Pengaruh Berbagai Faktor Eksternal terhadap Stabilitas Pigmen Bixin dari Selaput Biji Kesumba (Bixa orellana L.)

Transkripsi

1 81 Pengaruh Berbagai Faktor Eksternal terhadap Stabilitas Pigmen Bixin dari Selaput Biji Kesumba (Bixa orellana L.) Potensi sebagai Pewarna Alami Makanan Effect of Many External Factor on Bixin Pigment from Annatto (Bixa orellana L.) Seed Coats Potency as Natural Food Colorant Suparmi 1, Leenawaty Limantara 2, Budhi Prasetya 3 ABSTRACT Background. Bixin is an orange-yellow carotenoid derived from the outer seed coats of annatto (Bixa orellana L.), which are of interest as natural colorant in food. However, the use of this colorant in food products may face some problems due to its stability during storage. The characterization of bixin on temperature, ph, light, and oxidator-reductor was investigated to determine its stability. Design and Method: The spectra absorption was analyzed by UV-Vis spectroscopy. Result: Bixin in acetone solution was stable at 4 ºC, 25 ºC, 37 ºC, and 50 ºC with daily degradation rate of 0.52%; 0.85%; 3.58%; and 10.22% respectively. The bixin was stable at dark condition, while the effect of UV light for 12 hours caused pigment degradation rate of almost 100%. Exposure to polychromatic light for 7 days caused bixin degradation with daily rate of 14.39%. The bixin was stable at ph 4 and its degradation rate was increased at ph 3 and 5. It was stable on addition of oxidator (H 2 30%) and reductor (ascorbic acid). Conclusion: Bixin is stable on temperature, ph, light, and oxidator-reductor. It is potential as natural colorant in dairy and fat-based food products such as yogurt, (Sains Medika, 1 (1) : 81-91). Keywords: Bixa orellana L., bixin, food colorant, stability ABSTRAK Pendahuluan: Bixin merupakan pigmen karotenoid pada selaput biji kesumba keling (Bixa orellana L.) dengan kisaran warna kuning-orange. Pigmen ini berpotensi sebagai pewarna alami makanan. Permasalahan utama dalam penggunaan pigmen sebagai pewarna alami makanan adalah menjaga stabilitas warna pigmen selama pengolahan dan penyimpanan makanan, sehingga tidak terjadi degradasi warna. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui stabilitas bixin pada berbagai suhu, cahaya, ph, dan oksidator-reduktor. Metode:Stabilitas bixin setelah perlakuan dengan waktu tertentu diamati berdasarkan spektrum absorbansi yang ditampilkan pada spektrofotometer. Hasil: Bixin bersifat stabil pada berbagai penyimpanan dengan kondisi 4 C, 25 C, 37 C, dan 50 C dengan rasio degradasi per hari pada masing-masing suhu sebesar 0,52%; 0,85%; 3,58%; dan 10,22%. Bixin lebih stabil pada kondisi gelap, sedangkan pengaruh cahaya UV selama 12 jam menyebabkan degradasi hampir 100%. Irradiasi cahaya polikromatik selama 7 hari menyebabkan degradasi per hari sebesar 14,39%. Bixin memiliki kecenderungan lebih stabil pada ph 4 dan mengalami peningkatan degradasi pada ph 3 dan ph 5. Bixin bersifat relatif stabil terhadap pengaruh penambahan oksidator H 2 30% dan reduktor asam askorbat. Hasil uji organoleptik dengan parameter utama warna menunjukkan bahwa serbuk pewarna bixin yang disukai panelis adalah pada konsentrasi 5%. Kesimpulan: Bixin bersifat stabil terhadap berbagai kondisi suhu, cahaya, ph, dan oskidator-reduktor, sehingga berpotensi sebagai pewarna alami makanan yang menyehatkan, (Sains Medika, 1 (1) : 81-91). Kata kunci: Bixa orellana L., bixin, pewarna alami makanan, stabilitas Bagian Biologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung Semarang, (amik_achsy@yahoo.com) Ma Chung Research Center Universitas Ma Chung Malang Fakultas Biologi Universitas Kristen Satya Wacana Salatiga

