PENGEMBANGAN ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY UNTUK DETEKSI ANTIGEN CAMPYLOBACTER JEJUNI PADA DAGING AYAM

Transkripsi

1 Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 26 PENGEMBANGAN ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY UNTUK DETEKSI ANTIGEN CAMPYLOBACTER JEJUNI PADA DAGING AYAM (Development of Enzyme Linked Immunosorbent Assay for Detecting The Antigen for Campylobacter Jejuni on Chicken Meat) ANDRIANI, SUSAN M. NOOR, MASNIARI POELOENGAN dan SUPAR Balai Besar Penelitian Veteriner, Jl. R.E. Martadinata No. 3, Bogor 64 ABSTRACT Campylobacter jejuni is a bacteria, the major cause of acute enteritis in human around the world. High contamination of this microorganism occurs mainly on chicken meat. Using conventional method to detect the contamination of C. jejuni is difficult, takes a long time and is expensive. Therefore, the aim of this experiment is to develop an ELISA technique to detect the antigen of C. jejuni flagellin was developed and used for to samples of chicken meat. The result shows that eleven samples, out of to samples (5.7%) were positively contaminated by C. jejuni. Key Words: ELISA, C. Jejuni, Flagellin, Chicken Meat ABSTRAK Campylobacter jejuni adalah bakteri penyebab utama enteritis akut pada manusia di seluruh dunia. Kontaminasi mikroorganisme ini terutama pada daging ayam sangat tinggi. Deteksi kontaminan C. jejuni secara konvensional sulit dilakukan serta memerlukan waktu lama dan biaya yang mahal. Oleh karena itu pada penelitian ini dikembangkan teknik ELISA untuk mendeteksi antigen C. jejuni yang terdapat pada daging ayam. Teknik ELISA sandwich dikembangkan menggunakan serum hiperimun flagellin dari C. jejuni. Sebanyak 7 sampel daging ayam telah dianalisis dengan metode ELISA sandwich yang telah dikembangkan. Hasil analisis menunjukkan bahwa dari 7 sampel (5,7%) yang diperiksa positif terkontaminasi C. jejuni. Kata Kunci: ELISA, C. Jejuni, Flagellin, Daging Ayam PENDAHULUAN Indonesia merupakan salah satu negara anggota WTO, sehingga persaingan untuk memasarkan berbagai produk dari dalam negeri maupun ke luar negeri akan semakin ketat. Oleh karena itu, bahan makanan asal hewan yang merupakan salah satu komoditas dagang juga dituntut untuk ditingkatkan kualitasnya supaya memiliki kemampuan daya saing yang tinggi. Bahan makanan asal hewan harus memenuhi kualitas dan aman dikonsumsi apabila terbebas dari cemaran fisik, kimia, dan biologi. Bahan makanan asal hewan merupakan perishable food yang sangat mudah dicemari oleh mikroorganisme. Mikroorganisme patogen yang secara ekonomi berperan penting dalam foodborne disease zoonosis antara lain adalah Campylobacter jejuni, Salmonella sp., E. coli O 57 dan Shigella sp. (CDC, 2). C. jejuni adalah mikroorganisme yang paling banyak ditemukan pada ayam yaitu pada saluran pencernaan serta pada karkasnya (SHANE, 99; SMITH, 996). Menurut ROSENTHAL (999), ayam merupakan salah satu sumber infeksi C. jejuni pada manusia, karena ayam merupakan reservoir dari C. jejuni. Kejadian campylo-bacteriosis pada ayam broiler yang berhubungan dengan penularan atau penyebaran C. jejuni dalam karkas sebagai sumber infeksi pada manusia. Mikroorganisme C. jejuni yang terdapat pada 774

