Penggunaan Kuning Telur Bebek sebagai Ekstendxer pada Proses Kriopreservasi Sperma Ikan Patin Jambal

Transkripsi

1 Penggunaan Kuning Telur Bebek sebagai Ekstendxer pada Proses Kriopreservasi Sperma Ikan Patin Jambal Sularto 1), Evi Tahapari 1), Wartono Hadie 2) dan Ika Nurlaela 1) 1) Balai Penelitian Pemuliaan Ikan, Sukamandi 2) Pusat Penelitian dan Pengembangan Perikanan Budidaya Abstract Sularto, Evi Tahapari, Wartono Hadie and Ika Nurlaela Duck Egg yolk as an Extender on sperm cryopreservation process of Indonesian catfish (Pangasius djambal). Konferensi Akuakultur Indonesia This study aims to find most effective techniques of cryopreservation of Indonesian catfish sperm. Five mature males broodstock were used in this research. Egg yolk solution (5% in NaCl Ringer solution) used as Extender. Sperm dilution ratio 1: 9. While for Cryoprotectant used DMSO and Glycerol each ingredient 5, 10 and 15%. Storage of sperm carried in liquid nitrogen. The results showed that duck egg yolk extender can be used as an extender with a dose of 5%. DMSO and glycerol may be used as cryoprotectants in the preservation Indonesian catfish. Dose of DMSO that can be used a maximum of 10%, whereas for glycerol maximum of 5%. Test results on sperm fertility after freezing in liquid nitrogen has not successfully resulted in hatching the eggs. Keywords: Cryopreservation; Duck egg yolk; Indonesian catfish (Pangasius djambal); Sperm Abstrak Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui teknik kriopreservasi sperma ikan patin jambal (Pangasius djambal) yang paling efektif. Ikan uji yang digunakan adalah induk ikan patin jambal. Ekstender yang digunakan larutan kuning telur (5% dalam larutan Ringer NaCl). Pengenceran sperma dengan perbandingan 1: 9. Sedangkan untuk Krioprotektan digunakan DMSO dan Glycerol masing-masing bahan 5, 10 dan 15%. Penyimpanan sperma dilakukan dalam nitrogen cair. Hasil penelitian menujukkan bahwa kuning telur bebek dapat digunakan sebagai ekstender dengan dosis 5%. DMSO dan gliserol dapat digunakan sebagai krioprotektan pada preservasi ikan patin jambal. Dosis DMSO yang dapat digunakan maksimal 10%, sedangkan untuk gliserol maksimal 5%. Hasil uji fertilitas pada sperma setelah pembekuan dalam nitrogen cair belum berhasil membuahi telur, sehingga telur tidak menetas. Kata kunci: Kriopreservasi; Kuning telur bebek; Patin jambal (Pangasius djambal); Sperma Latar Belakang Ikan patin jambal (Pangasius djambal) merupakan komoditas asli Indonesia termasuk ikan yang memijah secara musiman yakni terjadi pada musim penghujan (bulan Oktober April), meskipun dibeberapa lokasi budidaya bisa terjadi matang gonad sepanjang tahun. Induk ikan patin jambal memiliki ukuran bobot individu yang relatif besar yaitu diatas 2 kg/ekor, bahkan induk yang telah berumur 5 tahun dapat mencapai bobot 5 10 kg/ekor. Untuk pemeliharan induk-induk tersebut diperlukan pengelolaan secara terus-menerus demi mempertahankan sumber keragaman genetik. Dengan demikian ada beberapa masalah yang dihadapi dalam pengelolaan induk tersebut, antara lain: diperlukan wadah pemeliharaan yang cukup besar dengan kualitas air yang baik, beban biaya pakan yang relative besar, serta kesulitan dalam transportasi induk. Selain itu pada musim kemarau sering kali kesulitan mendapatkan sperma pada