2 82 Sains Medika, Vol. 1, No. 1, Januari Juni 2009 PENDAHULUAN Kesumba keling (Bixa orellana L.) merupakan salah satu jenis tanaman yang telah lama dikenal dan digunakan oleh sebagian besar masyarakat Indonesia untuk pengobatan dan kesehatan. Seluruh bagian tanaman Bixa orellana termasuk daun, biji, bunga, buah, dan akar telah dimanfaatkan sebagai ramuan obat tradisional. Tanaman ini biasanya tumbuh liar di hutan dan seringkali ditanam di taman-taman atau di tepi jalan sebagai tanaman hias karena bunga dan buahnya menarik serta daunnya yang rimbun dan padat (Sutarno, 2001). Dibalik perannya sebagai tanaman hias, B. orellana L. memiliki peran eksotis yaitu sebagai bahan pewarna alami, bahkan akhir-akhir ini B. orellana L. ( annatto, Inggris dan Amerika Serikat) disadari sebagai penghasil bahan pewarna alami yang penting secara ekonomis nomor dua di dunia, setelah karamel. Selaput biji B. orellana L. mengandung pigmen utama dari golongan di-apo karotenoid dengan komposisi bixin (C 25 H 30 O 4 ) sebesar 83,41 ± 4,54% (Suparmi et al., 2008 a,b). Ikatan rangkap yang panjang pada struktur kimia bixin menyebabkan warna merah pada pigmen tersebut (Rios et al., 2005; Nobre et al., 2006). Di sebagian besar negaranegara Eropa dan Amerika, bixin telah dimanfaatkan sebagai pewarna makanan, obat dan kosmetik. Akan tetapi, pemanfaatan bixin di Indonesia terbatas pada industri tekstil tradisional, terutama sebagai pewarna batik dan tenun, sedangkan aplikasi dalam industri makanan dan minuman belum banyak dikembangkan. Di Indonesia penelitian mengenai identifikasi, karakterisasi bixin, dan potensinya sebagai pewarna makanan sudah banyak dikaji (Lukiati & Nugrahaningsih, 2003; Kurniawati et al., 2007; Suparmi et al., 2007; Suparmi et al., 2008a,b), akan tetapi eksplorasi potensi bixin sebagai pewarna alami belum banyak dikembangkan. Potensi pigmen bixin sebagai pewarna alami makanan di Indonesia perlu dikembangkan sejalan dengan maraknya kasus penyalahgunaan bahan pewarna sintetik. Bixin biasanya diformulasikan untuk menampilkan warna pada kisaran kuning, oranye, jingga sampai merah pada berbagai makanan khususnya makanan berbasis lemak seperti mentega, margarin, keju olahan, yoghurt, es krim, makanan ringan seperti kue dan biskuit, disamping itu juga digunakan untuk pewarna minyak goreng, minyak jagung, dan salad (Scotter et al., 1994; Scotter et al., 2002). Potensi bixin sebagai pewarna alami makanan,

3 83 didukung oleh banyak hasil penelitian yang mengungkapkan bahwa bixin memiliki sifat antioksidan, antigenotoksik, antikarsinogenik, anti jamur, dan anti inflamantori, sehingga diharapkan bermanfaat bagi kesehatan tubuh (Kurniawati et al.,2007). Akan tetapi, permasalahan utama dalam penggunaan pigmen sebagai pewarna alami makanan adalah menjaga stabilitas warna pigmen selama pengolahan dan penyimpanan makanan, sehingga tidak terjadi degradasi warna (Francis 1989 dalam Kiattisak et al.,2004). Scotter et al., (1994) melaporkan bahwa sebagaimana sifat karotenoid yang lain, bixin bersifat rentan terhadap degradasi oksidatif. Faktor yang mempengaruhi stabilitas pigmen antara lain: suhu, oksigen, ph, cahaya, pelarut, asam askorbat, ion logam, dan keberadaan sulfur dioksida (Scotter et al., 1994; Scotter et al., 1998; Montenegro et al., 2004; Bittencourt et al., 2005; Silva et al., 2005). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui stabilitas bixin pada berbagai suhu, cahaya, ph, dan oksidator-reduktor. Selain itu, pada penelitian ini juga dilakukan uji coba penambahan serbuk pigmen bixin pada yogurt dengan konsentrasi 1%, 5%, dan 10% b / v. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi sumbangan teknologi proses produksi pangan mengenai penambahan bahan pewarna alami makanan berupa serbuk pigmen bixin dari selaput biji kesumba keling (B. orellana L.), sehingga diharapkan dapat meningkatkan derajat kesehatan masyarakat Indonesia dan menambah khazanah makanan fungsional yang populer akhir-akhir ini. METODE PENELITIAN Pigmen bixin pada penelitian ini diperoleh dari hasil ekstraksi biji kesumba (Bixa orelana L.) menggunakan pelarut aseton. Pemurnian bixin dilakukan dengan kromatografi kolom menggunakan fase diam silika gel Si-60 dan fase gerak aseton:heksana (1:2 v / v ). Ekstrak kasar dilarutkan dalam pelarut aseton:heksana (1:2v/v), kemudian dimasukkan dalam kolom kromatografi yang telah dipersiapkan. Fraksi ke empat ditampung dalam botol sampel dan dikeringkan dengan dialiri gas N 2 (Suparmi et al., 2008a,b). Larutan uji dibuat dengan melarutkan bixin kering ke dalam aseton 100% sampai volume yang diinginkan, dengan absorbansi larutan pada panjang gelombang maksimum ( = ± 456 nm) sebesar satu (A = 1). max 0

4 84 Sains Medika, Vol. 1, No. 1, Januari Juni 2009 Pengaruh suhu (termostabilitas) Larutan uji sebanyak 20 ml dimasukkan kedalam tabung reaksi dengan tutup berulir kemudian disimpan pada suhu 4, 25, 37, dan 50 C (Rao et al., 2004). Perlakuan suhu 25, 37, dan 50 C dilakukan dengan menempatkan larutan uji dalam waterbath dan dalam lemari es untuk perlakuan suhu 4 C selama 7 hari dan diamati setiap hari. Pengaruh cahaya (fotostabilitas) Fotostabilitas bixin diuji dengan dua jenis sumber cahaya yang berbeda, yaitu cahaya polikromatik menggunakan lampu daylight merk Philip 15 Watt dan cahaya UV menggunakan lampu UV merk Philip 15 Watt pada intensitas cahaya lux. Sebagai kontrol dilakukan penyimpanan larutan pada kondisi gelap (labu ukur dibungkus aluminium foil) dan disimpan pada ruangan gelap. Pengamatan fotostabilitas pigmen dilakukan setiap jam selama 12 jam untuk irradiasi cahaya UV, sedangkan untuk cahaya polikromatik dan gelap diamati setiap hari selama 7 hari (Suparmi et al., 2007). Pengaruh ph Stabilitas bixin terhadap pengaruh ph diuji pada 3 tingkat keasaman (ph: 3, 4, dan 5). Pelarut aseton dengan ph 3, 4, dan 5 dibuat dengan menambahkan NaOH 1 M dan HCl 1 M pada aseton sampai diperoleh ph yang diinginkan. Bixin dilarutkan dalam larutan aseton sesuai dengan variasi ph selama 3 jam dan diamati setiap 30 menit (Jespersen et al., 2005). Pengaruh oksidator-reduktor Larutan uji sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan oksidator 1 ml H 2 30%, kemudian dihomogenasi menggunakan vortex. Stabilitas pigmen terhadap pengaruh reduktor diuji dengan menambahkan 5 mg asam askorbat pada 10 ml larutan uji, kemudian dihomogenasi menggunakan vortex. Larutan yang telah homogen disimpan pada suhu ruang selama 12 jam dan diamati tiap 1 jam. Analisa data Data karakteristik stabilitas bixin yang diperoleh dari pengamatan tiap-tiap parameter di atas, kemudian dianalisa melalui pengamatan pola spektra absorbsi dari spektrofotometer berkas rangkap Varian Cary 50 pada panjang gelombang nm. Pola spektra absorbsi spektrofotometer dari tiap-tiap parameter di atas digambarkan dengan Program Origin 6.1. Nilai absorbansi pada panjang gelombang maksimum (A)

5 85 digunakan untuk menghitung konstanta laju degradasi (k) yang dianalisa menggunakan regresi linear dengan Program Microsoft Excel 2003 dari rasio A/A 0 terhadap waktu (Jespersen et al., 2004). HASIL PENELITIAN Pengaruh suhu (termostabilitas) Penurunan absorbansi bixin pada berbagai variasi suhu penyimpanan tampak hampir tidak berbeda secara signifikan, sebagaimana dilihat pada Gambar 1. Pengaruh cahaya (fotostabilitas) Pola spekra absorbsi bixin cenderung menurun seiring bertambahnya waktu irradiasi, sebagaimana ditampilkan pada Gambar 2. Hasil regresi linear menunjukkan hubungan yang sangat kuat (R 2 =0,9956) antara waktu irradiasi dengan rasio A/A 0. Degradasi larutan bixin pada cahaya polikromatik lebih cepat dibandingkan dengan penyimpanan gelap, sebagaimana terlihat pada Tabel 1. Pengaruh ph Pola spektra absorbsi bixin ( ) yang dilarutkan dalam aseton dengan kisaran max ph 3, 4, dan 5 tampak berbeda dibandingkan dengan bixin yang dilarutkan pada aseton murni dengan ph 7 sebagaimana disajikan pada Tabel 2. Pengaruh oksidator-reduktor Pengaruh penambahan oksidator dan reduktor pada larutan bixin dapat dilihat pada perubahan pola spektra absorbansi sebagaimana disajikan pada Gambar 3. (a) (b)

6 86 Sains Medika, Vol. 1, No. 1, Januari Juni 2009 (c) (d) Gambar 1. Perubahan pola spektra bixin dalam pelarut aseton selama penyimpanan 7 hari pada berbagai suhu: 4 C (a), 25 C (b), 37 C (c), 50 C (d). Gambar 2. Perubahan pola spektra absorbsi bixin dalam pelarut aseton selama 12 jam irradiasi cahaya UV (pengukuran setiap 1 jam) Gambar 3. Perubahan pola spektra absorbsi bixin dalam pelarut aseton selama 12 jam (pengukuran setiap 1 jam) penyimpanan, setelah penambahan: (a) H 2 30%, (b) reduktor asam askorbat

7 87 Tabel 1. Prosentase perubahan absorbansi maksimal ( ) larutan pigmen bixin max selama 7 hari iradiasi cahaya polikromatik intensitas lux dan kondisi gelap, pada temperatur 27± 2ºC Tabel 2. Panjang gelombang serapan maksimum ( ) bixin pada berbagai ph pelarut max PEMBAHASAN Pengaruh suhu (termostabilitas) Penyimpanan selama 7 hari menyebabkan absorbansi maksimum bixin menurun sebesar 4,01%; 6,78%; 24,09%, dan 70,97% pada masing-masing suhu 4, 25, 37 dan 50 C. Rios et al. (2005) melaporkan bahwa suhu tinggi menyebabkan degradasi bixin yang akan menghasilkan produk degradasi dengan warna dan sifat kimia yang berbeda dengan bixin. Montenegro et al. (2004) melaporkan bahwa bixin bersifat stabil pada suhu ruang, namun akan mudah mengalami degradasi jika terdapat senyawa sensitizer dan cahaya. Pada suhu tinggi, 9 -cis-bixin terdegradasi menjadi all-trans-bixin, trans-monomethyl ester dari 4,8-dimethyltetradecahexaenedioic acid atau dikenal dengan senyawa McKeown (C17), serta senyawa volatil seperti xylene, toluen, dan toluic acid metyl ester (Scotter et al. 2001; Montenegro et al. 2004; Silva et al. 2005). Pembentukan produk degradasi pada larutan bixin dalam alkohol yang disimpan pada titik didih alkohol (78,3 C) terjadi

8 88 Sains Medika, Vol. 1, No. 1, Januari Juni 2009 secara cepat dengan energi aktivasi (Ea) sebesar 8,5 kkal/mol (Scotter et al. 1994; Scotter et al. 2001; Montenegro et al. 2004). Pengaruh cahaya (fotostabilitas) Penurunan absorbansi larutan bixin menunjukkan bahwa bixin yang terlarut dalam aseton sudah mengalami degradasi akibat pengaruh irradiasi cahaya UV. Wiles & Carlsson (1987) melaporkan bahwa cahaya UV dengan panjang gelombang pendek menyebabkan molekul terdegradasi lebih cepat, yang ditunjukkan dengan penurunan absorbansi dan pemucatan warna setelah iradiasi cahaya UV akibat putusnya ikatan rangkap pada struktur kimia bixin. Energi foton cahaya UV yang diabsorbsi menyebabkan bixin terdegradasi membentuk molekul baru dengan struktur kimia yang lebih sederhana dibandingkan molekul bixin awal dan menyebabkan perubahan sifat-sifat kimia pigmen bixin. Laju degradasi bixin pada kondisi penyimpanan gelap lebih rendah dibandingkan dengan penyimpanan pada irradiasi cahaya lampu daylight. Hasil ini menunjukkan bahwa bixin lebih stabil pada penyimpanan kondisi gelap. Sebagaimana Barbosa et al. (2005) melaporkan bahwa stabilitas bixin pada kondisi gelap 10 kali lebih besar dibandingkan bixin yang diiradiasi cahaya fluoresens (700 lux) selama 7 hari. Najar et al. (1987) melaporkan bahwa bixin bersifat sensitif terhadap cahaya. Irradiasi cahaya polikromatik dengan intensitas 430 lux dan 1380 lux selama 12 hari pada suhu 24 ± 1 C menyebabkan photobleaching ekstrak pigmen selaput biji kesumba (bixin 0,25-0,26 mg/ml) dalam pelarut kloroform. Pengaruh ph Pada kondisi yang semakin asam (ph semakin kecil) serapan maksimum pigmen bixin mengalami pergeseran ke arah panjang gelombang yang lebih kecil atau dikenal dengan istilah hipsokromik. Kondisi ini mengindikasikan ph menyebabkan degradasi pigmen. Limantara (2006) melaporkan bahwa pergeseran hipsokromik dan hipokromik menunjukkan terjadinya proses degradasi. Pengaruh oksidator-reduktor Bixin bersifat stabil terhadap penambahan oksidator H 2 30%. Stabilitas pigmen bixin terhadap oksidator ini didukung oleh sifat antioksidannya. Bixin mampu melawan serangan oksidator, sehingga gugus reaktif pigmen tidak mengalami kerusakan akibat oksidator. Penambahan oksidator pada pigmen bixin menyebabkan laju degradasi yang

9 89 sangat kecil, hal ini diakibatkan oleh sifat pigmen yang mempunyai kemampuan dalam menangkal radikal bebas - dari H 2 30%. De-Oliveira et al. (2003) melaporkan bahwa ekstrak kesumba bersifat antimutagenik dan antikarsinogenik pada sel mamalia. Norbixin terbukti dapat menghambat mutasi DNA yang diinduksi oleh radiasi sinar UV, hidrogen peroksida (H 2 ) dan radikal bebas. Efek antimutagenik norbixin dibuktikan berdasarkan uji mutagenitas pada Salmonella dengan nilai penghambatan H 2 sebesar 87%. Bixin dilaporkan efektif sebagai quencher ROS (Radical Oxygen Species) yang berperan sebagai agen proteksi terhadap radikal bebas dan sebagai penghambat cisplatin, yaitu senyawa yang menginduksi kanker pada rodensia (Paumgartten et al., 2002). Laju degradasi bixin akibat penambahan reduktor asam askorbat adalah 1,05 % per jam. Penambahan asam askorbat pada pigmen ini diduga dapat mencegah degradasi pigmen yang diakibatkan oleh faktor oksidatif dari luar seperti suhu, ph, dan cahaya. Sebagaimana Humeau et al. (2000) melaporkan bahwa asam askorbat yang ditambahkan pada produk pangan berperan sebagai antioksidan untuk menjaga stabilitas warna, menghambat pencoklatan enzimatik, melindungi flavor, dan juga dapat melindungi oksidasi pada pangan. KESIMPULAN Hasil uji stabilitas pigmen menunjukkan bahwa bixin bersifat stabil pada berbagai penyimpanan dengan kondisi suhu rendah (4 C), suhu ruang (25 C), suhu tubuh (37 C), suhu tinggi (50 C) dengan nilai degradasi pada masing-masing suhu sebesar 0,52%; 0,85%; 3,58%. Bixin lebih stabil pada kondisi gelap, sedangkan pengaruh cahaya UV selama 12 jam menyebabkan degradasi hampir 100%. Irradiasi cahaya polikromatik selama 7 hari menyebabkan degradasi per hari sebesar 14,39%. Bixin memiliki kecenderungan lebih stabil pada ph 4 dan mengalami peningkatan degradasi pada ph 3 dan ph 5. Bixin bersifat relatif stabil terhadap pengaruh penambahan oksidator H 2 30% dan reduktor asam askorbat. SARAN Perlu dilakukan penelitian lanjut mengenai stabilitas serbuk pewarna bixin. Pengujian terhadap toksisitas pigmen bixin dari selaput biji kesumba keling

10 90 Sains Medika, Vol. 1, No. 1, Januari Juni 2009 (Bixa. orellana L.) juga perlu dilakukan, mengingat pigmen tersebut diaplikasikan sebagai pewarna pada bahan pangan. Hal ini diharapkan dapat memantapkan pemanfaatannya di bidang industri makanan dan minuman di Indonesia. UCAPAN TERIMA KASIH Penelitian ini didukung oleh dana penelitian yang diperoleh Suparmi dari Beasiswa Unggulan Untuk Peneliti, Pencipta, Penulis, Wartawan, Seniman dan Tokoh (P3SWOT) Biro Perencanaan dan Kerjasama Luar Negeri DEPDIKNAS RI Tahun Suparmi mengucapkan terima kasih kepada Departemen Pendidikan Nasional yang telah memberikan Beasiswa Unggulan Persemaian Insan Indonesia Cerdas DAFTAR PUSTAKA Barbosa, M.I.M.J., C.D. Borsarelli, and A.Z. Mercadante, 2005, Light Stability of Spray- Dried Bixin Encapsulated With Different Edible Polysaccharide Preparations, Food Research International 38(2005): Bittencourt, C., M.P. Felicissimo, Jean-Jacques Pireaux, and L. Houssiau, 2005, Study of Annatto from Bixa orellana L. Seeds: an Application of Time-of-flight Secondary Ion Mass Spectrometry, Article Spectroscopy Europe 17 (2): De-Oliveira, A.C.A.X., Silva, I.B., Manhaes-Rocha, D.A, and Paumgartten, F.J.R, 2003, Induction of Liver Monoxygenases by Annatto and Bixin in Female Rats, Brazilian Journal of Medical and Biological Research (2003) 36, Humeau, C., B. Rovel, and M. Girardin, 2000, Enzymatic esterification of bixin by L-ascorbic acid, Biotechnology Letters 22: Jespersen, L., L.D. SrØmdahl, K. Olsen, and L.H. Skibted, 2005, Heat and Light Stability of Three Natural Blue Colorants for Use In Confectionery and Beverages, Eur Food Res Technol (2005) 220, Kiattisak, D., B. Saiccheua, and S. Sueeprasan, 2004, Roselle Anthocyanins as a Natural Food Colorant and Improvement of Its Colour Stability. AIC 2004 Color and Paints, Interim Meeting of the International Colour Association, Proceedings: Kurniawati, P., Soetjipto, H., dan Limantara, L., 