Slamet Ibrahim, Marlia Singgih Sekolah Farmasi-ITB

Transkripsi

1 VALIDASI METODE ANALISIS MIKROBIOLOGI Slamet Ibrahim, Marlia Singgih Sekolah Farmasi-ITB

2 PENDAHULUAN Prinsip Praktek Pengujian yang Baik (Good Analytical Practices) ) : a. Pengujian dilakukan untuk memenuhi suatu tujuan tertentu atau kebutuhan pengguna b. Pengujian dilakukan dengan menggunakan metode, prosedur dan peralatan yang telah teruji untuk menjamin kesesuaian dan tujuan pengujian c. Pengujian dilakukan oleh personel yang

3 d. Hasil pengujian harus ajeg atau konsisten, tidak dipengaruhi oleh faktor lokasi, personel dan peralatan e. Laboratorium penguji harus mempunyai prosedur jaminan dan pengendalian mutu yang memadai f. Laboratorium penguji harus diuji dan dievaluasi oleh badan yang kompeten dan tidak memihak (akreditasi)

4 Validasi Metode Analisis Definisi : Validasi Metode Analisis adalah proses pembuktian atau konfirmasi pengujian yang obyektif di Laboratorium, dan bahwa metode itu memenuhi persyaratan yang telah ditentukan,, yang sesuai dengan tujuan penggunaannya.

5 Validasi Metode Analisis (lanjutan) Tujuan : Mengevaluasi kinerja metode : kepekaan, selektivitas, akurasi, presisi, dll., sekaligus menguji kelemahan dan keterbatasan metode Menguji faktor-faktor yang dapat mempengaruhi kinerja metode dan mengetahui besarnya pengaruh itu terhadap hasil analisis Melakukan verifikasi atau membuktikan kinerja metode analisis baku yang

6 Validasi Metode Analisis (lanjutan) Syarat : Menggunakan instrumen dan peralatan yang terkalibrasi Dilaksanakan oleh pesonel yang kompeten

7 Jenis Validasi Metode Validasi primer dilakukan jika laboratorium menggunakan metode analisis baru hasil pengembangan, atau metode yang di modifikasi terhadap suatu metode standard. Validasi sekunder dilakukan untuk verifikasi, jika laboratorium menggunakan atau mengadopsi metode standard yang telah divalidasi.

8 Parameter Validasi metode analisis mikrobiologi Akurasi Kecermatan Presisi (repeatability( repeatability, reproducibility dan intermediate precision) Keseksamaan Sensitivitas Kepekaan Selektivitas dan Spesifisitas Linearitas Rentang Hitung yang diterima (acceptable)) (batas atas dan batas bawah dari rentang perhitungan) Robustness (Ketangguhan) metode

9 Pedoman Validasi The United States Pharmacopeia (USP) 27, 2004 or new edition International Conference on Harmonization, 1996 Method Validation of Microbiological Methods, guidance note : C & B and ENV 002, Singapore Accreditation Council, July Feldsine, et.al.,., AOAC International method Committee Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Method of Analysis, Journal of AOAC International

10 Water quality Guidance on Validation of Microbiological Methods, Technical Report, ISO/TR : Procedure for The Estimation and Expression of Measurement Uncertainty in Chemical Analysis, Nordic Committee on Food Analysis, NMKL, No.5, APHA Standard methods for the Examination of Water and Wastewater, 20th ed., 1998.

11 Metode analisis mikrobiologi 1. Metode analisis KUALITATIF 2. Metode analisis KUANTITATIF

12 Metode kualitatif Metode analisis yang responsnya berupa presence atau absence (ada( atau tidak ada) ) yang dideteksi baik secara langsung maupun tidak langsung terhadap sejumlah sampel

13 Metode kuantitatif Metode analisis yang responsnya berupa jumlah dari analit, baik yang diukur secara langsung (misalnya : enumerasi mikroba) maupun secara tidak langsung (misalnya : Nilai Absorbans, intensitas warna, impedansi, dll) terhadap sejumlah sampel.

14 Kualitatif : Metode Analisis Mikrobiologi Uji langsung terhadap mikroba indikator Metode kultur untuk identifikasi makroskopik dan mikroskopik Metode alternatif (Dye( Dye-reduction Test, Electrical Methods, ATP Determination) Metode Cepat deteksi mikroba spesifik dan toksinnya (metode imunokimia, metode biologi molekuler) Kuantitatif : Angka Lempeng Total (Total( Plate Count) MPN (Most( Probable Number) Uji potensi antibiotik Uji sterilitas Uji koefisien fenol (uji desinfektan dan antiseptik) Uji efektivitas pengawet

15 Identifikasi Mikroorganisme Escherichia coli Salmonella thypi

16 Identifikasi mikroba

17 Tahap Persiapan Validasi Sebelum validasi dilakukan, hendaknya laboratorium menyediakan atau menyiapkan beberapa hal : 1. Mikroorganisme target atau acuan (lihat SR-02 : persyaratan tambahan untuk akreditasi laboratorium, Pengujian Kimia dan Biologi SNI 17025, DP.01.16, Januari 2004) 2. Peralatan dan Instrumen ukur yang telah dikalibrasi 3. Personel yang kompeten 4. Program Statistika untuk menghitung, mengevaluasi dan menginterpretasikan hasil

18 Parameter Validasi

19 Akurasi (Kecermatan) Definisi : Akurasi adalah kemampuan metode untuk mengukur dan mendeteksi nilai aktual atau nilai sebenarnya dari mikroorganisme target dalam sampel Akurasi merupakan ukuran ketepatan atau kedekatan hasil pengujian dengan hasil yang sebenarnya

20 Akurasi (Kecermatan) (lanjutan Perhitungan : lanjutan) Rekoveri (Recovery)) = Persen perolehan kembali % Rek = H/A x 100 Galat Relatif : (H A)/A x 100 dimana H = hasil pengujian dengan metode A = hasil sebenarnya dari mikroorganisme target Rekoveri Relatif : H/B x 100 dimana H = hasil pengujian metode B = hasil pengujian metode standard

21 Akurasi (Kecermatan) (lanjutan) Cara pengujian : Spiked-placebo placebo Recovery Method Standard Addition Method Menggunakan 9 kali pengukuran ( 3 level konsentrasi dengan 3 replikasi)

22 Contoh Perhitungan Akurasi dan Rekoveri Metode Jumlah angka lempeng total Galur Teoritis Metode uji Metode Baku I II III IV V Rata-rata

23 Perhitungan % Rekoveri = Hsl.metode uji/hsl teoritis x 100% = 125/125 x 100% = 100% % Rekoveri relatif = Metode uji/metode baku x 100% = 125/125 x 100% = 100%

24 Presisi (Keseksamaan) Definisi Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil pengujian individual dengan hasil rata-rata pengujian berulang pada sampel yang homogen dengan kondisi pengujian yang sama Presisi : keterulangan (repeatability), ketertiruan (reproducibility), keseksamaan antara (intermediate precision)

25 Presisi (Keseksamaan) (lanjutan lanjutan) Cara Perhitungan Simpangan baku relatif (SBR = Relative Standard Deviation=RSD) untuk intermediate precision : [(log ai log bi )/xi xi] 2 2 p ai dan bi : hasil pengujian i (1,2,3, n) + log bi) diuji xi = rata-rata = 1/n (log ai P = jumlah sampel yang

26 Contoh Perhitungan Intermediate Precision pada ALT (angka( lempeng total) No. ALT (cfu/ml( cfu/ml) logaritma (II/I) 2 a b a b rata2 (I) selisih(ii) ,9685 0, ,9345 1,9515 0, ,5315 1,4771 1,5043 0,0544 0, ,9912 1,8633 1,9273 0,1279 0, ,9494 1,9191 1,9342 0,0303 0, ,0645 2,0170 2,0407 0,0475 0, ,2253 2,1931 2,2092 0,0322 0, , ,7924 1,7482 1,7703 0, ,5798 1,4472 1,5135 0,1326 0, ,5185 2,4771 2,4978 0,0414 0, ,3617 3,3096 3,3357 0, , = 0, SBR = 0,015832/2 x 10 = 0,0281 KV = 100 x SBR = 2,81 %

27 Sensitifitas dan Spesifisitas Definisi Sensitifitas (Kepekaan)) : Kemampuan metode untuk mendeteksi/mengukur mikroorganisme target dalam jumlah sekecil mungkin Spesifisitas (Kemenjenisan): Kemampuan metode untuk mendeteksi/mengukur mikroorganisme tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya mikroorganisme asing atau bahan/matriks lain

28 Sensitifitas dan Spesifisitas (lanjutan) Cara perhitungan Sensitifitas : Fraksi koloni/kultur yang positif pada uji konfirmasi terhadap pengujian presumtif Spesifisitas : Fraksi koloni/kultur yang negatif pada uji konfirmasi terhadap pengujian presumtif Selektifitas : Logaritma fraksi koloni/kultur yang positif pada uji konfirmasi terhadap jumlah pengujian

29 Sensitifitas dan Spesifisitas (lanjutan) Uji Presumtif positif (+) negatif (-) Jumlah Uji Konfirmatif Positif (+) a b a + b Negatif (-) c d c + d Jumlah uji a + c b +d a+b+c+d =n Sensitifitas itas = a/(a+b) Spesifisitas = d/(c+d) Rasio positif palsu = c/(a+c) Rasio negatif palsu = b/(b+d) Efisiensi = (a+d)/n( Selektifitas absolut = RS = log (a/n) Selektifitas apparent = F = log [(a+c)/n]

30 Contoh Jumlah Uji Presumtif positif (+) negatif (-) Uji Konfirmatif Positif (+) 250(a) 8(b) 258 Negatif (-)) 20(c) 120(d) 140 Jumlah uji Sensitifitas itas = a/(a+b) = 250/258 = 0,97 Spesifisitas = d/(c+d) = 120/140 = 0,86 Rasio positif palsu = c/(a+c) = 20/270 = 0,07 Rasio negatif palsu = b/(b+d) = 8/128 = 0,06 Efisiensi = (a+d)/n( = 370/398 = 0,93 Selektifitas apparent = F = log [(a+c)/n a+c)/n] ] = log 270/398 =

31 Rentang Hasil Pengujian Rentang menunjukkan nilai terendah dan tertinggi hasil pengujian yang dapat ditentukan dengan cermat dan seksama Batas terendah (Lower limit) Hasil analisis / pengujian terendah yang ditandai dengan galat analisis 20,0% dari rata-rata (pengukuran( minimal 3 kali)

32 Contoh ALT (cfu/lempeng ALT relatif(%) cfu/lempeng) Galat Galat baku Galat 10 3,16 31,6 15 3,87 25,8 20 4,47 22,8 25 5,00 20,0 27 5,20 19,2 29 5,39 18,6 30 5,48 18,3

33 Batas tertinggi (Upper limit) Hasil analisis /pengujian koloni tertinggi yang masih dapat dihitung dengan cermat dan seksama ditandai dengan galat analisis 15,0% dari rata-rata (pengukuran( minimal 3 kali) 2.LC HC-1 1,96 [ 2.LC HC ] 1/2 Rentang hasil pengujian (lempeng agar) Sampel makanan dan obat-obatan obatan : cfu/lempeng Sampel air : cfu/lempeng Kapang (Aspergillus niger) ) : koloni/lempeng

34 Linearity (Kelinieran( Kelinieran) (untuk penetapan potensi antibiotika) Definisi Keliniearan adalah kemampuan metode analisis yang menunjukkan bahwa larutan sampel yang berada dalam rentang konsentrasi memiliki respon analit yang proporsional dengan konsentrasi, secara langsung ataupun melalui transformasi matematika Cara pengujian Kurva baku disiapkan dan dianalisis 3 kali dengan konsentrasi antara % kadar aktual (FDA), untuk penentuan kadar dalam sampel, tiga larutan baku digunakan : 80, 100 dan 120% konsentrasi target

35 Linearity (Kelinieran( Kelinieran) (lanjutan) Parameter Kurva baku, dengan persamaan garis (regresi linear, logaritma atau polinomial) Kepekaan analisis, F = y/ x untuk setiap konsentrasi pada kurva baku Simpangan baku residual garis regresi Sy/x = [ (y[ (y-ŷ) 2 /n-2] 1/2 dimana y = respon analit ŷ = dihitung dari persamaan garis regresi

36 Linearity (Kelinieran( Kelinieran) (lanjutan) Koefisien variasi fungsi regresi V x0 = S y/x. 100%, (V x0 2%) b. x Koefisien korelasi ( r 0,999)

37 Linearity (Kelinieran( Kelinieran) (lanjutan) Perhitungan Kadar Diameter Hambat x x x x x Log Ci a. Menggunakan persamaan garis D = b log C + a log Cs = Ds a/ b dimana : Cs = kons. analit dlm sampel Ds = Diameter hambat b. Menggunakan satu larutan baku dan larutan blangko log Cs = (Ds a)/(db a). log Cb dimana : Cb = kons. analit dlm lar.baku

38 Syarat sampel untuk uji validasi Untuk metode analisis kualitatif, sampel yang digunakan terdiri dari 3 macam sampel : sampel yang tidak dikontaminasi, sampel yang sengaja dikontaminasi pada jumlah yang mendekati batas limit deteksi (Low Contamination Level), sampel yang sengaja dikontaminasi pada jumlah yang tinggi (High Contamination Level) Low contamination level : cfu/25 g sampel sedangkan high contamination level : cfu/25 g sampel

39 Untuk metode analisis kuantitatif, maka sampel dibagi 4, yaitu : 1 sampel tanpa diinokulasi, dan 3 sampel masing-masing dengan low, medium dan high contamination level. Low : pada batas limit deteksi Medium : kira-kira dengan jumlah 1 log lebih tinggi High : kira-kira dengan jumlah 2 log lebih tinggi

40 Validasi Kit Pereaksi Pertimbangan dalam memilih kit pereaksi tidak semata mata dari aspek ekonomi, tetapi termasuk : Kemudahan penanganan sampel dan pereaksi yang digunakan, Cara penyimpanan dan stabilitas pereaksi Tingkat toksisitas pereaksi Kualitas hasil reaksi yang diberikan oleh kit tersebut.

41 Tahapan dalam proses evaluasi kit Tahap I : Seleksi awal, yaitu mencakup evaluasi terhadap kurva standard, ada tidaknya reduksi data, evaluasi terhadap sensitivitas pereaksi, Tahap II : Pemahaman prosedur penggunaan kit, yaitu untuk mengevaluasi kemungkinan efek matriks, perolehan kembali, reaksi silang, ada tidaknya interferensi, kemudahan penanganan sampel dan pereaksi Tahap III : Pengembangan data validasi, yaitu evaluasi terhadap rentang normal hasil reaksi, uji pada kondisi abnormal, adanya stimulasi atau supresi, dan uji terhadap rentang kontrol kualitas. Tahap II Tahap III

42 Robustness (Ketangguhan( Ketangguhan) metode Pengujian Ketangguhan sebenarnya harus dilakukan pada saat fase pengembangan metode dan tergantung pada faktor-faktor yang berpengaruh pada pengujian Jika pengujian sangat peka terhadap perubahan dalam kondisi analisis,maka kondisi pengujian hendaknya dikendalikan atau dilakukan dengan penuh kehati- hatian

43 Robustness (Ketangguhan( Ketangguhan) metode (lanjutan) Jenis keragaman kondisi pengujian yang harus diperhatikan : Stabilitas sampel Pengaruh suhu inkubasi Pengaruh waktu inkubasi Kondisi aerobik atau anaerobik (untuk pengujian mikroba tertentu) Pengaruh jenis media (nutrisi( nutrisi), dll

44 Robustness (Ketangguhan( Ketangguhan) metode (lanjutan) Hasil pengujian dievaluasi secara Statistika menggunakan ANOVA atau Algoritma dari Yate