ikan patin jambal. Pengawetan sperma ikan patin dengan cara konvensional hanya dapat bertahan selama beberapa jam. Dilaporkan oleh Gustiano et al. (2003) bahwa sperma ikan patin pada suhu biasa/suhu ruangan (26 28 o C) hanya dapat bertahan hidup selama 15 jam, sedangkan pada suhu 4 6 o C dapat bertahan selama 60 jam. Untuk mempertahankan plasma nutfah/sumber genetik maupun untuk tujuan akuakultur diperlukan teknologi penyimpanan sperma dengan jangka waktu yang lama. Dengan cara konvensional ini tentunya belum bisa memecahkan permasalahan di lapangan. 220

2 Untuk memecahkan masalah tersebut di atas perlu adanya upaya terobosan teknologi untuk penyimpanan baik telur, sperma maupun embrio. Dalam kegiatan ini akan dilakukan penelitian mengenai pengawetan sperma (kriopreserasi) pada ikan patin jambal. Kriopreservasi sperma merupakan teknologi pengawetan sperma dengan menggunakan bahan pengawet dan disimpan dalam suhu dingin (Lisut, 2000). Yao et al. (2000) melaporkan bahwa penggunaan krioprotektan DMSO (dimethyl sulfoxide) untuk pengawetan sperma yang disimpan dalam cairan N 2 cair memberikan hasil terbaik dengan tingkat motilitas sperma 20-25%. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi jenis dan dosis ekstender sebagai krioprotektan dalam kriopreservasi sperma ikan patin jambal. Keberhasilan kriopreservasi sperma ikan patin jambal ini diharapkan dapat mendukung kegiatan konservasi, akuakultur, genetika serta memudahkan dalam transportasi gen jantan pada ikan patin jambal. Lokasi Penelitian Metodologi Riset Penelitan ini dilakukan di laboratorium genetik BPPI Sukamandi. Untuk proses penyiapan telur dan sperma dilakukan di hatchery ikan patin. Perlakuan A. Perlakuan Ekstender : kuning telur dan kontrol. B. Perlakuan Krioprotektan: DMSO dan Glicerol, masing-masing dengan dosis 5%, 10%, dan 15%. Masing-masing perlakuan dengan ulangan tiga kali. Ikan uji dan koleksi sperma Ikan uji yang digunakan adalah induk jantan jambal dan betina ikan patin jambal dan patin siam untuk uji fertilisasi. Untuk merangsang perkembangan gonad baik induk jantan dan betina, ikan dipelihara dalam kolam pencobaan yang dijaga kualitas airnya serta diberi pakan berupa pelet induk dengan kadar protein 34 38%. Untuk merangsang spermiasi induk jantan disuntik dengan hormon GnRH + domperidon (Ovaprim, Syndel) dengan dosis 0,3 ml/kg induk jantan. Sperma diambil dengan cara striping induk jantan setelah 6 8 jam setelah penyuntikan. Pengambilan sperma dilakukan sedemikian rupa sehingga terbebas dari urine. Sperma diambil dari lima jantan yang dikumpulkan menjadi satu kemudian diamati kualitasnya yaitu motilitas dan daya fertilitasnya, selanjutnya diperlakukan dengan kriopreservasi. Kriopreservasi sperma Sperma segar dikumpulkan dari lima induk jantan masing-masing sebanyak 2 ml sehingga terkumpul 10 ml gabungan. Pengenceran sperma dilakukan dengan menggunakan perbandingan sperma dan ekstender yaitu 1: 9. Ekstender yang digunakan adalah madu (5% madu dalam Ringer NaCl) dan kuning telur bebek (5% kuning telur bebek dalam Ringer NaCl). Krioprotektan (DMSO atau Glyserol) ditambahkan dengan konsentasi setiap bahan yaitu: 5%, 10%, dan 15% Semua proses penyiapan dilakukan dalam suhu 5 20 o C. Setelah proses penyiapan dilakukan, larutan sperma dimasukkan ke dalam straw ukuran 0,5 ml dan ditutup dengan menggunakan kristal polyvinil alkohol. Kemudian sperma disimpan pada suhu 4 5 o C selama 20 menit untuk proses equilibrasi. Kemudian straw disusun di atas rak vaporasi. Vaporasi dilakukan dengan memposisikan rak vaporasi 3 cm di tas permukaan nitrogen cair selama 7 menit. Setelah vaporasi, proses pembekuan (freezing) dillakukan dengan cara memasukan straw ke dalam nitrogen cair. Penyimpanan sperma dalam nitrogen cair dilakukan selama 2 minggu dan 1 bulan. Pencairan kembali (thawing) dilakukan dengan cara mencelupkan straw ke dalam air bertemperatur 30 o C selama 2 menit (Bart et al., 2006). 221

3 Uji motilitas dan fertilitas Setelah disimpan selama beberapa waktu (2 minggu dan 1 bulan) dilakukan uji motilitas dan uji fertilitas dengan menggunakan telur ikan patin jambal (sejenis) dan telur patin siam. Untuk menguji efektifitas penyimpanan, maka dibandingkan data fertilitas dan motilitas sperma antara pra-pembekuan sperma dengan pasca-thawing dan sperma segar. Aktifasi sperma dilakukan dengan menambahkan larutan aktifator (45mM NaCl, 5 mm KCl dan 30 mm TRIS dalam 100 ml aquadest) dengan perbandingan 1:50. Pengamatan motilitas sperma dilakukan di bawah mikroskop. Untuk menentukan kriteria motilitas sperma dilakukan skoring seperti pada Tabel 1. Tabel 1. Kriteria penilaian motilitas spermatozoa setelah perlakuan untuk mendukung keberhasilan fertilisasi. No Kriteria Skor 1 75% spermatozoa bergerak cepat dengan arah maju % spermatozoa bergerak dan sekitar 50% bergerak cepat 4 arah maju < 50% spermatozoa bergerak dan < 25% bergerak cepat arah 3 maju. 4 < 25% spermatozoa bergerak dan < 5% yang bergerak cepat arah 2 maju. 5 Spermatozoa hanya sedikit bergerak/ bergetar (tidak ada yang 1 bergerak maju atau bergerak cepat) 6 0% (semua spermatozoa tidak bergerak / imotil) 0 Hasil dan Bahasan Penggunaan ekstender kuning telur 5% ternyata tidak berpengaruh buruk terhadap motilitas, viabilitas dan daya tetas telur, namun ekstender madu berpengaruh buruk terhadap kualitas spermanya seperti terlihat pada Gambar 1. Gambar 1. Pengaruh penggunaan ekstender terhadap motilitas, viabilitas dan daya tetas telur setelah disimpan selama 4 jam pada suhu 5 o C. Dari Gambar 1. terlihat bahwa penggunaan ekstender madu berpengaruh terhadap motilitas dan viabilitas sperma dan secara uji statistik menunjukkan perbedaan yang nyata dibanding kontrol/sperma segar (P<0,05), Hal tersebut menunjukkan bahwa madu tidak cocok digunakan untuk ekstender dalam pengawetan sperma, sedangkan Hasil ini berbeda dengan yang dilaporkan Sunarma et al. (2007) bahwa ekstender madu 0,5% yang dicampur dengan krioprotektan DMSO layak digunakan untuk bahan pengawet sperma ikan nilem. Penggunaan ekstender kuning telur bebek tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (P>0,05)., hal ini menunjukkan bahwa kuning telur bebek layak digunakan untuk bahan ekstender dalam pengawetan sperma. Seperti dilaporkan Ernawati (1999) bahwa kuning telur dapat digunakan pada pengawetan sperma ikan patin siam. 222

4 Penggunaan krioprotektan bertujuan untuk melindungi spermatozoa pada saat proses pembekuan dalam N 2 cair. DMSO dan Glycerol termasuk krioprotektan yang dapat menembus lapisan membran sel sperma yang akan menggantikan air yang keluar dari dalam sel pada saat proses pembekuan sehingga keseimbangan elektrolit intra dan ekstra seluler tetap terjaga. Selain itu krioprotektan tersebut dapat menurunkan titik beku larutan sehingga memberi kesempatan pada sel memperpanjang proses penyesuaian terhadap perubahan suhu yang ekstrim. Gambar 2. Pengaruh penggunaan krioprotektan terhadap motilitas sperma setelah disimpan selama 20 jam dalam suhu 5 o C. Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05). Berdasarkan Gambar 2. terlihat bahwa ada pengaruh krioprotektan terhadap motilitas spermatozoa pra-pembekuan menunjukkan bahwa semakin tinggi dosis krioprotektan semakin rendah motilitas sperma. Krioprotektan berfungsi sebagai pelindung dalam proses kriopreservasi, namun dalam kadar tertentu krioprotektan dapat bersifat toksik terhadap spermatozoa. Seperti dikemukakan oleh Fahy (1986) bahwa penggunaan krioprotektan yang dimasukan ke dalam cairan pengencer dibatasi oleh sifat toksiknya. Krioprotektan seperti DMSO dan Glycerol berfungsi untuk melindungi spermatozoa dari dalam karena kedua bahan tersebut dapat masuk ke dalam membrane sel sperma. Namun dalam kadar tertentu krioprotektan dapat bersifat toksik bagi spermatozoa. Berdasarkan uji lanjut (HSD) ternyata dosis krioprotektan berpengaruh nyata (P<0,05) dibanding kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa krioprotektan pada kadar tertentu bersifat toksik. Dosis DMSO 5% dan 10% masih memberikan pengaruh cukup baik terhadap tingkat motilitas sperma yaitu berturut-turut 66,67% dan 58,33%. Sedangkan untuk dosis gliserol 5% menghasilkan motilitas sperma 50%. Sperma yang memenuhi syarat untuk proses pembuahan telur harus mengandung spermatozoa yang hidup dan bergerak aktif ke depan (progresif). Persentase sperma yang motil tidak harus lebih dari 75%. Dalam aplikasi sehari-hari semen yang digunakan dianjurkan tidak kurang dari 50% spermatozoa yang motil, meskipun Hafez (1987) menganjurkan 60% atau lebih. Sedangkan menurut Erdhal dan Graham (1987) motilitas sperma segar untuk pembekuan minimal 70%. Gambar 3. Pengaruh penggunaan krioprotektan terhadap viabilitas spermatozoa setelah disimpan selama 20 jam dalam suhu 5 o C. Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang nyata (P< 0,05). 223

5 Krioprotektan berpengaruh terhadap viabilitas sperma (P<0,05). Dari Gambar 3 terlihat bahwa semakin tinggi dosis krioprotektan baik DMSO maupun Gliserol semakin rendah viabilitas spermanya. Dosis DMSO 15% menyebabkan viabilitas sperma sangat rendah (8,05%), sedangkan untuk gliserol mulai dosis 10% menyebakan viabilitas sangat rendah (9,13%) dan pada dosis gliserol 15% semua sperma tidak ada yang dapat membuahi telur. Hal tersebut menunjukkan bahwa pengaruh toksik gliserol lebih tinggi dibanding DMSO. Gambar 4. Pengaruh krioprotektan terhadap daya tetas setelah disimpan selama 20 jam dalam suhu 5 o C. Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05). Dari Gambar 4 terlihat bahwa krioprotektan (DMSO dan gliserol) dengan dosis 5 dan 10% memberikan daya tetas yang tinggi lebih dari 90%, tidak berbeda dengan kontrol (P>0,05). Hal tersebut menunjukkan bahwa sperma yang berhasil membuahi telur dapat berkembang dan berhasil menetas. Sedangkan dosis DMSO 15% menghasilkan daya tetas 33,27%, hal ini menunjukkan bahwa hanya sebagian kecil sperma yang mampu membuahi dan berhasil dalam proses