Latar Belakang VAKSIN. Colony Forming Unit ( CFU) Metode Alternatif

Transkripsi

1

2 Latar Belakang VAKSIN KUALITAS & STABILITAS JUMLAH BAKTERI HIDUP PREVENTIF Colony Forming Unit ( CFU) Metode Alternatif 1. Waktu pengujian yang lama 2. Tergantung pada medium pertumbuhan >> waktu inkubasi hingga 5 pekan. Pengembangan & Validasi metode ATP Metode ATP- Bioluminesens Belum ada laporan Validasi metode

3 Metode ATP-Bioluminesens Reaksi Enzimatik ( Sistem Luciferin- Luciferase) dengan ATP : Luminometer :

4 SAMPEL Vaksin BCG SSI Danish strain vial >> 0.75mg BGC liofilisasi & 3.75mg Na.glutamat Low Viability Sample Suhu 37 C selama 28 hari Intermediate Viability Sample Suhu 2-8 C selama bulan. High Viability Sample Suhu 2-8 C selama 1-3 bulan.

5 2. Reagen : Medium Dubos (0.045% Tween & 0.5% Bovine Albumin) Reagen ATP-SL ( rekonstitusi dengan 10 ml aqua pro injectione) Dapar Tris-asetat 0.1 M (dengan 2 mm EDTA, ph 7.75) ATP-Standar, 1 x 10-5 M. Sauton SSI encer. Apyrase Larutan Kerja Larutan Kerja Standar

6 METODE ANALISIS 1. Penetapan ATP dalam Vaksin BCG - Ekstraksi ATP, sampel tanpa inkubasi - Ekstraksi ATP, sampel dengan pre-inkubasi 37 C. - Pengukuran ATP 2. Penetapan CFU 3. Korelasi antara ATP CFU 4. Validasi metode dengan tahapan Pre-inkubasi. 5. Analisis data

7 1. Penetapan ATP 1 vial Vaksin BCG µl sauton SSI dan 100 µl Apyrase. Didiamkan 10 menit. Ekstraksi ATP (tiap vial 3 x 100 µl suspensi BCG) dengan Buffer Tris-Asetat dengan EDTA ( 3 x 500 µl ) yang sebelumnya dipanaskan pada suhu C. Campuran BCG-Buffer dijaga pada suhu C selama 6 menit, ekstrak lalu didinginkan pada suhu kamar. Ekstraksi ATP Tanpa Inkubasi Dengan Preinkubasi 24 jam, 37 C Pengukuran ATP 1 vial vaksin BCG ml Media pertumbuhan mikroba ( Medium Dubos dengan Tween dan Bovine Albumin ), Nitrogen dialirkan selama menit, vial ditutup. Inkubasi 24 jam suhu 37 C sebelum ATP diekstraksi. Prosedur ekstraksi ATP, mengikuti prosedur ekstraksi ATP tanpa inkubasi.

8 Pengukuran ATP Ekstrak ATP ( 100 µg Suspensi BCG µl buffer) Blanko (100 µl Sauton/Apyrase atau medium Dubos) 10/20µl Larutan ATP Standar Suhu 25 C, signal 10 detik ( mv x 10 detik ) 100 µl reagen ATP Konsentrasi standar x mol ATP Diukur dengan Luminometer 1251 Reagen ATP Output RLU (Relative Light Unit) >> ng ATP

9 2. Penetapan CFU 8 vial BCG, direkonstitusi dengan Sauton SSI hingga diperoleh konsentrasi 0.75mg BCG/ml. 3 seri pengenceran diinokulasikan pada Medium Lowenstein-Jansen, diinkubasi pada suhu 37 C selama 5 pekan dan kemudian dihitung jumlah CFU.

10 3. KORELASI ATP -CFU Tujuan : Melihat hubungan viabilitas sampel lyophilised BCG dengan berbagai level berbeda hasil pengukuran dengan metode ATP dan CFU Sampel BCG tidak.di pre-inkubasi dalam media pertumbuhan sebelum pengukuran ATP. Samples (n = 43) : viabilitas rendah : viabilitas tinggi Korelasi positif ( P < 0.01) koefisien korelasi r = 0.53 Untuk pengukuran dengan metode ATP : overlapping antara viabilitas rendah dan tinggi

11 3. KORELASI ATP -CFU Sampel BCG di pre-inkubasi dalam media pertumbuhan selama 24 jam sebelum pengukuran ATP. Samples (n = 43) : viabilitas rendah : viabilitas sedang : viabilitas tinggi Korelasi positif ( P < 0.01) koefisien korelasi r = 0.93 Metode pengukuran ATP dengan pre-inkubasi dalam media pertumbuhan meningkatkan korelasi antara ATP-CFU secara signifikan

12 4. Validasi Metode dengan Tahapan Preinkubasi 1. Robustness 2. Linearitas dan Rentang 3. Akurasi 4. Presisi

13 1. Robustness (Kekuatan) Tujuan Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode dengan cara dibuat perubahan metode dengan kondisikondisi tertentu, apakah berbagai faktor tersebut berpengaruh terhadap respon yang dihasilkan. Prosedur Desain Faktorial (Software statistik JMP 6.0) Menggunakan 16 vial Vaksin BCG dengan Intermediate Viability Terdiri dari 8 faktor kondisi percobaan dengan 2 level

14 Desain Percobaan Robustness Faktor A. Pre-Inkubasi Vial airing time before incubation Incubation temperature Incubation time ph in Dubos medium Level 5 or 30 min 35 or 39 C 21 or 27 h ph 6.6 atau 7.0 B. Ekstraksi ATP Time to preheat extraction buffer Extraction buffer temperature Heat treatment time Covering cuvettes during extraction 10 or 20 min 97 or 100 C 5 or 10 min With or without

15 Hasil Robustness Untuk masing-masing faktor, metode menunjukkan robust di masing2 level percobaan α =0.05, tidak ada perbedaan yang signifikan pada masing2 hasil pengukuran ATP di berbagai kondisi percobaan

16 2. Linearitas dan Rentang Linearitas Kemampuan metode analisis untuk memperoleh hasil uji yang proporsional (sepadan) terhadap konsentrasi analit dalam sampel dan dalam rentang konsentrasi yang digunakan. Rentang Menunjukkan nilai terendah dan tertinggi hasil pengujian yang dapat ditentukan dengan cermat dan seksama.

17 Prosedur Linearitas Linearitas Linearitas Standar ATP Dibuat Variasi Konsentrasi Standar ATP dengan rentang x10-12 mol ATP per kuvet Linearitas ATP yang diekstrak dari BCG Total konsentrasi BCG (bakteri hidup dan mati) dalam sampel dibuat konstan dengan penambahan BCG yang telah dimatikan dengan pemanasan dan hanya konsentrasi ekstrak ATP yang dibuat bervariasi.

18 Linearitas ATP yang diekstrak dari BCG 500µl Buffer Tris- EDTA Untuk Vial Suspensi BCG dengan volume : 20 µl 40 µl 60 µl 80 µl Volume dibuat konstan dengan penambahan BCG yang telah dimatikan dengan pemanasan ATP standar dengan rentang konsentrasi x mol ATP/kuvet untuk mengkonversi respon BCG- ATP ke dalam mol-atp total100 µl suspensi BCG

19 Hasil Linearitas 1. Kurva Linearitas ATP standar x10-12 mol ATP -> Koefisien Korelasi r 0,99 (kurva tidak ditampilkan) 2. Kurva Linearitas ATP yang diekstrak dari BCG dengan viabilitas yang berbeda pada konsentrasi BCG konstan -> Koefisien Korelasi r 0,99

20 Hasil Rentang Kurva ATP standard dengan rentang konsentrasi x mol ATP menghasilkan respon dibawah konsentrasi standar (pada vial dengan low viability dengan volume terkecil ) dan respon diatas konsentrasi standar pada vial dengan high viability dengan volume terbesar. Rentang pengukuran adalah tidak kurang dari x mol ATP untuk 100 µl suspensi BCG atau setara dengan x mol ATP per vial vaksin

21 3. AKURASI Tujuan Untuk mengukur ketepatan atau kedekatan hasil pengujian dengan hasil yang sebenarnya. Prosedur 1. Menggunakan 15 sampel baru yang di pre-inkubasi 2. Hasil yang didapat kemudian dibandingkan dengan data korelasi antara ATP dengan jumlah CFU 3. Dibuat kurva regresi linier dengan derajat kepercayaan 95%. 4. Data hasil 15 sampel baru kemudian diplotkan tehadap kurva korelasi yang telah ada.

22 Hasil Akurasi

23

24 Hasil Akurasi Terdapat korelasi positif yang signifikan dengan nilai P < , r = Perhitungan hubungan antara metode ATP dan CFU : log (CFU) = LOG (ATP) atau CFU = ATP 1.398

25 4.Presisi Definisi Tingkat kesesuaian antara hasil pengujian individual dengan rata-rata hasil pengujian berulang Prosedur 1. Presisi dilakukan oleh 3 analis dalam 3 hari 2. Desain faktorial dilakukan untuk menguji repeatability dan intermediate precision dari sampel dengan low viability dan high viability. 3. Repeatability: pengujian dengan 2 sampel (2x8 vial), diukur koefisien variasinya (CV) untuk repeatability. 4. Intermediate precision: Data dari desain percobaan dianalisa, dihitung sesuai dengan perhitungan intermediate precision.

26 Hasil Presisi

27 Hasil Presisi Low Viability 1. Repeatability : 5.5% 2. Intermediate Precision : 15% High Viability 1. Repeatability : 5.1% 2. Intermediate Precision : 9.0%

28 Parameter dan Hasil Validasi Hasil Syarat Akurasi >70% Presisi -Repeatability 5,1%-5,5% Cfu/plate <15% -Intermediate 9%-15% <25% Precision <10 <35% Linearitas 99% r > 099 >95% Robustness Statistik tidak berbeda signifikan

29 Kesimpulan Metode ATP dengan pre-inkubasi memiliki tingkat kecepatan (rapid), kekuatan (robust), ketepatan (akurasi) dan keseksamaan (presisi) yang baik untuk mengetahui estimasi dari BCG viability. Metode ATP telah sesuai untuk tujuan pengujian rutin quality control BCG.

30 LOGO