstrak etil asetat daun binahong mempunyai aktivitas penghambatan tirosinase dan seberapa besar aktivitas penghambatan terhadap tirosinase. Metode Penelitian: Jenis penelitian ini adalah jenis penelitian eksperimental dengan rancangan randomized block design dengan menguji beberapa seri konsentrasi ekstrak etil asetat daun binahong(50, 100, 200, 400 dan 800 µg/ml). Variasi seri konsentrasi tersebut diuji aktivitas penghambatan tirosinase dengan kontrol positif hidroquinon. Aktivitas penghambatan tirosinase diukur dengan mengamati perubahan atau pembentukan dopakrom pada panjang gelombang 490 nm menggunakan microplate reader 96 sumuran. Hasil: Nilai IC 50 ekstrak etil asetat daun binahong sebesar 299,1 µg/ml sedangkan nilai IC 50 dari kontrol positif (hidrokuinon) yaitu 16,34 µg/ml. Kesimpulan: Ekstrak etil asetat daun binahong mempunyai aktivitas terhadap penghambatan tirosinase rendah daripada hidrokuinon. Kata Kunci: Daun binahong, Aktivitas penghambatan tirosinase. viii

10 10 ABSTRACT QORI WAHYUNINGSIH.Tyrosinase Inhibition Activity of Ethyl Acetate Extract from Binahong Leaves (Anredera cordifolia (Tenor) Steen). Under Supervision of BINAR ASRINING DHIANI and INDRI HAPSARI. Backgroun: The exposure of sun ray (UV) and free radicals can cause skin damage and dried skin, therefore the aging process is occured. UV rays take a role on melanine pigment production (Winarsih, 2007). Binahong (Anredera cordifolia) which belongs to Basellaceae family is one of plants which has antioxidant activity. Whitening product expect dual effect the antioxidant effect and inhibition of melanin production. Ethanol extract of binahong leaves was not exhibitedtyrosinase inhibition (Rahayu, 2012). There is no scientific reports of tyrosinase inhibition activity of ethyl acetate extract of binahong leaves. Research Objectives:To determine tyrosinase inhibition activity of ethyl acetate extract of binahong leaves and determine level of inhibition activity of tyrosinase. Research method: The type of this research was an experimental research with randomized block design by testing a serial concentration of ethyl acetate extract of binahong (50, 100, 200, 400 and 800 µg/ml). This variation of concentration series was assayed its inhibition activity of tyrosinase with hydroquinone as the positive control. Inhibition activity of tyrosinase was measured by observing the change color caused by the formation of dopachrome at wavelength 490 nm using 96 wells microplate reader. Result: IC 50 value of ethyl acetate extract of binahong leaves was 299,1 µg/ml whereas IC 50 value of positive control (hydroquinone) was 16,34 µg/ml. Conclusion:Ethyl acetate extract of binahong leaves possessed tyrosinase inhibition activity although lower than hydroquinone. Keywords: Binahong leaves, tyrosinase inhibition activity. ix

11 11 KATA PENGANTAR Segala Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, atas nikmat, hidayah, karunia, dan segala petunjuknya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul AKTIVITAS PENGHAMBATAN TIROSINASE DARI EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN BINAHONG (Anredera cordifolia (Tenore) Steen).Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Purwokerto. Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar- besarnya kepada Ibu Binar Asrining Dhiani, M.Sc.,Apt selaku pembimbing I dan Ibu Indri Hapsari, M.Si.,Apt selaku pembimbing II yang telah berkenan memberikan saran, nasehat, dan koreksinya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas skripsi ini. Penyelesaian penulisan skripsi ini tidak lepas dari bantuan, bimbingan dan dukungan semua pihak, untuk itu penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Dr. Nunuk Aries Nurulita. M.Si.,Apt, selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto. 2. Retno Wahyuningrum, M.Si., Apt dan Wiranti Sri Rahayu, M.Si.,Apt selaku penguji yang telah memberikan koreksi terhadap skripsi ini. 3. Abah, Umi dan Kakak- kakakku tercinta yang telah memberikan doa dan semangat serta dorongan baik spiritual maupun materiil. 4. Seluruh dosen dan staf karyawan Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto. 5. Semua teman- teman Farmasi Angkatan 2009 terutama anak- anak Assasains terima kasih atas dukungan dan kerjasamanya selama penyusunan skripsi ini. 6. Semua pihak yang telah membantu selama penulis melaksanakan penelitian dan penulisan skripsi ini hingga selesai yang tidak dapat disebutkan satu persatu. x

12 12 Akhir kata penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih jauh dari sempurna, yang disebabkan oleh keterbatasan penulis.semoga skripsi ini bermanfaat bagi pembaca dan penulis pada khususnya. Purwokerto, 28 Agustus 2013 Qori Wahyuningsih xi

13 13 DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL... i HALAMAN PERSETUJUAN... ii HALAMAN PENGESAHAN... iii PERNYATAAN... iv MOTTO... v PERSEMBAHAN... vi INTISARI... viii ABSTRACT... ix KATA PENGANTAR... x DAFTAR ISI... xii DAFTAR TABEL... xv DAFTAR GAMBAR... xvi DAFTAR LAMPIRAN... xvii BAB I PENDAHULUAN... 1 A. Latar Belakang... 1 B. Perumusan Masalah... 2 C. Tujuan Penelitian... 2 D. Manfaat Penelitian... 3 BAB II TINJAUAN PUSTAKA... 4 A. Binahong Sistematika Tanaman Nama Daerah Morfologi Daun Rhizoma Bunga Akar Khasiat... 5 xii

14 14 5. Kandungan Kimia Flavonoid Polifenol Saponin Alkaloid... 7 B. Melanin dan Enzim Tirosinase... 7 C. Hydroquinon... 9 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian B. Variabel Penelitian C. Definisi Variabel Operasional D. Waktu dan Tempat Penelitian E. Bahan dan Alat F. Cara Penelitian Pengumpulan bahan Determinasi bahan Pengeringan bahan Pembuatan ekstrak daun binahong Identifikasi kandungan senyawa G. Uji Penghambatan Tirosinase Pembuatan buffer fosfat Pembuatan larutan sampel a. Pembuatan larutan stok sampel b. Pembuatan seri konsentrasi sampel Pembuatan larutan kontrol positif hidroquinon a. Pembuatan larutan stok Hidroquinon b. Pembuatan seri konsentrasi hidroquinon Pembuatan larutan tirosinase Pembuatan larutan L-DOPA Pengujian aktivitas inhibisi tirosinase dan penentuan IC H. Analisis Data xiii

15 15 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Determinasi tanaman B. Penyiapan simplisia C. Pembuatan ekstrak etil asetat daun Binahong D. Uji Aktivitas Inhibisi Tirosinase dan Penentuan IC E. Identifikasi Kandungan Senyawa BAB V KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN xiv

