METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Bahan dan Alat

Transkripsi

1 27 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian proyek Hibah Penelitian Strategis Nasional di bidang gizi dan kesehatan yang diketuai oleh Marliyati (2009) dan dibiayai oleh DIKTI. Penelitian dilaksanakan pada bulan September sampai bulan November Tempat yang digunakan untuk melakukan penelitian ini adalah Pusat Penelitian dan Pengembangan Gizi dan Makanan di Jalan Dr. Semeru No. 63 Bogor. Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan adalah mi instan wortel dan mi instan RPO. Mi wortel diperoleh dari hasil penelitian Rahayu (2009) dan mi RPO diperoleh dari hasil penelitian Rucita (2010). Selanjutnya, bahan yang diperlukan yaitu hewan percobaan tikus putih Sprague dawley, jenis kelamin jantan, umur 1,5-2 bulan, bobot badan awal berkisar antara gram. Bahan makanan yang diberikan kepada tikus adalah makanan standar berdasarkan Pusat Penelitian Pengembangan Gizi dan Makanan Depkes. Komposisi dan cara pembuatan ransum standar dapat dilihat pada Lampiran 1. Selain itu, digunakan juga bahan untuk analisis IgG metode ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) yaitu larutan pereaksi antara lain Coating Buffer, larutan Stock PBS (Phosphatase Buffer Saline ph = 7,0), larutan Blocking, larutan pencuci, larutan substratpewarna, dan Stopping Solution. Metode ELISA cukup sensitif dan reagennya mempunyai half life yang lebih panjang dibandingkan dengan metode lainnya. Selain itu, tidak mengandung bahaya radioaktif. Bahan yang digunakan untuk mengekstrak retinol dari hati dan plasma tikus antara lain KCl 1,15%, heksan dan 2-propanol (3:2), Natrium sulfat 0,9%, KOH 5% dalam metanol, dan mobile phase yang digunakan yaitu campuran metanol dan asetonitril (1:1). Retinol standar yang digunakan adalah retinil palmitat. Prosedur ekstraksi plasma dan hati tikus disajikan pada Lampiran 2 dan Lampiran 3. Alat-alat yang diperlukan yaitu alat untuk analisis IgG metode ELISA, alat untuk analisis kadar retinol serum dan kadar retinol hati yaitu HPLC system menggunakan UV detector, warring blender, biohomogenizer, vortex dan labu volumetrik, timbangan, serta alat-alat pemeliharaan tikus (kandang, botol minum, tempat makan, timbangan pegas dan lain-lain). Untuk lebih jelasnya, prosedur

2 28 analisis kadar Imunoglobulin G (IgG) serum metode ELISA dapat dilihat pada Lampiran 4. Metode Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental dengan percobaan di laboratorium. Penelitian ini merupakan sebagian dari proyek Hibah Penelitian Strategis Nasional di bidang gizi dan kesehatan. Pada penelitian ini dilakukan pemberian mi instan yang telah diperkaya karoten (tepung wortel/rpo) dan ransum standar kepada tikus selama 8 minggu. Kemudian diamati bobot badan (2 hari sekali), retinol serum (baseline dan endline), retinol hati (baseline dan endline), dan respon imun (Imunoglobulin G) setiap 2 minggu sekali. Pembuatan dan Pemberian Ransum Standar Pembuatan ransum standar tikus percobaan mengikuti Puslitbang Gizi dan Makanan Bogor. Pemberian ransum dilakukan setiap hari sebanyak gram per ekor secara ad libitum. Ransum Mi Mi wortel diperoleh dari hasil penelitian Rahayu (2009) dan mi RPO diperoleh dari hasil penelitian Rucita (2010). Pemberian ransum mi, baik mi wortel maupun mi RPO, dilakukan setiap hari dengan cara meletakkan mi di atas ransum standar. Jumlah mi yang diberikan baik mi wortel maupun mi RPO sama untuk setiap kelompok tikus perlakuan (SW dan SR). Mi diberikan sebesar 20% dari berat total ransum standar. Mi dianggap sebagai makanan tambahan. Penyiapan Hewan Percobaan Persiapan dan perlakuan hewan percobaan mengikuti Sobariah (2007). Hewan percobaan menggunakan tikus putih (SD) dengan persyaratan : tikus sehat, usia sekitar 6-8 minggu (1,5-2 bulan) dengan bobot badan berkisar antara gram, jenis kelamin jantan. Hewan percobaan diperoleh dari Pusat Penelitian dan Pengembangan Gizi dan Makanan, Depkes, Bogor. Masing-masing kelompok terdiri atas 14 ekor tikus, sehingga jumlah total tikus yang digunakan adalah 42 ekor. Sebelum tikus percobaan dikelompokkan, terlebih dahulu dilakukan seleksi berdasarkan bobot badan, sehingga variasi bobot badan antar kelompok dan variasi bobot badan dalam satu kelompok tidak menyimpang jauh. Jenis tikus serta kandang yang digunakan dapat dilihat pada Gambar 7.

3 29 Gambar 7 Tikus percobaan dan kandang Bobot Badan Hewan Percobaan Pemantauan bobot badan tikus selama masa perlakuan dilakukan setiap 2 hari sekali dengan tujuan untuk memonitor bobot badan tikus. Pengukuran bobot badan tikus dilakukan dengan menggunakan timbangan pegas dan diukur dalam satuan gram. Pemeriksaan Retinol Serum, Retinol Hati, dan Imunoglobulin G Setelah adaptasi selama 7 hari hewan coba diambil 6 ekor (masingmasing 2 ekor dari setiap perlakuan) secara acak untuk dibius, dibedah dan diambil darahnya dari jantung untuk pemeriksaan retinol serum awal dan IgG serum awal, serta diambil hatinya untuk pemeriksaan retinol hati awal. Pada hari ke delapan (hari pertama perlakuan) semua tikus disuntik dengan Tetanus Toksoid (TT) sebanyak 0,1 ml, yang berguna untuk membangkitkan respon imun (IgG) pada tubuh tikus. Selanjutnya setiap dua minggu, 3 ekor tikus dari masingmasing kelompok perlakuan diambil secara acak untuk diambil darahnya untuk pemeriksaan IgG serum. Pemeriksaan retinol serum dan hati akhir dilakukan di akhir penelitian (endline). Pengambilan Darah dan Purifikasi Serum Darah Pengambilan darah sebanyak 3-5 ml dilakukan pada jantung tikus dengan membius dan membedah tikus menggunakan syringe steril dengan wing needle sekali pakai oleh petugas laboratorium berpengalaman. Selanjutnya darah dimasukkan ke dalam tabung berisi EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) runtuk mencegah penggumpalan darah, kemudian disentrifuse untuk memisahkan serum dengan plasma dengan alat refrigerated sentrifuge pada 2500 rpm selama 20 menit pada suhu 4 o C. Kemudian serum disimpan pada suhu -70 o C sebelum dilakukan analisis. Pengambilan sampel darah tikus sebanyak 2 kali, yaitu sebelum dan sesudah perlakuan untuk pemeriksaan retinol serum awal dan akhir penelitian.

4 30 Untuk lebih jelas, prosedur analisis kadar retinol serum dapat dilihat pada Lampiran 5. Selain itu dilakukan pengambilan darah setiap 2 minggu sekali untuk pemeriksaan IgG. Pengambilan darah sebelum perlakuan (baseline) dilakukan pada 6 ekor tikus yang diambil secara acak yang mewakili setiap kelompok perlakuan, sedangkan pengambilan darah setiap 2 minggu untuk pemeriksaan IgG dilakukan masing-masing pada 3 ekor tikus untuk masing-masing perlakuan. Untuk lebih jelasnya, skema alur penelitian dapat dilihat pada Gambar ekor tikus jantan Adaptasi selama 7 hari (diberi ransum standar) Hari ke-7, 6 ekor tikus dibius, dibedah untuk pemeriksaan retinol serum, retinol hati, dan IgG. Hari ke-8 sisa tikus disuntik TT 0,1 ml, ditimbang, dibagi menjadi 3 kelompok berdasarkan bobot badan Kelompok K Kelompok SW Kelompok SR (Ransum Standar) (Ransum Standar + Mi Wortel) (Ransum Standar + Mi RPO) 1. Pemberian makanan serta pencatatan sisa ransum standar dan ransum mi dilakukan setiap hari. 2. Penimbangan bobot badan dilakukan setiap 2 hari sekali. 3. Pembedahan tikus dilakukan 2 minggu sekali (3 ekor setiap kelompok perlakuan) untuk analisis IgG. 4. Analisis retinol serum dan retinol hati dilakukan sebelum perlakuan dan pada akhir perlakuan. Gambar 8 Skema alur penelitian

5 31 Pengambilan Hati Tikus Tikus dibius dan dibedah untuk diambil hatinya. Hati ditimbang beratnya selanjutnya diekstraksi untuk kemudian dianalisis. Untuk lebih jelasnya, prosedur ekstraksi hati tikus dapat dilihat pada Lampiran 3. Pengolahan dan Analisis Data Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tiga kali ulangan. Model rancangan percobaan tersebut adalah sebagai berikut : Y ij = μ + τ i + ε ij Keterangan : Y ij = respon dari pengaruh perlakuan ke-i pada ulangan ke-j µ = rataan umum τ i = pengaruh perlakuan ke-i ε ij = galat dari pengaruh perlakuan ke-i pada ulangan ke-j i = Banyaknya perlakuan (i = 1, 2, 3) j = Banyaknya ulangan (j=1, 2, 3) Semua data yang diperoleh ditampilkan dalam bentuk nilai rata-rata ± standar error (Mean ± SD). Selanjutnya data dianalisis dengan uji statistik Analysis of Variance (ANOVA) atau sidik ragam untuk mengetahui pengaruh perlakuan yang digunakan. Bila terdapat perbedaan nyata antara perlakuan, maka dilanjutkan dengan uji beda Duncan Multiple Range Test (DMRT). Data diolah dengan menggunakan Microsoft Excel 2007 dan SPSS 16.0 for Windows.