perkembangan embrio sampai menetas. Pada penelitian ini sperma hasil thawing pasca pembekuan dalam N 2 cair selama 2 minggu dan 1 bulan belum berhasil membuahi telur. Dari hasil pengamatan secara mikroskopis terlihat bahwa spermatozoa hasil pembekuan dengan menggunakan ekstender kuning telur dicampur dengan krioprotektan dosis DMSO 5% dan 10% lebih dari 50% spermatozoa bertahan hidup namun tidak motil dengan sedikit bergerak maju-mundur atau bergetar (tidak progresif). Untuk sperma dengan krioprotektan 5% dan 10% gliserol spermatozoa yang bertahan hidup namun motilitasnya kurang dari 50%. Menurut Christensen dan Tiersch (1996) bahwa kehilangan motilitas sperma pada kriopreservasi dapat disebabkan karena bersamaan dengan tumbuhnya bakteri. Hal ini bisa terjadi pada saat penambahan ekstender kuning telur bebek atau pada saat proses persiapan, dimana ruang lemari kerja bersuhu 20 o C, tidak seperti yang disarankan Sunarma et al. (2007); Bart et al. (2006) untuk proses persiapan harus dilakukan pada suhu 5 o C. Yao et al. (2000) melaporkan bahwa penggunaan krioprotektan DMSO (dimethyl sulfoxide) untuk pengawetan sperma yang disimpan dalam cairan nitrogen (N 2 ) memberikan hasil terbaik dengan tingkat motilitas sperma 20-25%. Berdasarkan hasil yang diperoleh ini perlu dicari atau diperbaiki teknik yang tepat untuk proses kriopreservasi sperma ini terutama pada proses persiapan. Kesimpulan Hasil ini menyimpulkan bahwa 1. Kuning telur bebek dapat digunakan sebagai ekstender dengan dosis 5%. 2. DMSO dan gliserol dapat digunakan sebagai krioprotektan untuk kriopreservasi sperma ikan patin jambal dengan dosis maksimal 10% 224

6 Daftar Pustaka Bart, A.N., S. Choosuk and D.P. Thakur Spermatophore cryopreservation and artificial insemination of black tiger shrimp, Penaeus monodon (Fabricius). Aquaculture Research, 37: Christensen, J.M. and T.R. Tiersch Refrigerated Storage of Channel Catfish Sperm. Jurnal of the World Aquaculture Society, 27(3): Ernawati, Y Efisiensi implantasi analog LH-RH dan 17α-metiltestosteron serta pembekuan semen dalam upaya peningkatan produksi benih ikan patin jambal siam (Pangasius hypopthalmus).disertasi Program Pascasarjana. Institust Pertanian Bogor. Erdhal, A.W. and E.F. Graham Fertilityu of teleost semen as affected by dilution and stroge in a seminal plasma mimicking medium. Aquaculture, 60: Fahy, G.M The relevance of Cryoprotectant toxicity to cryobiology. Cryobiology, 23: Gustiano, R., Sudarto and L. Pouyaud How to recognize Pangasius djambal?. In: J. Slembrouck, O. Komarudin, Maskur and M. Legendre (eds.). Technical Manual for Artificial Propagation of the Indonesian Catfish, Pangasius djambal. IRD-DKP. Pp Hafez, E.S.E Reproduction in Farm Animal. 5 th Ed. Lea and Febiger. Philadelpia. Lisut, O Teknologi awet sperma tangani kepupusan ikan. Sunarma, A, D.W.B. Hastuti dan Y. Sistina Penggunaan Ekstender Madu yang dikombinasikan dengan Krioprotektan Berbeda pada Pengawetan Sperma Ikan Nilem (Osteochylus haseltii Valenciennes, 1842). Makalah sisampaikan pada Konferensi Aquaculture Indonesia 2007, Surabaya 5 7 Juni Masarakat Akuakulture Indonesia. Yao, Z., L.W. Crim, G.F. Richarson and C.J. Emerson Motility, fertility and ultrastructural changes of ocean pout (Macrozoarces americanus L.) sperm after cryopreservation. Aquaculture, 181: