EKSPRESI GEN Gα DAN GST PADA KEDELAI KULTIVAR LUMUT YANG MENDAPAT CEKAMAN ALUMINIUM SITI MUTTI SAWITRI

Transkripsi

1 EKSPRESI GEN Gα DAN GST PADA KEDELAI KULTIVAR LUMUT YANG MENDAPAT CEKAMAN ALUMINIUM SITI MUTTI SAWITRI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007

2 ABSTRAK SITI MUTTI SAWITRI. Ekspresi Gen Gα dan GST Pada Kedelai Kultivar Lumut Yang Mendapat Cekaman Aluminium. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO. Protein G subunit α berinteraksi dengan molekul reseptor yang berlokasi di membran plasma dan terlibat di dalam banyak regulasi sinyal transduksi. Ekspresi gen GST diinduksi oleh cekaman aluminium pada banyak tanaman. Diduga kedua gen ini terlibat dalam mekanisme toleransi tanaman terhadap cekaman aluminium. Tujuan penelitian ini adalah menguji ekspresi gen Gα dan GST kedelai kultivar Lumut yang mendapat cekaman aluminium. Kondisi cekaman dilakukan dengan menggunakan larutan hara. Cekaman yang diberikan yaitu ph 4 dan ph 4+1.6mM Al. Tanaman pada larutan hara ph 6 digunakan sebagai kontrol perlakuan. RNA total diisolasi dengan menggunakan kit Trizol dan sintesis cdna dilakukan melalui transkriptase balik. Analisis ekspresi kedua gen tersebut dilakukan dengan menggunakan metode PCR. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa gen Gα dan GST diekspresikan tidak begitu berbeda pada tanaman yang diberi cekaman aluminium daripada ph 6 ataupun ph 4. Hal ini menunjukkan bahwa ekspresi gen Gα dan GST tidak terinduksi cekaman aluminium.

3 SURAT PERNYATAAN Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul: Ekspresi Gen Gα dan GST Pada Kedelai Kultivar Lumut Yang Mendapat Cekaman Aluminium Adalah benar hasil karya saya sendiri dan belum pernah dipublikasikan untuk kepentingan lain. Semua sumber data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan secara benar dan dapat diperiksa kebenarannya. Bogor, Oktober 2007 Siti Mutti Sawitri NRP P

4 EKSPRESI GEN Gα DAN GST PADA KEDELAI KULTIVAR LUMUT YANG MENDAPAT CEKAMAN ALUMINIUM SITI MUTTI SAWITRI Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Bioteknologi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007

5 Judul Tesis Nama NRP : Ekspresi Gen Gα dan GST Pada Kedelai Kultivar Lumut Yang Mendapat Cekaman Aluminium : Siti Mutti Sawitri : P Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Ir. Suharsono, DEA Ketua Dr. Ir. Utut Widyastuti, Msi Anggota Diketahui Ketua Program Studi Bioteknologi Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Ir. Muhammad Jusuf Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS Tanggal Ujian: 30 Oktober 2007 Tanggal Lulus:

6 PRAKATA Alhamdulillah, tiada hal yang lebih indah untuk diucapkan selain syukur yang tiada terhingga kepada Allah Subhanallahu Wata ala yang telah memberi kesempatan kepada penulis untuk menyelesaikan penelitian serta penulisan tesis ini. Selama proses pelaksanaan penelitian dan penulisan tesis, penulis mendapat banyak bantuan dari berbagai pihak yang menjadi bagian dalam penyelesaian proses pembuatan tesis ini. Dengan penuh rasa hormat, penulis menyampaikan penghargaan dan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Dr. Ir. Suharsono, DEA selaku ketua komisi pembimbing yang telah memperkaya wawasan serta memberikan bimbingan, arahan dan kemudahan kepada penulis dari awal hingga akhir. 2. Dr. Ir. Utut Widyastuti Suharsono, Msi selaku anggota komisi pembimbing atas ilmu, waktu, bimbingan, nasehat, serta dorongan yang selalu diberikan kepada penulis selama ini. 3. Dr. Miftahuddin selaku dosen penguji atas saran dan kritik yang berguna dalam penyempurnaan penulisan tesis. 4. Rektor IPB, Dekan Sekolah Pascasarjana IPB dan Ketua Program Studi Bioteknologi atas kesempatan yang diberikan untuk mengikuti pendidikan pascasarjana di IPB Bogor. 5. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) yang telah menyediakan fasilitas untuk melakukan penelitian. 6. Proyek Hibah Bersaing Perguruan Tinggi XII atas nama Dr. Ir. Utut Widyastuti Suharsono, Msi dengan judul Analisa Gen Penyandi Protein Heterotrimerik-G subunit α yang Terlibat dalam Sistem Toleransi Tanaman Kedelai terhadap Cekaman Aluminium, yang telah membiayai penelitian ini. 7. Rekan-rekan sejawat di Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman PPSHB IPB: Patner sejati Rizki Amelia Lubis, Mashuda, Ratna Wulandari, Syarifin Firdaus, Yasinta Ratna, Yassier Anwar, Rida Khastini, Jaya, Muzuni, Sri Listyowati, Hadi Sunarso, Hanum, Hakim, Thesiawaty, Niken, Ulfa, Abdul Mulya, Pepy dan rekan-rekan lainnya yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu, terima kasih atas kerjasama, bantuan dan dukungannya selama ini. Secara khusus, penulis sampaikan rasa terima kasih kepada Ibunda Nong Setiawati dan Ayahanda Memet Hakim atas pengorbanan moril, materil, serta doa yang tiada putus, suami Riza Rinjani atas kerelaan kesabaran kesetiaan dan dukungan kepada penulis untuk menyelesaikan penelitian ini dan Raisa Rinjani atas waktu yang hilang selama penulis sibuk. Sebagai penutup, penulis berharap semoga tulisan ini bermanfaat dan dapat memberikan sumbangan bagi perkembangan biologi molekuler kedelai Indonesia. Bogor, Oktober 2007 Penulis

7 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Tanjung Karang, Bandar Lampung pada tanggal 9 Oktober 1980 sebagai anak ketiga dari pasangan Bapak Memet Hakim dan Ibu Nong Setiawati. Saat ini Penulis telah menikah dengan Riza Rinjani dan memiliki putri Raisa Rinjani. Penulis menyelesaikan pendidikan sarjana di jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian Universitas Padjadjaran tahun Pada tahun yang sama penulis melanjutkan studi S2 pada Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana IPB Bogor.

8 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR x xi PENDAHULUAN... 1 Latar Belakang... 1 Tujuan Penelitian... 5 Hipotesis Penelitian... 5 TINJAUAN PUSTAKA... 6 Pengaruh Cekaman Aluminium Terhadap Tanaman... 6 Protein Heterotrimerik-G Subunit α... 7 Glutathione S-Transferase... 9 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Bahan dan Alat Metode Penelitian HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan Konsentrasi Cekaman Aluminium Isolasi RNA Total Sintesis cdna Total Analisis Ekspresi gen Gα Analisis Ekspresi gen GST Analisis Ekspresi gen GST SIMPULAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 34

9 x DAFTAR TABEL Halaman 1. GST yang terdapat pada kedelai Reduksi perpanjangan akar kultivar Lumut Reduksi perpanjangan akar kultivar Slamet Ekspresi baku gen Gα pada kultivar Lumut Ekspresi baku gen Gα pada kultivar Slamet Ekspresi baku gen GST8 pada kultivar Slamet Ekspresi baku gen GST12 pada kultivar Lumut Ekspresi baku gen GST12 pada kultivar Slamet... 27