2 Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 26 ayam hidup dapat menyebabkan kontaminasi pada karkasnya serta produk bahan pangan ayam yang terjadi selama prosesing. Menurut BAILEY (993) kontaminasi C. jejuni pada karkas biasanya ditemukan dalam jumlah besar (>. CFU) pada peternakan ayam yang terinfeksi. Keberadaan mikroorganisme C. jejuni pada karkas ayam yang sangat tinggi merupakan indikasi atau petunjuk tentang kondisi lingkungan di sekitar karkas. Pada peternakan ayam yang terinfeksi oleh C. jejuni, 5% dari ayam yang terinfeksi tersebut akan membawa mikroorganisme C. jejuni sampai ayam tersebut dipotong. ROSENTHAL (999) melaporkan bahwa C. jejuni adalah penyebab gastroenteritis pada manusia. C. jejuni adalah penyebab utama enteritis akut pada manusia di negara yang sedang berkembang yang disebabkan oleh bakteri. Campylobacteriosis dapat menyebabkan kejadian penyakit bahkan kematian pada manusia dengan gejala kram perut, sakit perut, mual dan muntah, diare berdarah, demam dan kadang-kadang dapat menyebabkan arthritis dan komplikasi neurologik (ROSENTHAL, 999). Menurut KRAMER et al. (2) dan ALTEKRUSE (998) kejadian campylo bacteriosis pada manusia terutama disebabkan oleh daging ayam, daging sapi, daging babi yang belum dimasak, dan susu mentah serta bahan pangan lainnya yang berasal dari hewan. Menurut LINDQVIST et al., (2) dan KRAMER et al. (2), kontaminasi C. jejuni yang paling banyak adalah pada daging ayam. Namun C. jejuni memiliki dosis infeksi yang rendah, sehingga manusia yang terinfeksi mikroorganisme sebanyak 5 sel C. jejuni hidup sudah dapat menimbulkan sakit (UPTON, 995). Pada bahan pangan, mikroorganisme C. jejuni biasanya tidak dapat tumbuh dengan baik. Sehingga untuk mendeteksi adanya kontaminasi mikro- organisme ini diperlukan media cair yang telah diberi enrichment terlebih dahulu baru kemudian dilakukan subcultur pada media agar yang telah ditambah dengan 5% darah kuda. Inkubasi dapat dilakukan pada temperatur 37 C selama 4 sampai 6 jam kemudian diteruskan inkubasinya pada temperatur 42 C. Inkubasi dilakukan pada kondisi mikroaerophilik 5% oksigen, % carbondioksida dan 85% nitrogen. Menurut BLACKBURN dan CLURE (23) Campylobacter adalah mikroorganisme yang sulit dikultur. Sehingga perlu dikembangkan metode cepat untuk mendeteksi keberadaan mikroorganisme yang terdapat pada bahan pangan. Tujuan penelitian ini adalah mengembangkan uji ELISA sebagai metode untuk mendeteksi C. jejuni yang terdapat dalam karkas ayam. MATERI DAN METE Pertumbuhan C. jejuni C. jejuni diperbanyak dengan melakukan subcultur dalam media Nut Broth No.2 dan Campylobacter selective agar. Koloni bakteri yang sudah murni diambil menggunakan ose dan dimasukkan ke dalam tabung yang telah berisi larutan PBS steril sehingga dihasilkan suspensi. Pembuatan antigen flagellin C. jejuni C. jejuni dikultur dalam Campylobacter selective agar dengan penambahan 5% darah kuda. Kultur diinkubasi dalam lingkungan mikroaerofilik selama jam pada suhu 42 C. Kemudian sel bakteri dipanen dengan dicuci terlebih dahulu menggunakan buffered saline dan dimatikan secara heat killed pada suhu 56 C selama 3 menit. Supernatan yang ada disaring menggunakan filter 45 µm kemudian disimpan pada suhu -2 C. Protein (yang mengandung flagellin C. jejuni) diukur. Banyaknya protein yang diharapkan 2 mg/ml. Pembuatan antiserum terhadap flagellin C. jejuni Antiserum dibuat dengan cara menyuntikkan,5 ml antigen flagellin C. jejuni yang telah diemulsifikasi menggunakan FCA (Freund s Complete Adjuvant) pada kelinci dan mencit secara intramuskuler. Booster pada hari ke-4 hari menggunakan antigen flagellin yang diemulsifikasi menggunakan IFA (Incomplete Freund s Adjuvant). Empat belas hari kemudian dilakukan injeksi intravena menggunakan antigen flagellin yang telah disuspensikan dengan larutan NaCl nonpyrogen. 775

3 Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 26 Pengambilan serum Pengambilan serum dilakukan untuk mengetahui respon antibodi terhadap anti flagellin. Sebelum kelinci dan mencit diimunisasi dilakukan pengambilan darah terlebih dahulu. Sepuluh hari setelah booster terakhir dilakukan pengambilan darah. Darah yang telah diambil diukur titer antibodinya. Pemisahan Ig G Serum kelinci dan mencit dipurifikasi menurut metode HARLOW dan LANE (988) dengan menambahkan amonium sulfat jenuh ke dalam serum dengan perbandingan :. Dicampur dengan perlahan-lahan sampai tercampur rata dan biarkan selama menit. Presipitat disentrifuse 3 5 rpm selama 5 menit dan supernatan dibuang. Presipitat dilarutkan kembali dengan aquadest yang volumenya sama dengan volume serum awal. Serum didialisis menggunakan, M PBS dalam semipermeabel membran beberapa kali pada suhu 4ºC selama 24 jam. Setelah didialisis suspensi IgG antiflagellin disimpan pada suhu -2ºC sampai uji ELISA. Suspensi sampel uji Karkas ayam yang akan digunakan untuk uji ELISA terlebih dahulu dihancurkan menggunakan stomacher, kemudian dimasukkan ke dalam media Nut Broth No. 2 dan diinkubasikan pada suhu 37 C selama 2 3 jam. Untuk kontrol sampel uji, digunakan daging ayam yang diperoleh dari ayam ( ekor) yang telah dicekoki menggunakan suspensi yang mengandung C. jejuni 6. Menyiapkan reagen ELISA Coating Buffer: Na 2 CO 3, NaHCO 3, dan NaN 3 dilarutkan dalam aquadest (ph 9,6). Washing Buffer: 5 µlg Tween-2 (Sigma) dicampur dalam Liter PBS, ph 7,4 (PBST). Disimpan pada suhu 4 C. Blocking Buffer: 5 mg BSA dicampur dalam Liter PBS- Tween 2. Disimpan pada suhu 4 o C. Prosedur ELISA Coating dilakukan dengan cara memasukkan µl larutan IgG antiflagellin yang diperoleh dari kelinci ke dalam setiap sumuran mikroplate. Plate ditutup menggunakan plastik wrap dan diinkubasikan pada suhu 4 C selama 24 jam. Setelah itu dicuci menggunakan PBST sebanyak 3 4 kali, masing-masing pencucian dilakukan selama 4 menit. Masukkan µl suspensi sample uji ke dalam masing-masing sumuran mikroplate. Kontrol positif (ATCC 3329) dan kontrol negatif disertakan pada setiap mikroplate. Kemudian diinkubasikan dalam suhu 37 C selama jam. Setelah itu dicuci menggunakan PBST sebanyak 3 4 kali, masing-masing pencucian dilakukan selama 4 menit. Larutan IgG antiflagellin yang diperoleh dari mencit sebanyak µl dimasukkan ke dalam setiap sumuran mikroplate. Kemudian diinkubasikan dalam suhu 37 C selama jam. Setelah itu dicuci menggunakan PBST sebanyak 3 4 kali, masing-masing pencucian dilakukan selama 4 menit. Tambahkan blocking buffer µl pada setiap sumuran mikroplate. Kemudian diinkubasikan dalam suhu 37 C selama jam. Setelah itu dicuci menggunakan washing buffer sebanyak 3 4 kali, masing-masing pencucian dilakukan selama 4 menit. Setelah itu tambahkan konjugat anti mencit IgG HRPO (horseradish peroxide-conjugated) pada semua sumuran mikroplate. Kemudian diinkubasikan dalam suhu 37 C selama jam. Setelah itu dicuci menggunakan washing buffer sebanyak 3 4 kali, masing-masing pencucian dilakukan selama 4 menit. Setelah itu dicuci tambahkan µl ABTS (2,2 -azino-di-[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate]) (Bacto) pada semua sumuran mikroplate dan diinkubasikan selama 4 6 menit. Reaksi dibaca menggunakan ELISA reader (λ 44 nm). Antigen whole cell dan flagellin digunakan untuk memperoleh serum hiperimun mencit dan kelinci. Imunisasi antigen flagellin dilakukan dengan mencampur antigen dengan 776