16 16 DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Persentase inhibisi aktivitas penghambatan tirosinase ekstrak etil asetat daun binahong Tabel 2. Identifikasi kandungan senyawa ekstrak etil asetat daun binahong Tabel 3. Absorbansi Hidroquinon(kontrol positif) Tabel 4. Absorbansi kontrol negatif Tabel 5. Absorbansi ekstrak etil asetat daun binahong xv

17 17 DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Daun Binahong (Anredera cordifolia)... 5 Gambar 2. Skema reaksi terbentuknya melanin... 9 Gambar 3. Kurva hubungan non linier dari log konsentrasi ekstrak etil asetat daun binahong terhadap persen inhibisi Gambar 4.Kurva hubungan non linier dari log konsentrasi kontrol positif (hidroquinon) terhadap persen inhibisi xvi

18 18 DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1.Surat keterangan determinasi daun binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steen) Lampiran 2. Hasil persentase inhibisi ekstrak etil asetat daun binahong Lampiran 3. Hasil persentase inhibisi hidroquinon Lampiran 4.Hasil aktivitas penghambatan tirosinase Lampiran 5.Perhitungan pembuatan buffer fosfat ph 6, Lampiran 6. Perhitungan pembuatan larutan L-DOPA Lampiran 7. Perhitungan persentase inhibisi Lampiran 8. Gambar pelaksanaan penelitian Lampiran 9. Gambar uji aktivitas penghambatan tirosinase Lampiran 10.Gambar identifikasi kandungan senyawa Lampiran 11.Gambar hasil pengamatan kromatografi lapis tipis ekstrak etilasetat daun binahong Lampiran 12. Gambar alat dan bahan xvii

19 1 BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Permasalahan Paparan sinar matahari (UV) dan paparan radikal bebas dapat menimbulkan kulit menjadi kering dan rusak, sehingga proses penuaan dini dapat berlangsung cepat.sinar UV sangat berperan penting dalam pembentukan pigmen melanin dalam tubuh (Winarsi, 2007). Pigmen melanin merupakan suatu pigmen yang dapat melindungi kulit dari paparan sinar matahari.proses pembentukan melanin ini terjadi dengan bantuan enzim dan sinar UV yang terdapat dalam sinar matahari. Dengan bantuan enzim tirosinase produksi melanin menjadi berlebih dan mengakibatkan hiperpigmentasi kulit.hiperpigmentasi menyebabkan bercak warna coklat pada kulit.untuk mencegah produksi melanin yang berlebih dapat digunakan inhibitor tirosinase. Inhibitor tirosinase pada saat ini banyak digunakan dalam produk kosmetik dan farmasi sebagai penghambat produksi melanin menjadi berlebih pada lapisan epidermis dan membuat kulit tampak lebih putih (Arung et al, 2006).Mekanisme kerja enzim tirosinase dengan menghambat aktivitas enzim yaitu dengan mereduksi bahan yang dapat menyebabkan oksidasi dopakuinon. Kombinasi antioksidan dan inhibitor tirosinase dapat ditemukan dari bahan alam ataupun senyawa sintetik.penemuan dari suatu senyawa antioksidan dan inhibitor tirosinase telah ditemukan pada bahan kosmetik untuk mencegah terbentuknya melanin yaitu hidroquinon, merkuri, asam kojat, arbutin, dan asam askorbat (Kim et al, 2005). Hidroquinon digunakan dalam tambahan bahan kosmetik untuk memperoleh efek pemutih dengan menghilangkan flek gelap pada kulit.akan tetapi, penggunaan dalam jangka waktu panjang dapat menyebabkan kelainan pada ginjal (nephropathy) profirasi sel, dan bersifat karsinogenik dan teratogenik (Wester et al., 1999).

20 2 Untuk mencegah penuaan dini tubuh kita perlu adanya antioksidan.salah satu sumber tanaman obat yang memiliki potensi sebagai antioksidan adalah tanaman binahong (Anredera cordifolia).binahong (Anredera cordifolia) termasuk dalam famili Basellaceae merupakan tanaman yang dikenal mempunyai aktivitas antioksidan yang baik.daun binahong diduga mengandung asam oleanolat (Hammond et al., 2006).Asam oleanolat merupakan golongan triterpenoid yang memiliki antioksidan yang terdapat pada tanaman (Liu, 1995). Penelitian lebih lanjut tentang tanaman obat binahong pernah dilakukan oleh Rahayu (2012) bahwa ekstrak dari etanol daun binahong tidak memberikan efek sebagai inhibitor tirosinase.maka dari itu peneliti tertarik untuk menguji aktivitas penghambatan tirosinase dari ekstrak etil asetat daun binahong (Anredera cordifolia). B. Perumusan masalah 1. Apakah ekstrak etil asetat daun binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steen) mempunyai aktivitas penghambatan terhadap tirosinase? 2. Berapa besar aktivitas penghambatan terhadap tirosinasedari ekstrak etil asetat daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steen)? C. Tujuan Penelitian Penelitian ini dilakukan dengan tujuan: 1. Untuk menentukan apakah ekstrak etil asetat daun binahong mempunyai aktivitas terhadap tirosinase. 2. Untuk menentukanic 50 aktivitas penghambatan tirosinase dari ekstrak etil asetat daun binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steen).

21 3 D. Manfaat Penelitian Dari penelitian ini akan diperoleh bahan pemutih alami yang dapat mencegah hiperpigmentasi dari bahan alam yang mempunyai aktivitas terhadap penghambatan tirosinase yang relatif lebih aman digunakan oleh masyarakat.

22 4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steen) Menurut Depkes (2006), klasifikasi tumbuhan Binahong adalah sebagai berikut: 1. Sistematika Tanaman : Divisio : Spermatophyta Sub Divisio : Angiospermae Kelas : Dicotyledoneae Bangsa : Caryophyllales Suku : Basellaceae Marga : Anredera Jenis : Anredera cordifolia (Tenore) Steen. Sinonim : Boussingaultia baselloides Auct. Non H.B.K, Boussingaultia gracillis Miers, Boussingaultia Cordifolia Ten. 2. Nama daerah Indonesia : Binahong Cina : Teng san chi Inggris : Heartleaf Madeira vine, Madeira vine (Mus,2008). 3. Morfologi a. Daun Tanaman binahong berdaun tunggal, sangat pendek tangkainya (subsessile), pertulangan menyirip, tersusun berseling, daun berwarna hijau muda, berbentuk seperti jantung (cordata), memiliki panjang sekitar 5-10 cm dan lebar sekitar 3-7 cm, helaian daun tipis lemas, ujung runcing, pangkal berlekuk (emerginatus), tepi rata atau bergelombang, dan permukaan halus, licin, dan bisa dimakan (Susetya, 2011).