10 xi DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Tahapan yang dilakukan dalam analisis ekspresi gen Gα dan GST RNA total akar kedelai kultivar Lumut pada perlakuan ph 6, ph 4, 20 ph mm Al Hasil PCR β-aktin yang berasal dari cetakan cdna murni Hasil PCR β-aktin yang cdnanya terkontaminasi DNA genom Ekspresi gen Gα dan β-aktin pada ph 6, ph 4, dan ph mm Al (A) Ekspresi gen GST8 pada kultivar Lumut (peka) dan ekspresi pada kultivar 24 Slamet (toleran) pada ph 6 jam ke-0 (B) Ekspresi gen GST8 pada kultivar Lumut pada ph 6 (1) dan ph mm Al (2) 7. Ekspresi gen GST12 dan β-aktin pada ph 6, ph 4 dan ph mm Al... 26

11 PENDAHULUAN Latar Belakang Kedelai (Glycine max (L). Merr) adalah salah satu bahan pangan penting bagi rakyat Indonesia. Kebutuhan kedelai dalam negeri rata-rata 2 juta ton/tahun, sedangkan produksi kedelai dalam negeri hanya 0.8 juta ton/tahun sehingga pemerintah harus mengimpor kedelai sebesar 1.2 juta ton setiap tahunnya (Atman 2006). Tingginya impor kedelai membuat pemerintah mencanangkan program bangkit kedelai. Implementasi program bangkit kedelai, akan ditempuh melalui 2 subprogram yaitu dengan intensifikasi, dan pengembangan kedelai pada lahan kering dan peningkatan Intensitas Pertanaman (IP) pada lahan seluas ha selama 5 tahun. Indonesia mempunyai tanah podzolik merah kuning (PMK) seluas 47.5 juta ha (CSAR 1997). Lahan ini dapat dimanfaatkan untuk peningkatan produksi kedelai nasional. Kendalanya adalah tanah podzolik merah kuning memiliki derajat keasaman yang tinggi dengan kelarutan Al yang tinggi sehingga menjadi faktor pembatas produksi tanaman karena Al merupakan racun bagi tanaman. Pada tanah asam (ph < 5), Al menjadi oktahedral hexahidrat yang larut (Al 3+ ) yang merupakan bentuk paling toksik bagi tanaman dengan gejala umumnya adalah pertumbuhan akar terhambat, akar menjadi pendek dan menebal khususnya akar utama (Ryan et al. 1993; Sasaki et al. 1994). Bagian ujung akar (tudung akar, meristem, zona perpanjangan akar) mengakumulasi Al lebih banyak dan paling mengalami kerusakan dibandingkan jaringan akar lainnya (Delhaize & Ryan 1995). Pada kedelai yang sensitif, cekaman Al menyebabkan penghambatan panjang akar yang signifikan (Lazof et al. 1994). Pengembangan budidaya tanaman kedelai pada lahan asam dapat dilakukan dengan perbaikan kesuburan tanah melalui pengapuran, pemupukan dan pemberian bahan organik. Teknik perbaikan lahan ini mahal sehingga memberatkan petani. Alternatif terbaik untuk pengembangan kedelai di lahan asam adalah dengan menggunakan varietas kedelai yang toleran. Penelitian untuk mendapatkan kultivar kedelai yang toleran terhadap tanah asam dan isolasi gen-gen yang ekspresinya diduga diinduksi oleh cekaman Al melalui penapisan differensial terhadap mrna telah dilakukan. Anwar et al.

12 2 (2000) berhasil mengklon enam fragmen gen yang responsif terhadap cekaman Al pada kedelai kultivar Lumut yaitu gmali1 (menyandikan H + -ATPase membran plasma, gmali14 (menyandikan Histon H3), gmali20 (menyandikan katalase), gmali49 (menyandikan NADH dehydrogenase), gmali50 (menyandikan Auxininduced Protein), dan sapali (menyandikan Aminoacyl Peptidase). Yuniati (2000) juga telah berhasil mengklon fragmen gen A36 dari kedelai kultivar Slamet yang toleran terhadap Al, dan diduga gen A36 menyandikan protein regulator pertumbuhan (Suharsono et al. 2003). Analisis ekspresi gen-gen yang diinduksi oleh aluminium pada tanaman kedelai telah banyak dilakukan. Menurut Muzuni (2003) ekspresi gen gmali14 dan gen gmali50 pada kedelai kultivar Lumut spesifik diinduksi oleh Al. Pada kultivar yang peka terhadap cekaman aluminium yaitu kultivar Lumut, gen gmali50 memperlihatkan ekspresi tertinggi pada dosis aluminium lebih rendah dibandingkan pada kultivar yang toleran cekaman aluminium yaitu kultivar Slamet (Tistama 2003). Ekspresi gen G subunit α, GST8 dan GST12 pada kultivar Slamet diinduksi oleh cekaman aluminium (Mashuda 2007). Pada kedelai terdapat dua kopi gen yang menyandikan protein heterotrimerik-gα yaitu SGA1 (Kim et al. 1995) dan SGA2 (Gotor et al. 1996). Suharsono & Suharsono (2004) berhasil mengisolasi gen SGA1 dari kedelai kultivar Slamet dan Lumut. Analisis kesamaan terhadap urutan nukleotidanya menunjukkan bahwa gen Gα yang diisolasi dari kedelai kultivar Lumut mempunyai kemiripan 91% dengan SGA2 dari kedelai kultivar Williams, sedangkan gen Gα dari kultivar Slamet mempunyai kemiripan dengan gen LlGA1 dari Lupinus luteus (Darlian 2005). Protein G merupakan salah satu protein yang penting dalam komunikasi sel untuk menanggapi perubahan lingkungan. Lintasan signal transduksi terjadi karena adanya interaksi antara sinyal dan reseptor permukaan membran sehingga sinyal sampai ke protein heterotrimerik-g yang diikuti dengan perubahan GDP menjadi GTP. Protein heterotrimerik-g berfungsi menyampaikan informasi dari reseptor protein G yang teraktivasi ke efektor di bagian hilir dari suatu jalur sinyal. Protein G subunit α mengaktifkan phospholipase C (PLC) yang terletak pada membran plasma, PLC menghidrolisis phosphatidylinositol 4,5-biphosphate

13 3 (PIP 2 ) untuk menghasilkan dua second messenger yaitu inositol 1,4,5- triphosphate (IP 3 ) yang dilepaskan ke dalam sitoplasma dan diacylglycerol (DAG) yang tetap berada di membran, yang mengaktifkan protein kinase C (PKC) (Becker et al. 2002). IP 3 dapat mengikat reseptor membran seperti kanal Ca 2+, melepas Ca 2+ ke dalam sitosol sehingga level Ca 2+ meningkat dan merubah fungsi sel. Cekaman Al menghambat PLC, yang akhirnya akan menghambat PIP 2 menjadi IP 3 sehingga mengganggu Ca 2+ di dalam sel (Jones & Kochian 1995). Protein heterotrimerik-g berperan dalam meregulasi ketahanan terhadap patogen (Blume et al. 2000; Beffa et al. 1995; Legendre et al. 1992) dengan meningkatkan Ca 2+ sistolik dalam sel (Aharon et al. 1998) sehingga mengaktifkan lintasan signal downstream di dalam sel (Zimmerman et al. 1997). Protein G berperan dalam regulasi lintasan biosintesis benzo phenathridine alkaloid (Mahady et al. 1998), dan regulasi kanal K + pada sel mesofil (Fairley-Grenot & Asmann 1991; Li & Asmann 1993). Protein G subunit α terletak di membran plasma. Protein G berinteraksi dengan molekul reseptor yang ada di membran plasma (Fujisawa et al. 2001). Subunit α berperan dalam mengaktifkan kanal Ca 2+ pada plasma membran tanaman tomat (Aharon et al. 1998), meningkatkan level IP 3 pada tanaman kedelai (Legendre et al. 1993), meningkatkan spesies oksigen aktif (AOS) H 2 O 2 pada kultur sel tanaman kedelai (Legendre et al. 1992), dan bertindak sebagai hulu dari GTPase Rac pada sistem pertahanan padi terhadap penyakit blas (Suharsono et al. 2002). Subunit α (RGA1) berperan dalam perkembangan normal ruas batang dan benih padi. Hal ini ditunjukkan oleh mutan Daikoku d1 yang mengalami mutasi pada RGA1 yang menyebabkan ketidaknormalan morfologi tanaman ini yaitu kerdil, benih kecil, dan daun berwarna hijau tua (Fujisawa et al. 1999). Akhir dari jalur transduksi sinyal adalah mengarah ke pengaturan satu atau lebih aktivitas seluler ataupun pengaktifan beberapa gen spesifik untuk menanggapi sinyal dari luar. Terdapat lebih dari 20 jenis gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al dan telah diisolasi dari berbagai spesies tanaman, diantaranya yaitu Arabidopsis thaliana (Richard et al. 1998) dan gandum (Triticum aestivum L.) (Richards et al. 1994). Pada Arabidopsis, gen GST (Gluthatione S-