2007, Aktivitas Antioksidan Dan Antibakteri Pigmen Bixin Selaput Biji Kesumba keling (Bixa Orellana L.), Skripsi, Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga. Limantara, L., P. Koehler, B. Wilhelm, R.J. Porra and H. Scheer, 2006, Photostability of Bacteriochlorophyll a and Derivatives: Potential Sensitizer for Photodinamic Tumor Theraphy, Photochemistry and Photobiology 82: Lukiati, B and Nugrahaningsih, 2003, The Effect of Alcohol Concentration to Caroten Content in Kesumba keling (Bixa orellana L.) Seed as Food Colouring, Abstrak, Dikutip tanggal

11 91 Montenegro, M.A, A. De O. Rios, A.Z. Mercadante, M.A. Nazareno, and C.D. Borsarelli, 2004, Model Studies on the Photosensitized Isomerization of Bixin, Journal of Agricultural and Food Chemistry 2004 (52): Rios, A. de Oliveira and Mercadante, A. Z, 2003, Novel Method for The Determination of Added Annatto Colour in Extruded Corn Snack Products, Food Additives and Contaminants February (2): Rios, A. de Oliveira, C.D. Borsarelli, and A.Z. Mercadante, 2005, Thermal Degradation Kinetics of Bixin in an Aqueous Model System, Journal of Agricultural and Food Chemistry 2005 (53), Scotter, M. J., Thorpe. S. A., Reynolds. S. L., Wilson. L. A., and Strutt, 1994, Characterizations of The Principal Colouring Components of Annatto Using High Performance Liquid Chromatography with Photodiode-Array Detection, Food Additives and Contaminants 11(3): Scotter, M.J., L.A. Wilson, G.P. Appleton, and L. Castle, 1998, Analysis of Annatto (Bixa orellana L.) Food Coloring Formulations. 1. Determination of Colouring Components and Colored Thermal Degradation Products by High Performance Liquid Chromatography with Photodiode-Array Detection, Journal of Agricultural and Food Chemistry 1998 (46): Scotter. M. J, L. Castle, and G. P. Appleton, 2001, Kinetics and yields for the formation of coloured and aromatic thermal degradation products of annatto in foods, Food Chemistry 2001 (74), Silva, M. C. D., J. R. Botelho, M. M. Conceição, B. F. Lira, M.A. Coutinho, A. F. Dias, A. G. Souza and P. F. A. Filho, 2005, Thermogravimetric Investigations on the Thermal Degradation of Bixin, Derived from The Seeds of Annatto (Bixa orellana L.), Journal of Thermal Analysis and Calorimetry 79 (2005): Suparmi, B. Prasetyo, dan L. Limantara, 2007, Fotodegradasi Pigmen Bixin Dari Biji Kesumba (Bixa orellana L.): Potensinya Sebagai Pewarna Alami Makanan, Prosiding Seminar Nasional Pigmen 2007 Back to Nature dengan Pigmen Alami, UKSW Salatiga, B(05): Suparmi, B. Prasetyo, and L. Limantara, 2008a, Natural Food Colorant from Seed of Kesumba (Bixa orellana L.), Proceeding of International Conference on Food Science and Technology 2008 The Challenge of Universal Food Quality and Safety Regime, Soegijapranata Catholic University, Semarang, FSQ (06) Suparmi, B. Prasetyo, dan L. Limantara, 2008b, Kandungan dan Isolasi Pigmen Pada Selaput Biji Kesumba (Bixa orellana L.): Potensinya Sebagai Pewarna Alami Makanan, Prosiding Seminar Nasional 2008 Pengembangan Agroindustri Berbasis Sumberdaya Lokal untuk Mendukung Ketahanan Pangan, Universitas Brawijaya, Malang, A(22): Sutarno, S, 2001, Tumbuhan Penghasil Warna Alami dan Pemanfaatannya dalam Kehidupan Suku Meyah di Desa Yoom Nuni, Manokwari, Skripsi, Universitas Negeri Cendrawasih, Manokwari.