23 5 b. Rhizoma Tanaman binahong memiliki rhizoma. Rhizoma adalah umbi yang terdapat di dalam tanah, bercabang dan tumbuh menjalar, dari ujungnya dapat tumbuh tunas yang muncul di permukaan tanah dan dapat merupakan suatu tumbuhan baru. Biasanya rhizoma merupakan tempat penyimpanan cadangan makanan (Setiaji, 2009). c. Bunga Tanaman binahong memiliki bunga majemuk berbentuk majemuk rimpang, bertangkai panjang, muncul di ketiak daun, mahkota berwarna putih sampai krem berjumlah lima helai tidak berlekatan, panjang helai mahkota sekitar 0,5-1 cm dan memiliki bau yang harum (Susetya, 2012). d. Akar Tanaman binahong mempunyai akar tunggang yang berdaging lunak dan berwarna coklat kotor (Susetya, 2012). Gambar1. Daun Binahong (Anredera cordifolia) 4. Khasiat Daun Anredera cordifolia (Tenore) Steen yang dikenal dengan sebutan binahong ini berkhasiat sebagai obat diabetes dan sebagai analgesik (mengurangi rasa nyeri), serta bisa untuk penghalus kulit. Untuk mengobati diabetes yaitu sebanyak ± 50 gram daun binahong direbus

24 6 dengan 2 gelas air sampai mendidih, lalu setelah mendidih kemudian didinginkan terlebih dahulu dan selanjutnya disaring. Hasil saringan tersebut setelah dingin diminum sekaligus.untuk penghalus kulit,menggunakan daun binahong yang dicuci bersih lalu ditumbuk sampai lumat tidak berbentuk.hasil tersebut dalam pemakain 2x dalam satu minggu yang digunakan sebagai masker penghalus kulit (Depkes, 2006). 5. Kandungan Kimia Dari hasil penelitian pendahuluan Universitas Gadjah Mada, dinyatakan bahwa pada kulturin vitro daun binahong mengandung flavonoid, saponin, alkaloid, dan terpenoid (Manoi,2009). a. Flavonoid Flavonoid terdapat dalam tumbuhan sebagai campuran jarang sekali digunakan hanya flavonoid dalam jaringan tumbuhan.dalam tumbuhan,aglikon flavonoid (yaitu flavonoid tanpa gula terikat) terdapat dalam berbagai struktur.aglikon flavonoid adalah polifenol yang mempunyai sifat kimia seperti senyawa fenol yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Flavonoid merupakan senyawa yang larut dalam air, sebagian dapat diekstraksi dengan etanol 70% dan tetap ada dalam lapisan air setelah lapisan ekstrak ini dikocok dengan eter minyak bumi. Flavonoid berupa senyawa fenol, sehingga warna berubah apabila ditambah basa atau ammonia (Harborne,1987). b. Polifenol Kelarutan polifenol mudah larut dalam air karena bersifat polar dan umumnya berikatan dengan gula sebagai glikosida dan biasanya terdapat dalam vakuola sel. Untuk mendeteksi senyawa fenol sederhana ialah dengan menambahkan larutan besi (III) klorida dan uji daya reduksi dalam air atau etanol dengan penambahan pereaksi Fehling A dan Fehling B pada ekstrak sehingga menimbulkan warna merah bata atau merah yang kuat. Ekstraksi senyawa fenol dengan

25 7 etanol mendidih biasanya mencegah terjadinya oksidasi enzim (Harborne,1987). c. Saponin Saponin tidak dapat larut dalam pelarut non polar, paling cocok diekstraksi dengan etanol atau methanol panas 70-96% dan kemudian lipid dan pigmen disingkirkan dari ekstrak dengan memakai benzene. Untuk mengetahui adanya saponin dapat dilakukan uji sederhana yaitu dengan mengocok ekstrak dari tumbuhan dalam tabung reaksi dengan air panas selama 30 menit, apabila terbentuk busa yang tahan lama pada permukaan cairan paling tidak tetap stabil selama 30 menit, maka adanya saponin dapat dipastikan ada (Harborne,1987). d. Alkaloid Alkaloid mencakup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom N, biasanya dalam gabungan sebagai bagian dari sistem siklik. Alkaloid biasanya tanpa warna, kebanyakan berbentuk kristal, hanya sedikit yang berupa cairan. Senyawa alkaloid dapat dideteksi dengan pereaksi Dragendorf (Harborne,1987). B. Melanin dan Enzim tirosinase Melanin yang disebut dengan melanosom merupakan pigmen atau zat warna alami pada organel khusus termasuk makhluk hidup.melanin mempunyai dua bentuk yaitu 1. Eumelanin memiliki sifat tidak larut dalam air dan berwarna cokelat gelaphitam di dalam retina mata. 2. Feomelanin memiliki sifat larut dalam basa dan memberikan warna kuning-merah pada rambut. Kedua bentuk tersebut disintesis dari oksidasi tirosin oleh enzim tirosinase.enzim tirosinase yang dikenal dengan polifenol oksidase merupakan enzim kunci yang mempunyai peran dalam biosintesis melanin di dalam sel tumbuhan, mikroorganisme dan juga mamalia. Biosintesis melanin oleh enzim tirosinase dilakukan dengan mengatalisis orto-hidroksilasi tirosin menjadi 3,4-

26 8 dihidroksilfenilalanin atau DOPA (monofenolase) dan oksidasi DOPA menjadi dopakuinon (difenolase). o-kuinon yang dihasilkan ini dapat bertransformasi menjadi pigmen, baik dengan reaksi enzimatis maupun reaksi non-enzimatis (Likhitwitayawuid, 2008). Enzim tirosinase pada mamalia berperan dalam reaksi pigmentasi kulit atau perubahan warna kulit menjadi coklat, mata, dan rambut.enzim tirosinase ini juga dapat menyebabkan reaksi pencoklatan pada produk pangan seperti pada buah-buahan dan sayuran yang mengakibatkan menurunnya harga jual dan nutrisi yang terkandung dalam bahan pangan tersebut (Likhititwiyawuid, 2008).Reaksi pencoklatan pada produk pangan dipengaruhi oleh konsentrasi enzim tirosinase dan substrat, ketersediaan oksigen, ph dan suhu (Chang et al. 2007). Senyawa yang dapat menghambat proses pembentukan melanin disebut inhibitor tirosinase. Inhibitor tirosinase juga dapat membantu proses penyembuhan penyakit hiperpigmentasi dan melanogenesis pada kulit (Batubara et al. 2010). Inhibitor tirosinase pada saat ini banyak digunakan dalam produk kosmetik dan farmasi sebagai penghambat produksi melanin berlebih pada lapisan epidermis dan membuat kulit tampak lebih putih (Arung et al. 2006). Mekanisme kerja enzim tirosinase untuk menghambat aktivitas enzim tirosinase adalah mereduksi bahan yang dapat menyebabkan oksidasi dopakuinon.inhibitor tirosinase dapat bekerja secara kompetitif dan nonkompetitif dengan substrat tirosinase yaitu L-tirosin dan L-DOPA. Inhibitor tirosinase yang spesifik akan berikatan kovalen dengan enzim tirosinase sehingga enzim menjadi tidak aktif selama reaksi katalitik berlangsung (Chang, 2009).

27 9 Gambar 2.Skema reaksi terbentuknya melanin(balsam dan Sagarin, 1972). C. Hydroquinon C 6 H 6 O 2 BM= 110,11 1,4- Benzenediol: p-dihydroxybenzene: Hydroquinol: Quinol: Eldoquin and Eldopaque (Elder) (Seymour, 1975) Hidrokuinon merupakan zat aktif bahan kimia yang biasanya digunakan sebagai tambahan bahan kosmetik sebagai pemutih karena mampu secara efektif menghilangkan flek gelap pada kulit (Ningsih, 2009). Mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 100,5% C 6 H 6 O 2, dihitung terhadap zat anhidrat.pemeriannya berupa berbentuk jarum halus, putih dan mudah menjadi gelap apabila terkena cahaya dan udara.kelarutannya mudah larut dalam air, dalam etanol dan dalam eter (Depkes RI, 1995).

28 10 Hidroquinon merupakan golongan zat obat keras yang hanya dapat digunakan berdasarkan dari resep dokter (Badan Pengawas Obat dan Makanan).Kegunaan hidroquinon sebagai agen pencerah kulitdigunakan untuk mengurangi hiperpigmentasi kulit seperti noda, melasma, chloasma, bintikbintik dan lentigo (Seymour, 1975). Hidroquinon bekerja dengan mempengaruhi enzim tirosinase sehingga dapat menghambat oksidasi enzimatik tirosin menjadi DOPA, serta oksidasi DOPA menjadi melanin juga terhambat (Katzung, 1995).Sel pembentuk pigmentasi terletak pada lapisan basal epidermis.jumlah dan besarnya melanin yang terbentuk dapat menentukan warna kulit (Wasitaatmadja, 1997).

29 11 BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini menggunakan jenis penelitian eksperimental dengan rancangan randomized block design. B. Variabel Penelitian Dalam penelitian ini, variabel yang digunakan antara lain : 1. Variabel bebas : Konsentrasi ekstrak etil asetat daun binahong (Anrederacordifolia). 2. Variabel tergantung : Persentase penghambatan tirosinase oleh ekstrak etil asetatdaun binahong (Anredera cordifolia) 3. Variabel terkendali :Suhu penyimpanan, pelarut dan waktu, PH, panjang gelombang pada microplate reader. C. Definisi Variabel Operasional Ekstrak etil asetat daun Binahong adalah ekstrak daun Binahong (Anredera cordifolia) yang diperoleh dengan cara merendam serbuk simplisia dengan pelarut etil asetat selama dua hari disertai pengadukan, kemudian filtrat yang dihasilkan dari proses maserasi tersebut diuapkan hingga diperoleh ekstrak kental daun binahong. Konsentrasi yang digunakan pada penghambatan tirosinase pada ekstrak etil asetat daun binahong menggunakan konsentrasi yang berbeda- beda yaitu 50, 100, 200, 400, dan 800 µg/ml. Persentase penghambatan tirosinase dinyatakan dengan nilaiic 50 yaitu konsentrasi larutan inhibitor yang dibutuhkan untuk menghambat 50% aktivitas tirosin-tirosinase. Aktivitas tirosinasemerupakan aktivitas penghambatan yang ditentukan dengan tirosinase. Inhibitor tirosinase mereduksi bahan yang dapat menyebabkan oksidasi dopakuinon.semakin kecil nilai IC 50 maka aktivitas penghambatan terhadap melanin tinggi.

30 12 Suhu penyimpanan (temperatur) pada penelitian ini adalah 25ºC. Pengaturan temperatur ini dilakukan untuk menguji aktivitas terhadap enzim tirosinase, karena kerja dari enzim sangat spesifik sehingga mampu untuk menghambat. Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah DMSO, karena DMSO merupakan pelarut yang kepolarannya sangat tinggi ketika di larutkan dengan ekstrak.waktu yang diperlukan untuk sampel agar mampu bereaksi dengan enzim adalah 10 menit. Sedangkan waktu yang diperlukan untuk mereaksikan substrat dengan enzim yaitu 20 menit. Hal ini dilakukan karena kerja enzim sangat spesifik, sehingga perubahan sedikit saja pada kondisi kerjanya, dapat mempengaruhi aktivitas enzim. Panjang gelombang yang digunakan pada aktivitas penghambatan tirosinase ini menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 490 nm. D. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan selama7 bulan dari bulan Februari hingga bulan Juli Tempat penelitian di Laboratorium Botani dan Genetika FKIP UMP, Laboratorium Biologi Farmasi UMP, dan Laboratorium Farmakologi Toksikologi UMP. E. Bahan dan Alat Bahan yang dipakaipada penelitian ini adalah daun binahong (Anredera cordifolia),etil asetat teknis (Bratachem),.2 O (Merck),.2 O (Merck), hidroquinon (p.a), L-DOPA(Sigma),DMSO (Merck), enzim tirosinase (Sigma), aquabidest (widatra), methanol (Merck), asam stearat (Merck), asam asetat (Merck), asam format (Merck), toluen (Merck), aseton (Merck ) dan dietil amina (Merck). Alat yang dipakai dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas seperti beaker glass, erlenmeyer, gelas ukur, labu ukur, pipet volume, pipet tetes (pyrex), timbangan analitik (SHIMADZU AUW220D), ph meter (Metrohm),

31 13 stopwatch, mikropipet (Eppendorf research plus) dan microplate reader (Biorad imark TM ). F. Cara Penelitian 1. Pengumpulan bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun binahong (Anredera cordifolia) yang didapatkan di Desa Dukuhwaluh Kecamatan Kembaran Kabupaten Banyumas Provinsi Jawa Tengah. 2. Determinasi bahan Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Botani dan Genetika FKIP UMP.Determinasi dimaksudkan untuk menetapkan kebenaran sampel yang digunakan dalam penelitian. Determinasi daun binahong dilakukan dengan mencocokkan ciri dari morfologi yang ada pada tanaman daun binahong terhadap kepustakaan Flora of Java (Backer & Bakhuizen van den Brink volume 1). 3. Pengeringan bahan dan penyerbukan Daun binahong yang telah dipanen kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran yang menempel pada permukaan daun binahong.setelah itu ditiriskan sampai semua sisa- sisa air pencucian tidak ada lagi pada daun binahong. Daun binahong kemudian dikeringkan pada lemari pengering yang terdapat pada Laboratorium Teknologi Farmasi pada suhu 30ºC, karena ruang- ruang dalam lemari pengering tersebut dalam kondisi hampa udara sehingga penyisiran air terjadi secara cepat dan aman dari material pada suhu rendah.bahan yang sudah kering selanjutnya dapat diserbuk dengan mesin penyerbuk kemudian di ayak dengan nomor ayakan 20/ Pembuatan ekstrak etil asetat daun binahong Metode untuk pembuatan ekstrak daun binahong menggunakan metode perendaman (maserasi) yaitu dengan cara sebanyak 350 mg serbuk daun binahong dengan menggunakan cairan penyari etil asetatselama 2 hari atau 48 jam yang disertai pengadukan. Caranya untuk hari petama,

32 14 rendam 350 mg serbuk daun binahong dengan 3,5 liter pelarut etil asetat disertai pengadukan. Selanjutnya untuk hari kedua saring dengan kain penyaring dan ampas tersebut diekstraksi kembali dalam etil asetat 3,5 liter. Dalam kegiatan maserasi ini, banyaknya cairan penyari yang digunakan perbandingan 1:10 (BPOM, 2004).Kemudianmaseratdikumpulkan dan diuapkan penyariannya hingga diperoleh ekstrak kental daun binahong(depkes RI, 1986). 5. Identifikasi kandungan senyawa ekstrak etil asetat daun binahong a. Identifikasi Flavonoid Fase diam : silica gel F 254 Fase gerak : etil asetat : asam format : asam asetat glacial : air (100:11:11:27) Deteksi : difenilboriloksietilamina LP Bercak sinar uv : berpendar kuning intensif, hijau dan jingga(depkes RI, 1987) Hasil positif, tampak bercak berpendar kuning dalam sinar tampak. b. Identifikasi Saponin Pembentukan busa yang mantap sewaktu mengektraksi tumbuhan dan waktu memekatkan ekstrak tumbuhan, merupakan bukti adanya saponin tetapi biasanya lebih baik lagi bila uji sederhana itu dipastikan dengan cara KLT dan pengukuran spectrum (Harbone, 1987). Uji dengan KLT yaitu Fase diam : silica gel F 254 Fase gerak : etil asetat : metanol : air (100:13,5:10) Deteksi : anisaldehid-asam sulfat LP. Hasil positif, jika dengan pereaksi ini saponin membentuk bercak biru atau kadang-kadang kekuningan apabila diamati pada sinar tampak (Depkes RI, 1987). c. Identifikasi Tanin Fase diam : silika gel F 254 Fase gerak : toluen P : aseton P : asam format (5:4:1)

33 15 Deteksi : FeCl 3 Pembanding : asam galat Jika setelah disemprot dengan FeCl 3 menghasilkan warna hitam kehijauan berarti positif mengandung Tanin (Pratiwi, 2008). Larutan akan berubah menjadi biru kehitaman atau hijau kehitaman. Warna biru menunjukkan bahwa simplisia mengandung tannin galat.warna hijau kehitaman menunjukkan adanya tannin katekol (Depkes RI, 1987). d. Identifikasi Alkaloid Fase diam : silica gel F 254 Fase gerak : toluena : etil asetat : dietil amina (70:20:10) Deteksi : Dragendrof LP Bercak sinar biasa : jingga sampai merah tua Jika setelah disemprot dengan dragendrof, setelah dilihat sinar tampak alkaloid membentuk warna hijau kekuningan berarti negatif mengandung alkaloid. G. Uji Penghambatan Tirosinase 1. Pembuatan Buffer Fosfat Cara membuat buffer fosfat yaitu dengan melarutkan 17,79 g.2 O ke dalam 100 ml aquades, kemudian sebanyak 13,79 g.2 O juga dilarutkan ke dalam 100 ml aquades. Setelah itu mengambil larutan sebanyak 46,3 mldari dan 53,7 ml dicampurkan dan ukur dengan ph meter, sehingga diperoleh larutan buffer fosfat dengan ph 6,8 (Sambrook and David, 2001). 2. Pembuatan Larutan Sampel (ekstrak etil asetat daun binahong) a. Pembuatan Larutan Stok Sampel Konsentrasi 1000 ppm Larutan stok dibuat dengan cara menimbang seksama 0,01 grekstrak etil asetat daun binahongyang dilarutkan dalam 10 ml DMSO.

34 16 b. Pembuatan Seri Konsentrasi Sampel Dari larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm dipipet sebanyak 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 ml dimasukkan dalam labu ukur 5 ml dan ditambahkan dengan DMSO sampai dengan tanda sehingga diperoleh konsentrasi 50, 100, 200, 400, 800 ppm. 3. Pembuatan Larutan Kontrol Positif Hidroquinon a. Pembuatan Larutan Stok Hidroquinon Konsentrasi 1000 ppm Larutan stok dibuat dengan cara menimbang seksama 10 mg hidroquinon dilarutkan dalam 10 ml DMSO. b. Pembuatan Seri Konsentrasi Hidroquinon Dari larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm dipipet sebanyak 0,25 ml yang dilarutkan dalam 5 ml DMSO (50 ppm). Dari konsentrasi 50 ppm di pipet sebanyak 0,137; 0,275; 0,55; 1,1; 2,2 ml dimasukkan dalam labu ukur 5 ml dan ditambahkan dengan DMSO sampai dengan tanda sehingga diperoleh konsentrasi 1,375; 2,75; 5,5; 11; 22 ppm. 4. Pembuatan Larutan Tirosinase Larutan tirosinase dibuat dengan cara melarutkan serbuk tirosinase sebanyak 0,250mg ke dalam larutan buffer fosfat 0,02 M ph 6,8 dalam 2 ml. Larutan ini dibuat dalam keadaan segar. 5. Pembuatan larutan L-DOPA Larutan baku L-DOPA 0,85 mm dibuat dengan melarutkan 24,65 mg L-DOPA ke dalam 25 ml larutan buffer fosfat ph 6,8. Kemudian dipipet sebanyak 1,7 ml dimasukkan kedalam labu takar 10 ml dan ditambahkan larutan buffer fosfat 0,02 M ph 6,8 hingga tanda. Sehingga diperoleh konsentrasinya 2,5 mm. 6. Pengujian Aktivitas Inhibisi Tirosinase dan Penentuan IC 50 Pengujian ini menggunakan mikroplate 96 sumuran, caranya dengan memasukkan 120 µl larutan buffer fosfat 0,02 ph 6,8, tambahkan 40 µl larutan tirosinase, ditambahkan 20 µl larutan sampel. Setelah itu, larutantersebut di inkubasi pada suhu 25 o Cselama 10 menit.tambahkan 20

35 17 µl larutan L-DOPA 0,02 M. Lalu inkubasi selama 20 menit pada suhu 25 o C kemudian ukur absorbansinya diukur pada panjang gelombang 490 nm pada alat microplatereader. Absorbansi yang diperoleh diubah dalam bentuk persen inhibisi dengan menggunakan rumus : [ (A-B)-(C-D)] x 100%. A-B Keterangan: A = Absorbansi larutan tanpa sampel + enzim B = Absorbansi larutan tanpa sampel tanpa enzim C = Absorbansi larutan sampel + enzim D = Absorbansi larutan sampel tanpa enzim H. Analisis Data Dalam analisis data hasiluji aktivitas penghambatan tirosinasemenggunakan regresi non linier pada program GradhPad Prism versi 4.

36 18 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Determinasi Tanaman Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Botani dan Genetika Program Studi Pendidikan Biologi Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Muhammadiyah Purwokerto dengan menggunakan buku Flora of Java Vol. 1 (Backer & Bakhuizen van den Brink, 1963). Tujuan dilakukannya determinasi tanaman untuk mengetahui dan memastikan kebenaran identitas dari tanaman yang akan diambil untuk menghindari kesalahan dalam pengumpulan bahan serta mencegah kemungkinan tercampurnya dengan tanaman lain. Caranya dengan mencocokkan tanaman dengan kunci- kunci determinasi sehingga dapat dipastikan kebenaran tanaman yang akan digunakan dalam penelitian. Hasil determinasi spesimen tumbuhan tersebut merupakan Anredera yang termasuk dalam familia Basellaceae, dan di Indonesia dikenal dengan nama Binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steen). Dengan kunci determinasi sebagai berikut: 1b-2b-3b-4b-12b-13b-14b-17b-18b-18b-20b-21b-22b-23b-24b-25b-26b-27a- 28b-29b-30b-31b-403b-404b-405b-414a-415b-451b-466b-467b-468b-469b- 470e-541a..(49. Basellaceae) 49. Basellaceae. 1b.(2. Anredera) 2. Anredera 1a Anredera cordifolia (Tenore) Steen. B. Penyiapan Simplisia Daun Binahong diperoleh di Desa Dukuhwaluh, Kabupaten Banyumas.Daun Binahong dipanen pada jam WIB.Daun yang sudah terkumpul kemudian dikeringkan.tujuan dari pengeringan untuk mengeringkan atau mengurangi kandungan air yang terkandung dalam daun

37 19 binahong sehingga kandungan bahan aktif dapat terjaga dari kerusakan, mencegah reaksi enzimatis serta mencegah perubahan kimia.kadar air yang terlalu tinggi dapat menyebabkan kemungkinan tumbuhnya mikroorganisme seperti jamur dan bakteri. Proses pengeringan dilakukan selama 3 hari atau sampai benar- benar kering dengan menggunakan lemari pengering. Selama pengeringan daun harus dibolak balik agar pemanasan merata dan proses pengeringan berlangsung cepat. Pengeringan ini dianggap cukup apabila daun sudah mengering dan rapuh bila diremas akan hancur dan mengeluarkan bunyi. Setelah didapat simplisia daun binahong yang kering kemudian di blender untuk mendapatkan serbuk simplisia.tujuan dari penyerbukan untuk meningkatkan tingkat kehalusan yang sesuai dengan Farmakope yaitu derajat kehalusan serbuk halus untuk simplisia (Anonim, 1995).Dalam penyerbukan tidak boleh terlalu halus karena dapat memungkinkan simplisia lolos dalam penyaringan saat maserasi. Serbuk yang dihasilkan ± 420 gr dari simplisia basah 5,3 kg dan berwarna hijau tua. C. Pembuatan Ekstrak Etil Asetat Daun Binahong Pada pembuatan ekstrak etil asetat daun binahong ini menggunakan metode maserasi. Maserasi adalah metode ekstraksi yang dilakukan dengan merendam serbuk simplisia dengan menggunakan pelarut yang tepat pada suhu kamar yang terlindung dari cahaya. Ekstraksi daun binahong dilakukan dengan cara sebanyak 350 gr serbuk daun binahong dengan menggunakan cairan penyari etil asetat selama 2 hari atau 48 jam yang disertai pengadukan. Caranya untuk hari petama, rendam 350 gr serbuk daun binahong dengan 3,5 liter pelarut etil asetat disertai pengadukan kemudian dibiarkan selama 24 jam. Selanjutnya untuk hari kedua, hasil rendaman diperas dan diendapkan selama sehari untuk memisahkan serbuk simplisia yang dimungkinkan terbawa saat pemerasan.kemudian dilakukan remaserasi agar memperoleh hasil yang maksimal ekstraksi.proses ekstraksi diulangi 2 kali dengan merendam serbuk hasil perasan simplisia dengan jumlah dan jenis pelarut yang sama saat

38 20 maserasi. Hasil maserasi berupa maserat yang mengandung senyawa- senyawa dari simplisia daun binahong.dan didapatkan maserat berwarna hijau pekat kehitaman.selanjutnya ekstrak hasil perasan dipekatkan denganrotary evaporator dan sebagian di taruh di lemari asam dengan menggunakan cawan porselen sampai didapatkan ekstrak kental.karena etil asetat sifatnya mudah menguap jadi semua perlakuan dilakukan di lemari asam.kecuali yang penguapannya menggunakan evaporator. Ekstrak kental yang didapat dari 350 gr serbuk simplisia daun binahong adalah 22, 51 gr. Dari perhitungan di dapat % rendemen ekstrak etil asetat daun Binahong adalah 6,43 % (b/b). D. Uji Aktivitas Inhibisi Tirosinase dan Penentuan IC 50 Penelitian ini menggunakan Microplate reader.tujuan dari menggunakan microplate reader karena mempunyai keuntungan relatif cepat, mudah dan murah. Pengujian aktivitas inhibitor tirosinase dilakukan pada ekstrak etil asetat daun binahong sebagai sampel untuk mengetahui daya inhibisi terbaik terhadap enzim tirosinase.dan sebagai kontrol positifnya digunakan hidroquinon.hidroquinon sudah dikenal dapat mempengaruhi enzim tirosinase sehingga dapat menghambat oksidasi enzimatik tirosin menjadi DOPA, serta oksidasi DOPA menjadi melanin juga terhambat (Katzung, 1995). Menggunakan substrat L-DOPA karena substrat ini dengan enzim tirosinase akan menghasilkan dopakrom yang selanjutnya dapat membentuk melanin. Untuk dapat mencegahnya dapat dilakukan oleh inhibitor tirosinase. Tetapi, apabila ekstrak tersebut mengandung senyawa inhibitor tirosinase, maka aktivitas enzim tirosinase akan terhambat dalam memproduksi melanin. Pada penelitian ini, pembentukan produk dopakrom ditandai munculnya warna coklat yang dapat menyebabkan terhambatnya reaksi substrat-tirosinase sehingga mengakibatkan produksi dopakrom berkurang yang ditandai dengan penurunan intensitas warna coklat.pembentukan dopakrom ini diukur

39 21 menggunakan microplatereader dengan memakai mikroplate 96 sumuran, pada panjang gelombang 490 nm. Tabel 1.Persentase inhibisi aktivitas penghambatan melanin ekstrak etil asetat daun binahong. Konsentrasi Persentase Konsentrasi Persentase sampel ± SD Hidroquinon ± SD inhibisi inhibisi (µg/ml) (µg/ml) 50 44,020 3,200 1,375 19,483 1, ,080 4,676 2,75 26,182 1, ,449 1,152 5,5 31,949 0, ,322 4, ,788 0, ,490 2, ,187 0,555 Penentuan uji inhibisi tirosinase dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya daya inhibisi senyawa bioaktif pada sampel ekstrak etil asetat daun binahong. Dari tabel 1, dapat terlihat bahwa pada konsentrasi 50 µg/ml persentase inhibisi yaitu 44,020% dan pada konsentrasi 100 µg/ml terjadi peningkatan sebesar 45,080%. Kemudian pada konsentrasi 200 µg/ml terjadi penurunan persentase inhibisi yaitu 43,449%. Sedangkan pada konsentrasi 400 µg/ml yaitu 43,322% merupakan persentase inhibisi terendah, sedangkan persentase inhibisi tertinggi pada konsentrasi 800 µg/ml sebesar 48,490%. Dari hasil persentase inhibisi pada sampel daun binahong menghasilkan persentase yang hampir sama, hal ini berkaitan dengan reaksi enzimatis yaitu ketika ada enzim yang direaksikan dengan substrat akan menghasilkan jumlah produk. Dalam hal ini dimungkinkan, jumlah produk yang dihasilkan hampir sama pada tiap- tiap konsentrasi. Setelah ditentukan persentase inhibisi, selanjutnya penentuan nilai IC 50.IC 50 merupakan konsentrasi yang dibutuhkan dalam menghambat 50% aktivitas tirosin- tirosinase.untuk persentase aktivitas inhibisi hidroquinon bahwa semakin besar konsentrasi maka semakin besar pula persentase inhibisi. Persentase inhibisi terendah dimiliki pada konsentrasi 1,375 µg/ml yaitu 19,483%, sedangkan yang tertinggi dimiliki pada konsentrasi 22 µg/ml yaitu 38,187%.

40 22 Dari hasil tersebut menunjukkan, bahwa pembentukan produksi dopakrom terjadi, hal ini menyebabkan produksi dopakrom menjadi berkurang.selanjutnya penentuan nilai IC 50 dengan menghubungkan konsentrasi sampel (ekstrak etil asetat daun binahong) atau kontrol positif dengan persen inhibisi.untuk menentukan nilai IC 50 maka dibuatlah kurva hubungan konsentrasi inhibitor yaitu sampel (ekstrak etil asetat daun binahong) atau kontrol positif (hidroquinon) dengan aktivitas inhibisi seperti yang terdapat pada gambar 3. Gambar 3. Kurva hubungan non linier dari log konsentrasi ekstrak etil asetat daun binahong terhadap persen inhibisi. Gambar 4. Kurva hubungan non linier dari log konsentrasi kontrol positif (hidroquinon) terhadap persen inhibisi.

41 23 Berdasarkan pada gambar 3, terlihat bahwa persentase inhibisi yang dihasilkan tersebut tidak linier.jadi analisis data penelitian ini menggunakan regresi non linier GraphPad Prism versi 4.Yaituperbandingan antara log konsentrasi dengan persen inhibisi. Nilai IC 50 dari ekstrak etil asetat daun binahong sebesar 299,1µg/ml. Hal ini dapat dikatakan bahwa ekstrak etil asetat daun binahong memiliki aktivitas penghambatan melanin yang rendah. Semakin besar nilai IC 50 maka aktivitas penghambatan terhadap melanin akan semakin kecil. Sedangkan pada gambar 4. Terlihat bahwa persentase inhibisi hidroquinon (kontrol positif) nilai IC 50 sebesar 16,34µg/ml. Hal ini menunjukkan bahwa hidoquinon terbukti mempunyai aktivitas penghambatan terhadap melanin yang lebih tinggi, karena dilihat dari nilai IC 50 dari hidroquinon. E. Identifikasi Kandungan Senyawa Uji kandungan senyawa atau fitokimia dilakukan pada ekstrak etil asetat daun binahong sebanyak 0,01 gr dilarutkan dengan pelarut etil asetat sebanyak 10 ml. Dengan melakukan uji fitokimia ini dapat memberikan informasi penting tentang senyawa metabolit sekunder yang terkandung pada ekstrak. Tujuan dari uji ini untuk menentukan golongan senyawa yang terdapat pada ekstrak etil asetat daun binahong (Anredera cordifolia) yang mempunyai aktifitas sebagai penghambatan tirosinase. Identifikasi kandungan senyawa yang akan diuji yaitu flavonoid, saponin, tanin dan alkaloid. Golongan senyawa dalam ekstrak dapat ditentukan dengan melihat warna bercak setelah ditambahkan pereaksi spesifik. Tabel 2.Identifikasi kandungan senyawa ekstrak etil asetat daun binahong. Flavonoid Saponin Tanin Alkaloid Ekstrak Etil Asetat Daun Binahong

42 24 Berdasarkan Tabel 2, dapat diketahui bahwa ekstrak etil asetat daun binahong mengandung senyawa golongan flavonoid dan saponin. Menurut Chang (2009), Flavonoid yang terkandung dalam ekstrak etil asetat daun binahong diduga akan memberikan efek inhibisi terhadap enzim tirosinase karena golongan flavonoid merupakan salah satu kelompok senyawa yang aktif sebagai inhibitor tirosinase. Senyawa golongan flavonoid yang sudah terbukti mengandung inhibitor tirosinase seperti golongan senyawa flavonol (kuersetin, kaempferol dan mirisetin), golongan senyawa flavon (norartokarpetin), isoflavon (kalikosin), flavanol (dihidromorin dan taksifolin), flavanon (stepogenin), isoflavon (gliasperin C, glabridin) dan kalkon (Chang, 2009).Dan untuk hasil identifikasinya setelah dilihat di sinar tampak, terlihat bercak warna kuning berpendar.hal tersebut menandakan bahwa ekstrak etil asetat daun binahong mengandung senyawa flavonoid. Dan hasil bercak (spot) pada identifikasi flavonoid ekstrak etil asetat daun binahong menghasilkan 2 bercak yaitu Rf1 sebesar 0,862 ; HRf = 86,25 dan bercak ke dua Rf2 sebesar 0,9125 ; dan nilai HRf nya sebesar 91,25. Selanjutnya, selain mengandung flavonoid ekstrak etil asetat daun binahong juga mengandung senyawa saponin.saponin merupakan glikosida triterpena dan sterol yang mempunyai sifat seperti sabun yaitu berbusa (Harborne, 1987).Dan hasil uji sederhana ketika ekstrak dilarutkan dengan air yang kemudian dikocok, ekstrak etil asetat daun binahong menghasilkan busa.selanjutnya, hasil identifikasi setelah dilihat di sinar tampak terlihat bercak warna biru atau kadang- kadang kekuningan jika diamati pada sinar tampak (Depkes RI, 1987).Hal ini menandakan bahwa ekstrak etil asetat daun binahong mengandung senyawa saponin. Dan hasil bercak pada ekstrak etil asetat daun binahong menghasilkan nilai Rf sebesar 0,75; dan nilai HRf yaitu sebesar 75. Identifikasi senyawa tanin, Tanin merupakan senyawa fenolik yang dapat membentuk kompleks dengan protein yang terdapat di jaringan ikat pembuluh pada hampir semua jenis tanaman.senyawa yang diduga mengandung senyawa tanin yang berpotensi sebagai inhibitor tirosinase

43 25 adalah asam galat (Kubo et al, 2003).Dan hasil identifikasi senyawa tanin pada ekstrak etil asetat daun binahong tidak mengandung senyawa tanin dilihat dari sinar UV 366, setelah disemprot bercak terlihat warna merah, seharusnya bercak berwarna ungu kehitaman. Dan untuk nilai Rf pada ekstrak etil asetat daun binahong terlihat 2 bercak dengan nilai Rf 0,95 dan 0,86 ; dan untuk nilai HRf nya sebesar 95 dan 86. Sedangkan untuk bercak larutan pembanding tidak terlihat, hal ini dimungkinkan kurangnya konsentrasi pada saat penotolan. Selanjutnya identifikasi senyawa alkaloid.alkaloid merupakan senyawa metabolit sekunder yang terbesar, baik dari segi jumlah senyawa maupun dalam segi sebarannya dalam tumbuhan.dan hasil yang didapatkan pada ekstrak etil asetat daun binahong tidak mengandung senyawa alkaloid.dilihat dari bercak warna yaitu dilihat dari sinar tampak berwarna kuning kehijauan, seharusnya berwarna jingga sampai merah bata.tetapi pada penelian yang dilakukan oleh Rochani (2009) menunjukkan bahwa ekstrak dari etil asetat daun binahong mengandung senyawa alkaloid.hal ini dimungkinkan pada penelitian ini kurangnya konsentrasi pada saat penotolan. Dan nilai Rf dari bercak yang dihasilkan sebesar 0,95 dan HRfnya yaitu 95.

44 26 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan 1. Ekstrak etil asetat daun binahong (Anredera cordifolia) mempunyai aktivitas terhadap penghambatan tirosinase yang rendah. 2. Nilai IC 50 dari ekstrak etil asetat daun binahong sebesar 299,1µg/ml, dan nilai IC 50 kontrol positif (hidroquinon) yaitu 16,34 µg/ml. B. Saran 1. Ekstrak dari etil asetat daun binahong perlu diproses pemurnian lebih lanjut agar memperoleh senyawa murni yang aktif berperan sebagai inhibitor tirosinase dan antioksidan. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang aktivitas penghambatan tirosinase daun binahong dengan substrat selain L-DOPA.

45 27 DAFTAR PUSTAKA Andersen, Q. M., and Markham, K. R Flavonoids.Chemistry, Biochemistry, and Applications.Boca. Raton, FL: CRC Press, Taylor & Francis. Arung ET, kusuma IW, Iskandar YM. Yasutake S. Shimizu K. Kondo R Screening of Indonesian plants for tyrosinase inhibitory activity. Journal Wood Science 51: Backer, CA and Bakkuizen v/d Brink RC Jr Flora of Java vol 1. Wolter- Noordhoff NV. Groningen. P:2. Balsam, M.S. and Sagarin, E., 1972.Cosmetics Science and Technology, 2 nd ed, Vol. 3, John Wiley and Sons, New York. Batubara I, Darusman LK, Mitsunaga T, Rahmniwati M, Djauhari E Potency of Indonesia medicinal plants as tyrosinase inhibitors and antioxidant agent. Journal of Biologi Science, 10 : BPOM Monografi Ekstrak Tumbuhan Obat Indonesia Volume I. Jakarta : BPOM RI. Chang T, Ding HY, Tai SSK, Wu CY Mushroom tyrosinase inhibitory effects of isoflavones isolated from soygerm koji fermented with Aspergillus oryzae BCRC Journal of Food chemistry. 105: Chang T An updated review of tyrosinase inhibitor. International Journal of molecular science: Depkes, RI Farmakope Indonesia ed III. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Depkes, RI Sediaan Galenika. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Depkes, RI Farmakope Indonesia ed IV. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

46 28 Depkes RI.2000.Inventaris Tanaman Obat Indonesia (I).Jilid I. Jakarta : Departemen Kesehatan RI dan Kesejahteraan Sosial RI Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan. Halaman Depkes, RI Inventaris Tanaman Obat Indonesia (VI). Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Tawangmangu. Food and Drug Administration (FDA) Guidance for Industry Photosafety Testing, Pharmacology Toxycology Coordinating Committee in the Centre for Drug Evaluation and Research (CDER) at the FDA. Gennaro, RA., Remington s : Practice of Pharmacy. Nineteenth edition Vol II.Pennsylvania : Mack Publishing Company Easton. Germano, M.P., Cacciola, F., Donato, P., Dugo, P., Certo, G., D Angelo, V., et al., 2012., Betula pendula leaves :polyphenolic characterization and potential innovative usi in skin whitening products, Fitoterapia. 83: Harborne.1987.Metode Fitokimia Penuntuk Cara Modern MenganalisisTumbuhan. Diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata. Bandung: ITB Press. Hill, MG Specialty Board Review Dermatology. Katzung, G.B Basic and Clinical Pharmacology, a lange medical book. Prentice-Hall International, USA. Kim, Y. J., K.J. Kyung, J.H. Lee., and H. Y. Chung. (2004) Dihydroxybiphenyl as a New Potent Tyrosinase Inhibitor. J. Biol. Pharm. Bull. 28 (2) Kubo, I., Ikuyo, KH., Ken, IN., Frida, S., Midori, T., Jose, S., et al., Tyrosinase Inhibitors From Galls of Rhus javanica Leaves and Their Effects on Insects. Naturforsch Lachman, Leon, dkkl Teori dan Praktek Farmasi Industri II (terjemahan ) Siti suyatmi.edisi ketiga. Jakarta: UI Press. Likhitwitayawuid.K Stilbenes with tyrosinase inhibitor activity.current Science, 94: Manoi,F Binahong (Anredera cordifolia) sebagai Obat.Warta penelitian dan Pengembangan Tanaman Industri. Vol.15 (1): hal 4.