4 Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 26 Freund s Adjuvant Complete (FAC). Setelah 2 minggu imunisasi FAC kemudian dilakukan booster menggunakan antigen yang telah di campur dengan Freund s Adjuvant Incomplete (FAI). Selanjutnya setelah hari ketujuh dari booster dilakukan injeksi antigen secara intravena. Setelah 7 sampai hari imunisasi terakhir, dilakukan pengambilan darah. Imunisasi antigen whole cell dilakukan secara subcutan dan intravena. Injeksi subcutan dilakukan pada hari ke-. Selanjutnya setiap empat hari kemudian dilakukan injeksi secara intravena. Injeksi terakhir dilakukan pada hari ke-2. Pada hari ke- sampai hari ke-4 dilakukan pengambilan darah. Darah yang telah dikoleksi kemudian diambil serumnya. Serum yang telah dipisahkan kemudian dilakukan uji aglutinasi untuk mengetahui respon antibody yang terbentuk. Serum hiperimun kelinci yang diinjeksi menggunakan antigen whole cell selanjutnya dilakukan absorb untuk memperoleh serum yang monospesifik. Sedangkan serum hiperimun kelinci yang diinjeksi menggunakan antigen fagellin selanjutnya dilakukan purifikasi antibody menggunakan amonium sulfat menurut metode HARLOW dan LANE (988) sehingga diperoleh Ig G. HASIL DAN PEMBAHASAN Pada Gambar dapat dilihat uji ELISA serum monospesifik yang diperoleh terhadap antigen whole sel dan flagellin untuk mengetahui spesifitas dari serum tersebut. Terlihat bahwa serum tersebut ternyata tidak monospesifik, karena reaksi serum terhadap antigen whole cell menunjukkan grafik yang lebih tinggi dari pada flagellin. Hal ini disebabkan karena sisa yang digunakan untuk mengabsorb serum yaitu sel yang telah dihilangkan flagella jumlahnya kurang banyak sehingga absorbsi yang terjadi tidak sempurna. Pada Gambar 2 dapat dilihat uji ELISA sandwich untuk melihat antibodi hasil serum hiperimun yang di imunisasi menggunakan antigen flagellin dapat digunakan untuk membedakan deteksi antigen flagella dan whole cell. Antibodi primer yang digunakan adalah IgG mencit sedangkan antibodi sekunder yang digunakan adalah IgG kelinci (/4). Terlihat pada grafik bahwa antibodi yang dihasilkan menggunakan imunisasi antigen flagellin memberikan nilai terhadap uji antigen flagellin lebih tinggi jika dibandingkan dengan antigen whole cell sampai enceran antibodi primer /32. Pengenceran antibodi primer yang lebih tinggi dari /32 tidak menunjukkan adanya perbedaan nilai antara antigen whole cell dan antigen flagellin. Hal ini menunjukkan bahwa antigen flagella yang digunakan untuk imunisasi dapat memberikan respon antibodi yang lebih spesifik untuk mendeteksi antigen flagellin jika dibandingkan untuk mendeteksi antigen whole cell /2 /4 /8 /6 /32 /64 /28 antigen /256 /52 /24 /248 negatif wholle cell flagella Gambar. Uji ELISA serum hiperimun yang telah diabsorbsi 777

5 Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 26.2,8,6,4,2 /2 /4 /8 /6 /32 /64 /28 /256 antibodi primer whole cell flagellin Negative Gambar 2. Uji ELISA coating menggunakan serum hiperimun yang diimunisasi antigen flagellin untuk mendeteksi adanya antigen whole cell dan antigen flagellin Serum hiperimun yang diperoleh dari mencit dan kelinci digunakan untuk coating pada uji ELISA untuk mendeteksi adanya mikroorganisme Campylobacter sp. Pada gambar 3, 4 dan 5 dapat dilihat bahwa serum hiperimun yang diperoleh dapat digunakan untuk membedakan adanya Campylobacter sp. yang telah dikultur dalam media broth selama 48 jam, adanya antigen whole cell Campylobacter sp. dan kultur E. coli. Gambar 3 adalah hasil uji ELISA menggunakan antibodi primer α mouse pengenceran /4. Antibody sekunder yang digunakan adalah α rabbit pengenceran /4. Konjugat yang digunakan adalah HRPO anti rabbit /2. Gambar 4 merupakan hasil uji ELISA menggunakan antibody primer α mouse pengenceran /2. Antibodi sekunder yang digunakan adalah α rabbit pengenceran /4. Konjugate yang digunakan adalah HRPO anti rabbit /2. Sedangkan gambar 5 adalah hasil uji ELISA menggunakan antibodi primer α mouse pengenceran /4. Antibodi sekunder yang digunakan adalah α rabbit pengenceran /4. Konjugate yang digunakan adalah HRPO anti rabbit /. Gambar 4, 5, dan 6 memperlihatkan bahwa nilai pada hasil uji antigen whole cell lebih tinggi jika dibandingkan dengan nilai yang dihasilkan pada uji suspensi kultur Campylobacter. Sedangkan hasil uji antigen suspensi kultur E. coli memperlihatkan nilai yang terkecil. Untuk uji ELISA selanjutnya maka digunakan control positif antigen whole cell dan kontrol negatif suspensi E. coli. Antibodi primer yang digunakan untuk coating adalah IgG mouse :4. Antibodi sekunder yang digunakan pada uji selanjutnya adalah IgG rabbit :4, dengan enceran konjugat HRPO anti rabbit :. Sampel yang akan diuji adalah karkas ayam dalam media cair yang telah diinkubasikan selama jam. Sampel karkas ayam diambil dari pasar tradisional dan swalayan di daerah Bandung. Pada tabel. dapat dilihat sample dalam plate yang akan diuji (-32). Pada table 2 dapat dilihat nilai yang dibaca pada ELISA reader dengan filter 44 nm. Nilai yang terbaca kemudian dikonversikan pada kurva baku. Kurva baku pada gambar 6 dibuat berdasar nilai kontrol positif dan nilai Elisa Unit/ EU (24, 52, 256, 28, 64, 32, 6, dan ). Rataan negatif adalah,3, sehingga cut of value yang digunakan adalah pada kontrol positif konsentrasi terendah yang masih memberikan nilai di atas rataan negatif, yaitu,5. Sehingga EU cut of value yang digunakan adalah 76,5. Pada Tabel 4 dapat dilihat sampel karkas ayam yang menunjukkan reaksi postif terkontaminasi C. jejuni. Dari 7 sample yang diuji terdapat sampel yang dinyatakan positif mengandung C. jejuni. 778

6 Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner / /2 /4 /8 /6 /32 /64 /28 konsentrasi antigen suspensi E. coli suspensi campylobacter whole cell Gambar 3. hasil uji ELISA menggunakan antibody primer α mouse /4, antibody sekunder α rabbit /4, dan conjugate / / /2 /4 /8 /6 /32 /64 /28 konsentrasi antigen suspensi E. coli suspensi campylobacter whole cell Gambar 4. hasil uji ELISA menggunakan antibody primer α mouse /2, antibody sekunder α rabbit /4, dan conjugate / / /2 /4 /8 /6 /32 /64 /28 konsentrasi antigen E. coli campylobacter whole cell Gambar 5. hasil uji ELISA menggunakan antibody primer α mouse /4, antibody sekunder α rabbit /4, dan conjugate / 779

7 Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 26 Tabel. Keterangan sample yang diuji, control positif, dan control negative dalam plate A / / neg blanko B /2 /2 neg blanko C /4 /4 neg blanko D /8 /8 neg blanko E /6 /6 neg blanko F /32 /32 neg blanko G /64 /64 neg blanko H /28 /28 neg blanko Tabel 2. Nilai yang dibaca pada filter 44 nm A,9 2,6,82,2,3,3,, 2,7 2,9,4,4 B,6,6,45,43,4,4,3,5 2,3 2,7,5, C 2,3 2,2,24,25,5,5,2,3,9 2,,5,4 D,2,9,34,34,,,,,7,9,4,3 E,75,77,4,37,,,9,9,3,2,4,3 F,32,3,84,8,,,9,8,,65,,4 G,75,88,46,5,,,95,6,4,,2 H,2,8,87,93,,,4,2,, y = x R 2 =.7289 EU Gambar 6. Kurva baku dari nilai kontrol positif (x) dan nilai Elisa unit (y) 78

8 Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 26 Tabel 3. Nilai EU pada plate ,7 65,3-8, , ,9 285,9-92,94-99, ,28-76, ,5 483,6-62, ,5-76, ,62-76,5-9 54, 55,3-29, , ,47 2,48-9, ,3 55, , ,8-42,4 35,54 22, ,3 22, , ,5-79,2-89, ,8 88,25-75,3-8,9 45,424 65, ,3 88,25-43,5-9, , Tabel 4. Sampel karkas yang yang positif terkontaminasi C. jejuni A pos pos neg neg neg neg neg neg pos pos neg neg B pos pos neg neg neg neg neg neg pos pos neg neg C pos pos neg neg pos pos neg neg pos pos neg neg D pos pos neg neg neg neg neg neg pos pos neg neg E pos pos neg neg neg neg pos pos pos pos neg neg F neg neg neg neg neg neg pos pos pos pos neg neg G neg neg neg neg neg neg pos pos pos pos neg neg H neg neg pos pos neg neg pos pos neg neg neg neg Tabel 5. Jumlah sample karkas ayam yang mengandung kontaminan C. jejuni Lokasi pengambilan sampel Pasar tradisional A Pasar tradisional B Pasar tradisional C Swalayan D Swalayan E Swalayan F Swalayan G Jumlah sampel karkas ayam Jumlah sampel Positif 6 2 Persentase (%) ,7 KESIMPULAN. Metode ELISA sandwich pada penelitian ini dapat mendeteksi adanya antigen whole cell, suspensi kultur C. jejuni, serta dapat membedakan kultur non Campylobacter. 2. Antibodi primer IgG mouse :4, antibodi sekunder IgG rabbit : 4 dan 78

9 Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 26 konjugat HRPO goat anti rabbit : memberikan respon nilai yang tertinggi. 3. Sebanyak 7 sample karkas ayam yang diambil dari pasar tradisonal maupun swalayan terkontaminasi C. jejuni 5,7%. DAFTAR PUSTAKA ALTEKRUSE, S.F Campylobacter jejuni in Foods. JAVMA 23(2): BAILEY, J.S Control of Salmonella and Campylobacter in Poultry Production. A Summary of Work at Research Center. Poult. Sci. 72: BLACKBURN, C.W. dan P.J. CLURE. 23. Campylobacter dan Arcobacter. In: Foodborne pathogens. Hazards, risk analysis and control. CRC Press. New York. CDC (Centers for Disease Control and Prevention). 2. New Concerns About Bacterial Contamination of Poultry. HARLOW, E. and D.P. LANE Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. KRAMER, J.M., J.A. FROST, F.J. BOLTON and D.R.A. WAREING. 2. Campylobacter Contamination of Raw Meat and Poultry at Retail Sale: Identification of Multiple Types and Comparison With Isolates From Human Infection. J. Food Prot. 63(2): ROSENTHAL, T.M Reducing Bacterial Contamination Through Vaccination on The Farm. In: Infectious Disease in Children. LINDQVIST, R., Y. ANDERSON, B. JONG and P. NORBERG. 2. A. Summary of Reported Foodborne Disease Incidents in Sweden J. Food Prot. 63(): SHANE, S.M. 99. Campylobacterioses. In Disease of Poultry. 9 th Ed. Iowa State University Press. Ames, Iowa pp SMITH, J.L Determinants that may be involved in virulence and disease in Campylobacter jejuni. J. Food Safety 6: UPTON, M Relationship Between Pathogen Growth and The General Microbiota an Raw and Poultry. J. Food Safety 5: