PENGEMBANGAN METODE KULTUR EMBRYONIC STEM CELLS DARI EMBRIO HASIL FERTILISASI DAN PRODUKSINYA DARI EMBRIO PARTENOGENETIK MENCIT THOMAS MATA HINE

Transkripsi

1 PENGEMBANGAN METODE KULTUR EMBRYONIC STEM CELLS DARI EMBRIO HASIL FERTILISASI DAN PRODUKSINYA DARI EMBRIO PARTENOGENETIK MENCIT THOMAS MATA HINE SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

2 PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Pengembangan Metode Kultur Embryonic Stem Cells dari Embrio Hasil Fertilisasi dan Produksinya dari Embrio Partenogenetik Mencit adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka dibagian akhir disertasi ini. Bogor, Agustus 2009 Thomas Mata Hine NIM B

3 ABSTRACT THOMAS MATA HINE. Development Cultured Methods of Fertilized Embryo Derived-Stem Cells and their Production from Mouse Parthenogenetic Embryos. Under Direction of ARIEF BOEDIONO, IMAN SUPRIATNA, and DONDIN SAJUTHI. The ability of embryonic stem cells (ESC) to contribute become all cell type of the body draw enthusiasm a lot of researcher to investigate and exploit ESC for various importance. One of the benefits of ESC is for treatment of various degenerative diseases resulted from cell damage or aging at certain tissues or organs of the body. In addition, ESC also applicable for pre-clinical trials new drugs before used for medical treatment for animal and human being. The efficiency of ESC deriving is influenced by some factors that are: stadia of the embryos, culture system, type of feeder layer, and passage method. In this research, we test the growth potential of ESC yielded by embryo at cleavage, morula, and blastocyst stage; culture of ESC from inner cell mass (ICM) of blastocyst isolated by enzymatic or immunosurgery methods at cumulus feeder layer (CFL) or cumulus conditioned medium in combination with leukemia inhibitory factor (LIF), passage of ESC with mechanical or enzymatic method, and furthermore induce of ESC to be differentiated. In addition, we produced parthenogenetic ESC in effort to minimize the ethical and immunogenicity problems resulted from fertilized embryos. Result of the research indicated that embryos at the morula stage can produce ESC, with attachment rate and number of primary ESC colony were lower than blastocyst, but doubling time and outgrowth were higher than the blastocyst, while embryos at the cleavage stage were unable to produce ESC. In the second experiment, isolation of ICM of blastocyst by enzymatic method were able to produce ESC wich was similar with immunosurgery, and was higher than produced by intact blastocyst. At the third experiment, effectiveness of CFL comparable with MEF feeder layer, and the LIF at concentration 10 ng/ml at CFL or 20 ng/ml at CCM were able to improve efficiency of ESC deriving, and the mechanical method for ESC colony passage showed the better results than enzymatic method. In addition, ESC colony culture in CFL or CCM was able to differentiate become cardiomyocyte-like cells and neuron-like cells. In the latest experiment, mouse parthenogenetic embryos could produced ESC with growth potential was lower than derive from fertilized embryos. Keywords: culture methods, fertilized, parthenogenetic, mouse embryos, stem cells

4 RINGKASAN THOMAS MATA HINE. Pengembangan Metode Kultur Embryonic Stem Cells dari Embrio Hasil Fertilisasi dan Produksinya dari Embrio Partenogenetik Mencit. Dimbimbing oleh ARIEF BOEDIONO, IMAN SUPRIATNA, dan DONDIN SAJUTHI. Embryonic stem cells (ESC) adalah sel-sel yang dihasilkan dari kultur sel embrio pra-implantasi, yang memiliki kemampuan untuk berkembang menjadi semua tipe sel yang menyusun jaringan tubuh suatu organisme seperti sel syaraf, sel pankreas, sel ginjal, sel hati, sel darah, sel tulang, dan sebagainya. Dengan kemampuan seperti ini, ESC dapat digunakan untuk terapi berbagai penyakit degeneratif atau penyakit lainnya yang diakibatkan oleh adanya kerusakan atau penuaan sel pada suatu jaringan atau organ tubuh tertentu. Selain itu, ESC juga dapat digunakan untuk pengujian obat baru sebelum digunakan untuk pengobatan pada hewan dan manusia. Ada beberapa masalah yang timbul dalam produksi ESC: 1) umumnya ESC diproduksi dari inner cell mass (ICM) blastosis yang memiliki potensi diferensiasi yang lebih terbatas dibandingkan dengan embrio pada stadium cleavage dan morula. 2) ESC selama ini diproduksi dari kultur blastosis utuh atau kultur ICM hasil isolasi dengan metode immunosurgery. Kultur blastosis utuh menghasilkan tingkat pertumbuhan koloni ESC yang rendah sedangkan metode immunosurgery memiliki harga bahan yang mahal, 3) mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder layer yang umumnya digunakan untuk kultur ESC sangat sensitif terhadap kontaminasi dengan bakteri atau jamur, dan metode produksinya relatif rumit, 4) ESC yang diproduksi dari embrio hasil fertilisasi memiliki tingkat imunogenitas yang tinggi dan berdampak pada tingginya resiko penolakan oleh jaringan pasien pada saat terapi, dan menimbulkan masalah etika karena diproduksi dari embrio yang berpotensi untuk menghasilkan individu baru. Untuk mengatasi masalah-masalah tersebut maka dalam penelitian ini, ESC diproduksi dari embrio yang berada pada stadium cleavage dan morula, isolasi ICM dengan metode enzimatik, kultur ESC pada feeder layer kumulus (CFL) atau conditioned medium cumulus (CCM), dan produksi ESC dari embrio partenogenetik. Tujuan penelitian ini adalah: 1) mengukur kemampuan tumbuh ESC yang dihasilkan oleh embrio pada stadium cleavage, morula dan blastosis, 2) mengembangkan metode isolasi ICM blastosis yang lebih murah dan sederhana untuk produksi ESC, 3) menemukan feeder layer dan conditioned medium alternatif untuk kultur ESC, 4) mengetahui profil pertumbuhan ESC partenogenetik. Kegiatan penelitian diawali dengan produksi sel kumulus dari mencit DDY betina, pembuatan CFL, CCM, identifikasi protein pada CCM dengan Sodium Dedocyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), dan pembuatan MEF feeder layer. Kegiatan selanjutnya adalah superovulasi mencit betina DDY umur 2 hingga 4 bulan dengan pregnant mare s serum gonadotropin (PMSG) dan human chorionic gonadotropin (hcg), perkawinan dengan mencit jantan dengan perbandingan 1:1, koleksi embrio yang berada pada stadium cleavage, morula dan blastosis, isolasi ICM blastosis dengan metode enzimatik atau immunosurgery, kultur ESC pada MEF feeder layer,

5 CFL atau CCM baik secara tunggal maupun kombinasi dengan leukemia inhibitory factor (LIF), pasase koloni ESC dengan metode mekanis atau enzimatik, uji pluripotensi dengan pewarnaan alkaline phosphatase (ALP), dan induksi diferensiasi ESC dengan melakukan perpanjangan masa kultur dalam ESC medium yang tidak disuplementasi dengan LIF. Hasil penelitian menunjukkan bahwa embrio stadium morula dapat menghasilkan ESC, dengan attachment rate dan tingkat pembentukan koloni primer yang lebih rendah, tetapi doubling time dan outgrowth yang lebih tinggi daripada blastosis; sedangkan embrio stadium cleavage tidak mampu menghasilkan ESC. Pada tahap kedua, isolasi ICM blastosis dengan metode enzimatik mampu menghasilkan \produksi ESC yang setara dengan immunosurgery, dan lebih tinggi dari yang dihasilkan kultur blastosis utuh. Tahap ketiga, efektivitas sel kumulus sebagai feeder layer pada kultur ESC mencit sebanding dengan mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder layer, dan peningkatan konsentrasi LIF hingga 10 ng/ml pada CFL atau 20 ng/ml pada CCM mampu meningkatkan keberhasilan kultur ESC. Passage terhadap koloni ESC yang terbentuk paling baik dilakukan dengan metode mekanis. Selain itu, ESC hasil kultur pada CFL atau CCM berdiferensiasi menjadi cardiomyocyte-like cells dan neuron-like cells. Tahap keempat, embrio partenogenetik mencit dapat menghasilkan ESC dengan kemampuan tumbuh yang lebih rendah dari yang dihasilkan embrio hasil fertilisasi. Kata Kunci: metode kultur, fertilisasi, partenogenetik, embrio mencit, embryonic stem cells

6 Hak cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

7 PENGEMBANGAN METODE KULTUR EMBRYONIC STEM CELLS DARI EMBRIO HASIL FERTILISASI DAN PRODUKSINYA DARI EMBRIO PARTENOGENETIK MENCIT THOMAS MATA HINE Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Biologi Reproduksi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

8 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tertutup : 1. Dr. drh. Ita Djuwita, M.Phil 2. drh. Bambang P. Priosoeryanto, MS, Ph.D Penguji Luar Komisi pada Ujian Terbuka : 1. dr. Triono Soendoro, Ph.D 2. Dr. drh. M. Agus Setiadi

9 Judul Disertasi Nama NIM : Pengembangan Metode Kultur Embryonic Stem Cells dari Embrio Hasil Fertilisasi dan Produksinya dari Embrio Partenogenetik Mencit : Thomas Mata Hine : B Disetujui Komisi Pembimbing Prof. drh. Arief Boediono, Ph.D Ketua Prof. Dr. drh. Iman Supriatna Anggota Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST, Ph.D Anggota Diketahui Ketua Program Studi Biologi Reproduksi Dekan Sekolah Pascasarjana Prof. Dr. drh. Iman Supriatna Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S Tanggal Ujian: 9 Oktober 2009 Tanggal Lulus:

10 PRAKATA Limpahan syukur penulis panjatkan ke Hadirat Allah Yang Maha Pengasih dan Penyayang, yang di dalam Kristus Yesus, Tuhan dan Juruselamat umat manusia telah menyatakan kasihnya melalui penyertaan dan pemeliharaannya selama penulis menyelesaikan studi Doktoral di Institut Pertanian Bogor. Tema penelitian ini adalah embryonic stem cells, yang dilaksanakan dalam kurun waktu lebih kurang 4 tahun, sejak Agustus 2005 hingga Juli Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih kepada Prof. `drh. Arief Boediono, Ph.D selaku ketua komisi pembimbing, Prof. Dr. drh. Iman Supriatna dan Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST, Ph.D, selaku anggota komisi pembimbing yang dengan penuh ketulusan memberi arahan dan masukan selama pelaksanaan penelitian hingga penulisan disertasi. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Prof. Dr. drh. Mozes R. Toelihere, M.Sc (Alm.) yang walaupun proses pembimbingan tidak berlanjut namun segala arahan yang pernah disampaikan sangat berarti bagi penulis didalam berkarya di masa mendatang. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Dr. drh. Ita Djuwita, M.Phil dan drh. Bambang Pontjo Priosoeryanto, MS, Ph.D selaku penguji luar komisi pada Ujian Tertutup, dr. Triono Soendoro, Ph.D dan Dr. drh. M. Agus Setiadi, selaku penguji luar komisi pada Ujian Terbuka, atas segala masukan yang sangat bermanfaat untuk menyempurnakan tulisan ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Rektor, Dekan sekolah Pascasarjana, Dekan Fakultas Kedokteran Hewan, Ketua Departemen KRP, Ketua Program Studi, staf pengajar dan staf administrasi Biologi Reproduksi, serta seluruh staf Pascasarjana IPB yang telah menerima penulis untuk melanjutkan studi di IPB serta membantu kelancaran proses penyelesaian studi penulis. Ucapan yang sama juga disampaikan kepada Rektor dan Dekan Fakultas Perternakan Universitas Nusa Cendana yang telah memberikan ijin studi, dan Pemda Propinsi NTT, Dirjen Dikti, dan PT Kalbe Farma, Tbk. atas dukungan finansial dalam rangka penyelesaian studi penulis. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Drh. Ita Djuwita, M. Phil, sebagai Kepala Laboratorium Embriologi dan Kepala Laboratorium PSSP yang telah memberi ijin kepada penulis untuk melakukan penelitian dan menggunakan berbagai fasilitas yang ada di kedua laboratorium tersebut, kepada