14 4 Transferase) terekspresi sebagai respon ketahanan terhadap cekaman Al dan cekaman oksidatif (Ezaki et al. 2004). Protein GST tidak hanya terekspresi oleh cekaman Al tetapi juga oleh cekaman lain seperti cekaman garam (Roxas et al. 2000), patogen (Dean et al. 2005), dan cekaman osmotik (Galle et al. 2005). GST merupakan protein yang banyak terlibat dalam menanggapi berbagai cekaman kimia dan termasuk dalam golongan protein yang berhubungan dengan sistem antioksidasi (Ulmasov et al. 1995). Gen GST ada pada setiap tahap perkembangan tanaman dan ada pada setiap jaringan (McGonigle et al. 2000). Pada kedelai, 25 jenis gen GST telah diindentifikasi dan dikelompokan berdasarkan kemiripan sekuennya yaitu GmGSTI, GmGSTII, dan GmGSTIII. GmGSTIII memiliki anggota paling banyak yaitu 20 jenis (GmGST1- GmGST20) dan diekspresikan paling besar yaitu 92%, GmGST8 diekspresikan secara melimpah yaitu sebesar 33% berdasarkan uji Expressed Sequence Taq (EST). GmGSTI mempunyai 4 anggota (GmGST21-GmGST24) diekspresikan sebesar 6%, GmGSTII mempunyai 1 anggota yaitu GmGST25 diekspresikan sebesar 2%. GmGST5, GmGST8, GmGST12 dan GmGST13 terdapat di akar (McGonigle et al. 2000; Droog et al. 1995). Penelitian mengenai ekspresi gen Gα dan GST (GST8 dan GST12) pada tanaman kedelai yang toleran tanah asam dan cekaman Al telah dilakukan oleh Mashuda (2007). Cekaman Al pada kedelai toleran menyebabkan meningkatnya ekspresi gen Gα, gen GST8, dan gen GST12. Ekspresi tertinggi gen Gα dan gen GST12 terjadi pada 8 jam setelah perlakuan dan gen GST8 pada 24 jam setelah perlakuan cekaman 1.6 mm Al. Untuk melihat ekspresi gen Gα dan GST secara lebih jelas, maka perlu untuk mengkaji ekspresi gen-gen ini pada tanaman kedelai yang peka terhadap tanah asam dan cekaman aluminium.

15 5 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari ekspresi gen Gα dan GST pada kedelai kultivar Lumut yang mendapat cekaman Al. Hipotesis Penelitian Ekspresi gen Gα dan GST pada kedelai kultivar Lumut tidak terinduksi oleh cekaman Al.

16 6 TINJAUAN PUSTAKA Pengaruh Cekaman Aluminium Terhadap Tanaman Pada kondisi asam atau ph 4 aluminium di dalam tanah dalam keadaan terlarut dalam bentuk Al 3+ yaitu Al(H 2 O 2 ) Ketika ph meningkat, Al dalam bentuk Al(OH) 2+ dan Al(OH) + 2, dan ketika mendekati ph netral Al dalam bentuk Al(OH) 3. Pada kondisi basa Al dalam bentuk Al(OH) - 4 (Marschner 1995). Aluminium menyebabkan penghambatan dalam penyerapan nutrisi dan mineral sehingga menghambat pertumbuhan akar yaitu menghambat perpanjangan axis akar utama dan lateral sehingga akar menjadi pendek dan menebal (stubby). Ujung akar (tudung akar, meristem, dan zona perpanjangan) mengakumulasi Al lebih banyak, dan mengalami kerusakan fisik lebih parah dibandingkan jaringan akar lainnya (Delhaize & Ryan 1995). Aluminium juga menghambat pembelahan dan pemanjangan sel akibat gangguan sintesis DNA/RNA (Matsumoto 1991). Tanaman mempunyai beberapa mekanisme toleransi terhadap cekaman aluminium (Al) sehingga mampu hidup dalam keadaan mendapat cekaman Al atau lingkungan yang asam (Kochian 1995). Mekanisme toleransi tanaman terhadap aluminium dapat dibagi dua yaitu mekanisme eksternal dan mekanisme internal. Mekanisme eksternal (exclusion mechanism) melalui imobilisasi Al pada dinding sel, induksi ph di daerah rhizosfer atau apoplas akar, permeabilitas selektif membran plasma terhadap Al, eksudasi fosfat dan efflux Al. Mekanisme internal mencakup pengkelatan Al di sitosol oleh asam organik, protein, atau ligan organik lain, mengurung Al di vakuola dan sintesis protein/ enzim yang toleran Al. Pada tanaman tembakau (Nicotiana tobacum L.) ekspresi gen para dan parb diinduksi oleh cekaman Al (Ezaki et al. 1997). Gen pal111 (identik dengan para yang menyandi auksin) dan gen pal142 (identik dengan parb yang menyandi GST) pada tembakau ekspresinya diinduksi oleh aluminium dan defisiensi Pi (Ezaki et al. 1995). Pada Arabidopsis, cekaman Al menginduksi ekspresi beberapa gen yang juga berhubungan dengan sistem pertahanan terhadap patogen (defense-response) seperti gen GST, peroxidase dan blue copper binding protein (Richards et al. 1998). Gen yang diinduksi Al terlihat sama dengan gen

17 7 yang diinduksi oleh cekaman akibat defisiensi fosfat (Ezaki et al. 1995), keracunan metal (Snowden et al. 1995), infeksi patogen (Cruz-Ortega et al. 1997), dan cekaman oksidatif (Richard et al. 1998). Menurut Richard et al. (1998) ekspresi dari gen GST, peroxidase dan blue copper binding protein dipengaruhi oleh aktifitas spesies oksigen aktif (AOS) H 2 O 2 saat tanaman mengalami cekaman. Protein Heterotrimerik-G subunit α Protein heterotrimerik-g adalah protein peripheral membran plasma yang menghadap ke permukaan dalam sel (menghadap ke sitosol). Protein ini merupakan reseptor membran sel dan berfungsi sebagai mediator penyampai pesan/signal dari luar sel (eksternal) ke molekul efektor sehingga menghasilkan respon intraseluler (Fujisawa et al. 2001). Protein heterotrimerik-g terdiri dari subunit α, β, γ (Fujisawa et al. 2001). Protein heterotrimerik-g disebut protein G karena mengikat mononukleotida GDP dan GTP. Subunit α merupakan subunit yang mengatur pertukaran GTP-GDP pada mamalia (Fujisawa et al. 2001). Gα pada tanaman memiliki homologi yang sama dengan mamalia. Ada kemungkinan βγ mempunyai peranan secara langsung dalam meregulasi efektor dan interaksinya dengan reseptor (Ma 1994). Protein G subunit α atau Gα terdapat pada plasma membran (Weiss et al. 1997; Iwasaki et al. 1997). Protein Gα mengaktifkan kanal Ca 2+ pada plasma membran tomat (Aharon et al. 1998), meningkatkan level IP 3 kedelai (Legendre et al. 1993) dan meningkatkan spesies oksigen aktif (AOS) H 2 O 2 pada kultur sel kedelai (Legendre et al. 1992). Berdasarkan analisis mutasi pada gen Gα (dwarf1), maka Gα terlibat pada perpanjangan batang dan pembentukan benih padi (Fujisawa et al. 2001) dan ketahanan terhadap patogen (Suharsono et al. 2002). Protein heterotrimerik-g berperan dalam meregulasi ketahanan terhadap patogen (Aharon et al. 1998; Beffa et al. 1995; Legendre et al. 1993), regulasi lintasan biosintesis benzo phenathridine alkaloid (Mahady et al 1998), dan regulasi kanal K + pada sel mesofil (Fairley-Grenot dan Asmann 1991; Li & Asmann 1993).

18 8 Pada kedelai ada dua kopi gen yang menyandikan protein heterotrimerik- G subunit α yaitu SGA1 (Kim et al. 1995) dan SGA2 (Gotor et al. 1996). SGA1 diisolasi dari akar kedelai kultivar Williams. SGA1 juga telah diisolasi dari kedelai kultivar Lumut dan Slamet, dan memiliki kemiripan 91% dengan SGA1 dari kultivar Williams berdasarkan urutan nukleotidanya (Suharsono & Suharsono 2004). SGA2 diekspresikan pada semua organ vegetatif tanaman. Transkripsi terjadi pada semua jenis sel akar, daun dan batang (Gotor et al. 1996). Gen Gα pada kultivar Slamet terinduksi pada 8 jam setelah perlakuan cekaman aluminium. Kemungkinan setelah 72 jam perlakuan cekaman Al beberapa sel sudah tidak aktif mengekspresikan gen Gα (Mashuda 2007). Saat inaktif subunit α berikatan dengan GDP dan berasosiasi dengan βγ membentuk kompleks. Ketika ligan terikat pada permukaan sel reseptor, reseptor menjadi aktif dan mengkatalisis perubahan ikatan GDP pada subunit α menjadi GTP. Hal tersebut menyebabkan terjadinya perubahan konformasi subunit α sehingga akhirnya berpisah dengan βγ (disosiasi). Subunit α akan meregulasi efektor dengan cara berikatan pada efektor dan mengaktifkan signal transduksi seperti pada adenilat siklase. Protein heterotrimerik-g kembali tidak aktif ketika GTP diubah menjadi GDP dan subunit α kembali berasosiasi dengan βγ (Becker et al. 2000; Ma 1994). Protein heterotrimerik-g meregulasi banyak efektor yang berada di bawahnya (downstream) seperti adenilat siklase, phosphalipasec, dan efektor transducin (Ma 1994). Phosphoinositide spesifik phospholipase C (PLC) menghidrolisis phosphatidyl inositol 4,5-biphosphate (P 1 P 2 ) menjadi 2 second messengers yaitu inositol 1,4,5-triphosphate (IP 3 ) dan diacylglycerol (DAG). IP 3 dapat mengikat reseptor membran seperti kanal Ca 2+, dan melepas Ca 2+ dari retikulum endoplasma ke dalam sitosol sehingga level Ca 2+ meningkat. Protein kinase C akan teraktifkan oleh level Ca 2+ yang meningkat dan DAG. Ion Ca 2+ mengaktifkan protein kalmodulin yang akan mengaktifkan protein kinase dan fosfatase dalam satu atau lebih jalur persinyalan (Becker et al. 2000). Akhir dari transduksi sinyal mengarah ke pengaturan satu atau lebih aktifitas seluler, melalui pengaktifan enzim spesifik maupun sintesis enzim atau protein lain dengan mengaktfikan atau menon-aktifkankan gen-gen spesifik untuk

19 9 memberikan respon terhadap sinyal yang diterima. Gluthathione S-Transferase (GST) merupakan gen yang banyak terlibat dalam menanggapi respon yang disebabkan oleh berbagai cekaman, diantaranya adalah cekaman patogen, cekaman aluminium. GST juga termasuk golongan gen yang berhubungan dengan sistem antioksidasi (Ezaki et al. 2004). Glutathione S-Transferase Tanaman memiliki mekanisme ketahanan yang sangat efektif untuk menghadapi cekaman akibat kerusakan oksidatif (induced oxidative damages). Salah satu protein yang terlibat dalam ketahanan sel terhadap cekaman oksidatif adalah GST (Glutathione S-Transferase). GST adalah protein dengan berat molekul sekitar 50 kda, terdiri dari 2 subunit polipeptida (Dixon et al. 2002). GST mengkatalis pemindahan tripeptida glutathione (γ-glutamyl-cysteinylglycine; GSH) menjadi substrat (R-X) yang mengandung eletropilik reaktif untuk membentuk hasil reaksi S-glutathionylated polar (Dixon et al. 2002). Molekulmolekul yang telah berkonjugasi dengan GSH selanjutnya dikirim ke vakuola melalui ATP-binding transporter. Pengiriman ke vakuola bertujuan untuk membatasi efek dari penghambatan produk akhir GST dan melindung sel dari bahaya lebih lanjut akibat senyawa-senyawa yang berkonjugasi dengan GSH (Rea 1999). GST dikelompokkan berdasarkan identitas sekuennya dan dibagi menjadi phi, tau, tetha, zeta dan lambda. Kelas tetha dan zeta banyak terdapat pada mamalia sedangkan selebihnya terdapat pada tanaman (Dixon et al. 2002). Pada Arabidopsis terdiri atas 48 gen GST dengan kelompok tau dan phi GST paling banyak. Masing-masing terdiri dari 28 kelompok tau, 13 phi, 3 dari kelompok theta, 2 zeta dan 2 lamda (Dixon et al. 2002). Pada jagung terdapat 12 kelompok phi, 28 tau dan 2 zeta sedangkan pada kedelai terdapat 20 gen dari kelompok tau, 1 zeta dan 4 phi (McGonigle et al. 2000). Berdasarkan kesamaan sekuennya, GST tanaman dibagi menjadi 3 tipe yaitu GSTI, GSTII dan GSTIII (Droog et al. 1995). Menurut McGonigle et al. (2000) pada kedelai terdapat 25 sekuen GST (Tabel 1). Pada kedelai ada 4 tipe GSTI, 1 tipe GSTII dan 20 tipe GSTIII. Individual cdna pada kedelai sebanyak

20 10 6% tipe GSTI, 2% cdna tipe GSTII, dan 92% adalah tipe GSTIII. Khusus sekuen GST tipe III yaitu GmGST8 terdapat sebanyak 33%. Struktur GST tanaman memiliki kesamaan yang tinggi dengan struktur GST mamalia. GST ditemukan pada setiap tahap perkembangan tanaman dari awal perkecambahan sampai tua dan terdapat di setiap jaringan tanaman (McGonigle et al. 2000). Tabel 1. GST yang terdapat pada kedelai (McGonigle et al. 2000) Tipe Nama No akses Tipe 1 GST Tipe II GST Tipe III GST GmGST 21 GmGST 22 GmGST 23 GmGST 24 GmGST 25 GH2/4 (Gmhsp26-A atau GmGST 1) GmGST2 GmGST3 GST a (GmGST 4) GmGST 5 GmGST 6 GmGST 7 GmGST 8 GmGST 9 GmGST 10 GmGST 11 GmGST 12 GmGST 13 GmGST 14 GmGST 15 GmGST 16 GmGST 17 GmGST 18 GmGST 19 GmGST 20 AF AF AF AF AF J03197, M20363 Y10820 X68819 AF AF AF AF AF AF AF AF AF AF AF AF AF AF AF AF AF Ekspresi gen GST8 pada akar kultivar Slamet diinduksi oleh cekaman Al yaitu pada 8 jam dan 24 jam setelah perlakuan cekaman Al. GST8 tidak terekspresi setelah 48 jam perlakuan cekaman Al. Lamanya perlakuan tidak menyebabkan meningkatnya ekspresi GST8 tetapi menurunkan ekspresi GST8. Ini menunjukkan bahwa pada kultivar Slamet gen GST8 memberi respon terhadap cekaman Al di awal (Mashuda 2007). Sedangkan ekspresi gen GST12 pada akar kultivar Slamet terinduksi oleh cekaman ph rendah dan cekaman Al. Gen GST12

21 11 memperlihatkan ekspresi tertinggi pada 8 jam setelah perlakuan cekaman Al. Kemudian seiring lamanya waktu cekaman menyebabkan penurunan ekspresi gen GST12 (Mashuda 2007). Pola ekspresi ini menunjukkan bahwa ada keterlibatan gen GST12 terhadap cekaman Al. Aktivitas gen GST akan meningkat sebagai respon rangsangan adanya kerusakan oksidatif (Marrs 1996; Droog 1997). Gen GST diinduksi oleh berbagai rangsangan dari lingkungan meliputi serangan jamur, cekaman dehidrasi, etilen, pelukaan (wounding) (Marrs 1996). Aktifitas gen GST meningkat akibat pemanasan dan kondisi cekaman garam pada benih transgenik tembakau (Roxas et al. 1997). Aktivitas GST di akar meningkat lebih tajam dibanding di batang pada Triticum aestivum akibat cekaman osmotik (Galle et al. 2005). Auksin, hormon-hormon, logam berat, H 2 O 2, garam, suhu (heat shock), cekaman lingkungan telah menginduksi promotor GH2/4 yang menyandi GST pada tembakau transgenik (Ulmasov et al. 1995). Gen GST berperan dalam detoksifikasi dan proteksi sel dari cekaman oksidatif, melindungi dari cekaman biotik dan abiotik meliputi serangan patogen, xenobiotik dan racun logam berat yang merupakan respon tanaman terhadap perubahan kondisi lingkungan (Ulmasov et al. 1995; Droog et al. 1993; Marrs 1996).

22 12 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan dari bulan April 2006 sampai dengan bulan April Penelitian dilakukan di rumah kaca, laboratorium Biologi Molekuler Seluler Tanaman, dan laboratorium BIORIN, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB. Bahan dan Alat Bahan tanaman yang digunakan adalah kedelai kultivar Lumut yang peka terhadap cekaman Al (Anwar et al. 2000). Cekaman dilakukan pada kultur cair dengan menggunakan media kultur menurut Sopandie et al. (1996) yang dimodifikasi Anwar (1999). RNA diisolasi menggunakan kit Trizol (Invitrogen). Primer Gα didesain dari kedelai, yaitu SGAI (nomor aksesi L27418) dengan primer forward (F) terletak pada 111 nukleotida sebelum kodon awal (5 GCTTCACACTTCACACTTAACACT3 ) dan primer reverse (R) terletak pada 114 nukleotida sesudah kodon akhir (5 ATATTGTTGTATACCTGACCTC3 ). Ekspresi gen GST dideteksi dengan menggunakan dua primer yaitu GST8 (nomor aksesi AF243363) dan GST12 (nomor aksesi AF243367). Primer F GST8 terletak pada 11 nukleotida sebelum kodon awal (5 ATAGTGCTGCAATGGCTTCA3 ) dan primer R terletak pada 16 nukleotida sebelum kodon akhir (5 AGATGTGGTGTGTGACTTAG3 ). Primer F gen GST12 terletak pada 2 nukleotida sebelum kodon awal (5 CCATAGCAATGGCAGAGCAAG3 ) dan primer R terletak pada 34 nukleotida sebelum kodon akhir (5 TATATATCATTCTGTGGCAG3 ). Sebagai kontrol untuk mengetahui kemurnian cdna dari kontaminasi DNA genom digunakan primer β-aktin yang didesain dari kedelai (nomor aksesi V00450) dengan primer F tepat pada kodon awal dari ekson 1 (5 ATGGCAGATGCCGAGGATAT3 ) dan primer R tepat pada daerah ekson 2 (5 CAGTTGTGCGACCACTTGCA3 ). Alat utama yang digunakan untuk kultur cair adalah tray, bak, selang, aerator, tong, gelas ukur. Alat untuk isolasi RNA dan PCR adalah sentrifugasi, pipet mikro, Digi doc-it, kamera, alat elektroforesis, mesin PCR (MJ Research).

23 13 Metode Penelitian Analisis ekspresi gen Gα dan GST dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu: (1) Penentuan konsentrasi Al untuk perlakuan cekaman, (2) Isolasi RNA total, (3) Sintesis cdna total, dan (4) Analisis ekspresi gen Gα, GST8 dan GST12, seperti pada Gambar 1. Penentuan konsentrasi Al untuk perlakuan cekaman Isolasi RNA Total Sintesis cdna Total Analisis ekspresi gen Gα, gen GST8, dan GST12 Gambar 1. Tahapan yang dilakukan dalam analisis ekspresi gen Gα dan GST (1) Penentuan Konsentrasi Al untuk perlakuan cekaman Penentuan konsentrasi Al untuk perlakuan cekaman Al dilakukan dengan kultur kecambah di lartan hara. Langkah awal dari perlakuan cekaman Al adalah menyeleksi biji kedelai kultivar Lumut yang memiliki ukuran yang sama. Benih yang terpilih dikecambahkan selama dua hari. Benih dikecambahkan dalam kertas merang, disimpan dalam ruang gelap dengan kelembaban yang tinggi. Setelah berkecambah, kecambah dipindahkan ke dalam larutan hara dengan dosis 1/5 dari yang digunakan Sopandie et al. (1996) dengan ph 6 selama 2 hari. Kecambah ditanam di atas tray ukuran 20 cm x 30 cm yang telah dilubangi agar akar dapat masuk. Tray tersebut diletakan di dalam bak plastik ukuran 25 cm x 35 cm x 15 cm yang telah berisi larutan hara ph 6 sebagai media tanamnya. Untuk menjaga ketersediaan oksigen media cair diberi aerasi 4 lubang tiap bak. Posisi tray diatur sedemikian rupa sehingga akar menyentuh media cair. Komposisi media tanam adalah mm Ca(NO 3 ) 2.4H 2 O, 0.2 μm CuSO 4.5H 2 O, 0.25 mm NH 4 NO 3, 1 μm ZnSO 4.7H 2 O, 0.1 mm MgSO 4.7H 2 O, 5 μm H 3 BO 3, 0.1 mm KH 2 PO 4, 1 μm (NH 4 ) 6. Mo 7 O 24.4H 2 O, 5 μm MnSO 4.H 2 O, 5 μm Fe-EDTA.

24 14 Tahapan pada hari berikutnya adalah pemberian perlakuan ph dan cekaman. Perlakuan cekaman yang diberikan adalah ph 4, ph mm Al dan ph mm Al. Perlakuan akan Al diberikan dalam bentuk AlCl 3. Media ph 6 digunakan sebagai kontrol. Perlakuan dilakukan selama 3 x 24 jam, dengan media diganti setiap 24 jam. Pengamatan panjang akar utama dilakukan pada jam ke-0, jam ke-8, jam ke-24, jam ke-48 dan jam ke-72. Pengamatan dilakukan terhadap 10 sampel tanaman yang diambil secara acak, dengan mengukur panjang akar dari pangkal batang sampai dengan ujung akar. Percobaan dilakukan dengan dua ulangan. Pada saat pengamatan, ujung akar utama sekitar 0.3 cm diambil, dibungkus dengan aluminium foil lalu difiksasi di dalam nitrogen cair dan disimpan di freezer suhu - 40 C. Pemilihan konsentrasi Al dan lama cekaman yang optimum untuk menghambat pertumbuhan akar ditentukan berdasarkan persentase perpanjangan akar (delta) pada setiap jam perlakuan. Konsentrasi Al dan ph serta lama cekaman yang menghambat pertumbuhan akar digunakan untuk analisis ekspresi gen Gα dan gen GST. Reduksi atau stimulasi perpanjangan akar dihitung berdasarkan nilai perbandingan pertambahan panjang akar dari perlakuan terhadap pertambahan panjang akar dari kontrol dan merupakan nilai rataan dari dua ulangan yang masing-masing terdiri dari 10 tanaman. Kontrol untuk percobaan perlakuan cekaman Al dan ph adalah tanaman yang ditumbuhkan pada ph 4 sehingga reduksi perpanjangan akar dihitung dengan rumus: RPA = (Yti Yto) (Xti Xto) (Yti Yto) atau RPA = PPAy PPAx PPAy Dimana; RPA :Reduksi panjang akar Yti :Panjang akar dari tanaman kontrol ph 4 pada waktu ti Yto :Panjang akar dari tanaman kontrol ph 4 pada waktu to Xti :Panjang akar dari tanaman yang diperlakukan pada ph 6, ph mm Al, ph mm Al pada waktu ti

25 15 Xto :Panjang akar dari tanaman yang diperlakukan pada ph 6, ph mm Al, ph mm Al pada waktu to PPAy :Pertambahan perpanjangan akar tanaman kontrol ph 4 PPAx :Pertambahan perpanjangan akar tanaman perlakuan x Nilai RPA positif menunjukkan bahwa perlakuan menyebabkan reduksi pertambahan panjang akar bila dibandingkan dengan kontrol, yaitu tanaman yang ditumbuhkan pada ph 4. Nilai RPA negatif menunjukkan bahwa perlakuan menyebabkan stimulasi pertambahan panjang akar dibandingkan dengan kontrol. (2) Isolasi RNA dengan Metode Trizol Sebanyak mg ujung akar kedelai yang telah tersimpan dalam aluminum foil di dalam freezer, diberi nitrogen cair langsung digerus dengan menggunakan mortar sampai halus berbentuk bubuk. Bubuk dicampur dengan 800 μl Trizol (Invitrogen). Suspensi sel dipindahkan ke dalam ependorf, dan diinkubasikan pada suhu ruang selama kurang lebih 5 menit. Ke dalam ependorf tersebut, kloroform (200 μl) dimasukkan dan suspensi sel divortex sampai tercampur. Campuran diinkubasikan pada suhu ruang selama 3 menit. Selanjutnya ependorf tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 9000 rpm (Jouan BR4i) dengan suhu 6 C selama 15 menit. Cairan bagian atas diambil sebanyak minimal 60% dari volume Trizol. Supernatan tersebut dipindahkan ke dalam ependorf baru, dan ditambah dengan isopropil alkohol lalu diinkubasikan dalam suhu ruang selama 10 menit. Setelah itu ependorf tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 9000 rpm selama 10 menit dengan suhu 6 C. Supernatan dari hasil sentrifugasi dibuang, dan endapannya diambil, kemudian ditambah dengan etanol 75%. Ependorf kembali disentrifugasi dengan kecepatan 5700 rpm selama 5 menit dengan suhu 6 C. Etanol 75% dibuang, endapan dikeringkan dengan menggunakan vakum. Setelah kering endapan disuspensikan dalam 30 μl H 2 O-DEPC 0.1%. Kuantitas RNA total dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer, absorbansi diukur pada panjang gelombang 260 (λ 260 ), dan 280 (λ 280 ). Keutuhan RNA total dianalisis secara kualitatif menggunakan metode elektroforesis, dengan memigrasikan RNA pada gel agarosa di dalam bufer MOPS 1% (4,2 g/l 3-

26 16 Morpholinopropanesulfonic acid (C 7 H 15 NO 4 ), 0,41 g/l Na-asetat, 0.37 g/l Na 2 EDTA.H 2 O). (3) Analisis ekspresi gen Gα dan gen GST Analisis ekspresi gen dilakukan dengan menggunakan RT-PCR (Reverse Transcript PCR). Karena mrna mudah terdegradasi, maka mrna diubah menjadi cdna. Keberhasilan sintesis cdna dan kemurniannya dianalisis dengan primer spesifik β-aktin. Sintesis cdna Total Sintesis cdna total melalui transkripsi balik (RT) dilakukan dengan metode Suharsono et al. (2002). Sebanyak 500 ng RNA total dicampur dengan 4 μl buffer (5x), 2 μl 2 mm dntp mix, 2 μl 0.1 M dtt, 2 μl primer oligo(dt), 0.2 μl 0.1 U enzim reverse transcriptase (RT), dan H 2 O-DEPC hingga volume akhir reaksi 20 μl. Kondisi RT adalah 10 menit suhu 30 C, 50 menit suhu 42 C, 5 menit suhu 95 C. Evaluasi keberhasilan sintesis cdna total dilakukan melalui PCR dengan menggunakan primer β-aktin. PCR β-aktin dilakukan dengan mencampur 2 μl cdna total, 2 μl buffer (10x), 1 μl 2 mm dntpmix, 0.8 μl 25 mm MgCl, 0.1 μl 0.1 U enzim taq polimerase, 2 μl 10 pmol primer forward (F), 2 μl 10 pmol primer reverse (R), digenapkan dengan ddh 2 O hingga 20 μl. Kondisi PCR adalah pra-pcr 95 C 5 menit, denaturasi 94 C 30 detik, annealing 56 C 30 detik, ekstensi 72 C 2 menit, siklus diulangi 30 kali, dan pasca-pcr 72 C 5 menit. Apabila cdna yang disintesis adalah murni yang tidak terkontaminasi DNA genom, maka PCR menghasilkan amplifikasi berukuran 450 pb. Apabila terkontaminsi DNA genom, maka produk hasil PCR berukuran 540 pb karena cetakan DNA genom yang diamplifikasi meliputi daerah ekson 1, intron dan ekson 2. Selain untuk melihat keberhasilan sintesis cdna dan kemurnian cdna dari kontaminan DNA genom, PCR β-aktin juga digunakan untuk menyetarakan konsentrasi cdna pada berbagai perlakuan. Untuk mengetahui ukuran PCR β- aktin, dilakukan elektroforesis pada gel agarosa di dalam bufer elektroda TAE 1x (0.04 M Tris-acetate, M EDTA).

27 17 Analisis ekspresi gen Gα dan gen GST Analisis ekspresi gen Gα dan gen GST (GST8 dan GST12) dilakukan dengan cara mengamplifikasi gen spesifik tersebut dengan menggunakan cdna sebagai cetakannya. Langkah dalam mencampur bahan untuk PCR gen Gα dan gen GST sama dengan langkah PCR aktin kecuali primer yang disesuaikan dengan gen yang dianalisis. Kondisi PCR gen Gα adalah pra-pcr 95 C 5 menit, denaturasi 94 C 30 detik, penempelan primer 56 C 30 detik, ekstensi 72 C 2 menit, siklus diulang sebanyak 30 kali, dan pasca-pcr 72 C 5 menit. Kondisi PCR gen GST (GST8 dan GST12) sama dengan gen Gα, hanya suhu penempelan primernya dilakukan pada suhu 52 C 30 detik. Analisis ekspresi dilakukan dengan membandingkan intensitas cahaya pita hasil PCR gen Gα dan GST terhadap kontrol β-aktin dengan menggunakan perangkat lunak Digi Doc-it. Agar dapat diperbandingkan ekspresi antar gen sasaran pada waktu yang sama pada berbagai perlakuan, maka ekspresi gen sasaran harus dibakukan. Pembakuan ekspresi gen sasaran dilakukan dengan membandingkan ekspresi gen sasaran dengan gen aktin pada waktu dan perlakuan yang sama. Ekspresi gen yang dibakukan merupakan nilai rataan dari dua ulangan. Oleh sebab itu ekspresi gen sasaran Gα, gen GST 8 atau gen GST12 dibakukan dengan menggunakan rumus : EBXpt = IXpt IApt Dimana; EBXpt: Ekspresi baku gen x pada perlakuan p waktu t IXpt : Intensitas hasil PCR gen x pada perlakuan p waktu t IApt : Intensitas hasil PCR β-aktin pada perlakuan p waktu t X : Gα, GST8 atau GST12 A : Aktin t : 0, 8, 24, 48, atau 72 jam perlakuan cekaman

28 18 HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan Konsentrasi Cekaman Aluminium Akar kedelai kultivar Lumut yang ditumbuhkan pada ph 6 memperlihatkan pertambahan panjang akar yang lebih besar yaitu sekitar 83%- 95% dibandingkan pada kontrol ph 4 (Tabel 2). Rendahnya pertambahan panjang akar pada ph 4 dibandingkan ph 6 menunjukkan bahwa pertumbuhan akar dihambat oleh ph 4. Menurut Ismail dan Effendi (1993) ph yang paling baik untuk pertumbuhan kedelai adalah ph 6.8, namun pada ph sudah dianggap cukup baik. Tabel 2. Reduksi perpanjangan akar ph 6, ph mm Al, ph mm Al dibandingkan dengan ph 4. Reduksi perpanjangan akar dibandingkan dengan ph 4 Lama cekaman PPA (cm) ph 4 ph 6 ph mm Al ph mm Al RPA (%) PPA (cm) RPA (%) PPA (cm) RPA (%) PPA (cm) RPA (%) 8 jam jam jam jam Keterangan PPA : Pertambahan panjang akar (rata-rata 2 ulangan) RPA : Reduksi panjang akar Perlakuan ph mm Al dan ph mm Al, mengakibatkan reduksi perpanjangan akar (RPA) kedelai sekitar 70%-88% (Tabel 2) dibandingkan dengan kontrol ph 4. Hal tersebut dikarenakan cekaman Al pada tanaman mengakibatkan pertumbuhan akar terhambat, akar menjadi pendek dan menebal khususnya pada akar utama (Ryan et al. 1993). Persentase reduksi ini lebih besar dibanding dengan Anwar (1999) yaitu hanya sekitar 60%. Pada kedelai sensitif, cekaman Al menyebabkan penghambatan panjang akar yang signifikan (Lazof et al. 1994). Menurut Anwar (1999) kedelai kultivar Lumut termasuk kedelai peka karena telah terjadi RPA sebesar 50% pada cekaman Al 0.8 mm. Cekaman 1.6 mm Al menyebabkan RPA lebih tinggi

29 19 dibandingkan dengan cekaman 1.2 mm Al (Tabel 2). Setelah 8 jam perlakuan, cekaman Al baik pada konsentrasi 1.2 mm Al maupun 1.6 mm Al menyebabkan reduksi panjang akar sebesar 79% (Tabel 2). Setelah jam ke-24, ke-48, dan ke-72, perlakuan 1.6 mm Al menyebabkan reduksi panjang akar sekitar 79%-88%, lebih tinggi dari pada perlakuan cekaman 1.2 mm Al yaitu sekitar 70%-80% (Tabel 2). Hasil penelitian Anwar (1999) menunjukkan bahwa kedua konsentrasi cekaman tersebut tidak begitu berbeda, hanya berbeda 1%. Pada kedelai yang toleran yaitu kultivar Slamet, RPA sekitar 76%-78% terjadi pada tanaman yang mendapat cekaman 1.2 mm Al dan sekitar 79%-89% pada tanaman yang mendapat cekaman 1.6 mm Al (Tabel 3). Tabel 3. Reduksi perpanjangan akar pada kultivar Slamet (Mashuda 2007) Reduksi perpanjangan akar dibandingkan dengan ph 4 Lama cekaman PPA (cm) ph 4 ph 6 ph mm Al ph mm Al RPA (%) PPA (cm) RPA (%) PPA (cm) RPA (%) PPA (cm) RPA (%) 8 jam jam jam jam Keterangan PPA : Pertambahan panjang akar (rata-rata 2 ulangan) RPA : Reduksi panjang akar Nilai RPA pada perlakuan dan waktu perlakuan yang sama yang dimiliki kultivar Lumut (Tabel 2) tidak jauh berbeda dengan kultivar Slamet (Tabel 3). Ini menunjukkan bahwa respon fisik kultivar peka (Lumut) dan yang toleran (Slamet) terhadap cekaman Al yaitu berupa penghambatan pertumbuhan akar tidak jauh berbeda. Hal ini diduga diakibatkan pemberian cekaman aluminium yang terlalu tinggi Agar pengaruh cekaman memberikan hasil yang nyata, maka respon tanaman yang mengalami cekaman harus menampakkan perbedaan yang cukup jelas. Berdasarkan hasil yang didapat, dari cekaman 1.6 mm Al menghasilkan reduksi perpanjangan akar (RPA) yang lebih tinggi dibandingkan pada cekaman

30 mm Al, sehingga analisis ekspresi gen pada tahap berikutnya hanya menggunakan cekaman Al pada konsentrasi 1.6 mm Al. Isolasi RNA Total RNA total telah berhasil diisolasi dari akar pada perlakuan ph 6, ph 4 dan ph mm Al dengan lama perlakuan 0 jam, 8 jam, 24 jam, 48 jam dan 72 jam. RNA total diisolasi dengan menggunakan kit Trizol, kemudian hasil isolasi RNA total tersebut dianalisis keutuhan dan konsentrasinya. Keutuhan RNA total dianalisis dengan metode elektroforesis. Konsentrasi RNA total dianalisis dengan spektrofotometer. Analisis keutuhan RNA menunjukkan bahwa mrna, rrna dan trna hasil isolasi adalah baik dan tidak terdegredasi yang ditunjukkan oleh adanya dua pita rrna yang berukuran 28s dan 18s (Gambar 2). ph 6 ph 4 ph mm Al 0J 8J 24J 48J 72J 8J 24J 48J 72J 8J 24J 48J 72J 28 s 18 s Gambar 2. RNA total akar kedelai kultivar Lumut pada perlakuan ph 6, ph 4 dan ph mm Al. Sintesis cdna Total cdna total telah berhasil disintesis berdasarkan RNA total sebagai cetakannya. Hanya mrna dari RNA total yang disintesis menjadi cdna karena oligo(dt) yang digunakan sebagai primer dalam sintesis cdna hanya menempel pada ekor polia yang dimiliki oleh mrna. Untuk mengetahui keberhasilan sintesis cdna dan juga kualitas RNA maka dilakukan pengecekan melalui PCR menggunakan cdna total sebagai cetakannya dan primer untuk β-aktin. PCR dengan primer β-aktin dan cetakan cdna total menghasilkan pita amplifikasi DNA berukuran 450 pb (Gambar 3). Ini menunjukkan bahwa cdna yang digunakan sebagai cetakan adalah murni yang tidak terkontaminasi DNA genom atau RNA total yang telah diisolasi tidak terkontaminasi dengan DNA. Bagian RNA total yang dijadikan sintesis cdna adalah mrna, dimana mrna merupakan hasil transkripsi dari DNA yang telah

31 21 mengalami pemrosesan sehingga hanya mengandung ekson tanpa intron. DNA genom masih mengandung intron dan ekson. Primer reverse dan forward β-aktin terletak di daerah ekson 1 dan ekson 2 yang mengapit intron. PCR aktin dengan cetakan cdna murni hanya akan mengamplifikasi daerah ekson 1 dan ekson 2 tanpa intron sehingga pitanya berukuran 450 pb. 450 pb ph 6 ph 4 ph mm Al 0J 8J 24J 48J 72J 8J 24J 48 J 72J 8J 24J 48J 72J Gambar 3. Hasil PCR β-aktin yang berasal dari cetakan cdna murni. Hasil PCR β-aktin yang cetakan cdna-nya berasal dari RNA total yang terkontaminasi DNA akan terlihat adanya dua pita yang berukuran 450 pb dan 550 pb (Gambar 4). Ukuran 550 pb ini disebabkan oleh adanya intron pada DNA yang berukuran 90 pb yang terapit ekson 1 dan ekson 2 yang ikut teramplifikasi. Untuk melakukan analisis ekspresi gen Gα dan GST hanya menggunakan cdna murni tanpa kontaminasi DNA (Gambar 3) pb 450 pb Gambar 4. Hasil PCR β-aktin yang cdnanya terkontaminasi DNA genom (1), dan cdna murni (2). Analisis Ekspresi Gen Gα Ekspresi gen Gα pada perlakuan ph 4 lebih rendah dibandingkan ph 6 pada jam ke-8, dan ekspresi perlakuan ph mm Al lebih rendah dibandingkan ph 4 pada jam yang sama (Tabel 4). Hal ini menunjukkan bahwa pada awal perlakuan baik cekaman ph rendah maupun cekaman Al tidak menginduksi ekspresi gen Gα. Pada ph 4 jam ke-24 ekspresi gen Gα sedikit lebih tinggi dibandingkan ph 6 tetapi kemudian pada jam ke-48, ekspresi gen Gα menurun, dan nilai ekspresi baku Gα tetap pada jam ke-72 (Tabel 4). Nilai

32 22 ekspresi baku gen Gα (Tabel 4) dan pita hasil PCR (Gambar 5) tidak menunjukkan banyak perbedaan antara ph 6 dan ph 4, yang menunjukkan bahwa perlakuan cekaman ph rendah (ph 4) tidak menginduksi ekspresi gen Gα. Pada jam ke-24, ekspresi gen Gα dari tanaman yang mendapatkan cekaman ph mm Al lebih tinggi daripada cekaman ph 4. Kemudian pada jam ke-48 perlakuan cekaman ph mm Al menunjukkan ekspresi Gα yang lebih rendah dibandingkan ph 4 dan pada jam ke-72 perlakuan ph mm Al menyebabkan ekspresi Gα meningkat kembali dan lebih tinggi daripada perlakuan ph 4 (Tabel 4). Hal tersebut menunjukkan bahwa ekspresi gen Gα pada kedelai Lumut yang mendapat perlakuan ph mm Al tidak memiliki pola yang jelas. Nilai ekspresi baku gen Gα (Tabel 4) dan pita hasil PCR (Gambar 5) tidak menunjukkan banyak perbedaan antara ph 4 dan ph mm Al yang menunjukkan bahwa cekaman Al tidak menginduksi gen Gα. Tabel 4. Ekspresi baku gen Gα pada ph 4 dan ph mm Al Lama Ekspresi gen Gα perlakuan ph 6 ph 4 ph mm Al IApt IXpt EBX %EBX IApt IXpt EBX % EBX IApt IXpt EBX % EBX 8 jam jam jam jam Keterangan Iapt : Intensitas aktin pada perlakuan ke-p dan waktu ke-t (rata-rata 2 ulangan) Ixpt : Intensitas Gα pada perlakuan ke-p dan waktu ke-t (rata-rata 2 ulangan) EBX : Ekspresi Baku gen Gα %EBX : Ekspresi baku gen Gα dibandingkan dengan kontrol ph 6 Intensitas pita ph 6, ph 4 maupun ph mm Al yang dihasilkan tidak begitu berbeda (Gambar 5). Ini menunjukkan bahwa ekspresi gen Gα pada ph 6 tidak jauh berbeda dengan ekspresi perlakuan ph 4 maupun ph mm Al. Gen Gα tidak terinduksi baik oleh cekaman ph rendah yaitu ph 4 maupun cekaman Al yaitu ph mm Al. Diduga gen Gα pada kultivar Lumut adalah gen konstitutif atau bersifat housekeeping gene. Housekeeping gene diekspresikan secara terus menerus, sehingga produk di dalam sel tidak berubah/konstan dan diperlukan setiap saat, yang tidak

33 23 tergantung dari lingkungan dan terdapat di semua sel meski terekpresikan pada level rendah. Mengacu pada sifat housekeeping gene, gen Gα diduga tidak berhubungan dengan sistem toleransi terhadap cekaman Al pada kultivar Lumut yang peka terhadap cekaman Al. Gα 1380 pb ph 6 ph 4 ph mm Al 0J 8J 24J 48 J 72 J 8J 24J 48J 72J 8J 24J 48J 72J β-aktin 450 pb Gambar 5. Ekspresi gen Gα dan β-aktin pada ph 6, ph 4, dan ph mm Al. Pada kultivar Slamet perlakuan ph 4 dan ph mm Al memperlihatkan ekspresi tertinggi pada jam ke-8, kemudian setelah jam ke-8 ekspresinya cenderung menurun (Tabel 5). Gen Gα pada kultivar Slamet terinduksi oleh cekaman ph rendah dan cekaman Al (Mashuda 2007). Gen Gα pada kultivar Slamet merupakan regulated gene atau gen teregulasi/terkendali dimana ekpresi gen tergantung pada keadaan lingkungan. Meningkatnya ekspresi gen Gα diduga berkaitan dengan metabolisme sistem pertahanan tanaman terhadap cekaman aluminium pada kultivar Slamet yang toleran cekaman Al. Tabel 5. Ekspresi baku gen Gα dan β-aktin pada kultivar Slamet (Mashuda 2007) Lama Ekspresi gen Gα perlakuan ph 6 ph 4 ph mm Al IApt IXpt EBX %EBX IApt IXpt EBX % EBX IApt IXpt EBX % EBX 8 jam jam jam jam Keterangan Iapt : Intensitas aktin pada perlakuan ke-p dan waktu ke-t (rata-rata 2 ulangan) Ixpt : Intensitas Gα pada perlakuan ke-p dan waktu ke-t (rata-rata 2 ulangan) EBX : Ekspresi Baku gen Gα %EBX : Ekspresi baku gen Gα dibandingkan dengan kontrol ph 6 Kemungkinan ekspresi gen Gα dapat terinduksi Al dengan cekaman yang lebih singkat, misalnya 4 jam perlakuan atau pada konsentrasi Al yang lebih

34 24 rendah. Tistama (2003) mendapatkan hasil bahwa ekspresi tertinggi gen gmali50 terjadi pada dosis Al yang lebih rendah yaitu 0.2 mm Al pada kultivar peka (Lumut) daripada kultivar toleran (Slamet) yang terjadi pada dosis 0.4 mm Al. Analisis Ekspresi gen GST8 Pada kultivar Lumut tidak ada satupun pita hasil PCR gen GST8 yang terdeteksi. Ini berarti bahwa ekspresi gen GST8 baik itu pada ph 6, ph 4 maupun ph mm Al tidak ada atau diduga tidak terdeteksi karena kuantitasnya yang sangat rendah. Hal ini diduga disebabkan tidak adanya aktivitas gen GST8 di bagian akar (Gambar 6). Menurut McGonigle et al. (2000) GST8 pada kedelai banyak berperan dalam menghadapi degradasi akibat cekaman xenobiotik. Kemungkinan tidak adanya ekspresi gen GST8 berkaitan dengan tidak atau kurangnya sistem pertahanan yang dimiliki kultivar Lumut yang peka terhadap cekaman Al. GST8 710 pb β-aktin 450 pb Slamet (A) Lumut Gα GST8 β-aktin (B) Lumut 1 2 Gambar 6. (A) Pada ph 6 jam ke-0, tidak ada ekspresi gen GST8 pada kultivar Lumut (peka) dan ada ekspresi pada kultivar Slamet (toleran), (B) Tidak ada ekspresi gen GST8 pada kultivar Lumut pada ph 6 (1) dan ph mm Al (2) Pada kultivar Slamet gen GST8 terekspresi di awal setelah pemberian cekaman Al yaitu pada jam ke-8 dan jam ke-24. Gen GST8 tidak terekspresi pada jam ke-48 dan jam ke-72 setelah perlakuan cekaman Al (Tabel 6). Hal ini menunjukkan bahwa lamanya perlakuan cekaman Al pada kultivar Slamet tidak menyebabkan meningkatnya ekspresi tetapi menurunkan ekspresi GST8. Pada kedelai kultivar Slamet yang toleran terhadap Al ekspresi gen GST8 tidak terinduksi oleh cekaman ph 4.