Teknologi Fermentasi. Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy Insitut Teknologi Bandung

Transkripsi

1 Teknologi Fermentasi Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy Insitut Teknologi Bandung

2 Pendahuluan Istilah Fermentasi asal kata : fervere berarti mendidih Penggunaan dalam bidang mikrobiologi

3 Proses umum fermentasi Raw Material Sel mikroba Sterilisasi Penyiapan inokulum Fermentasi By product Pemisahan Penghancuran sel Isolasi & purifikasi Pengolahan limbah Formulasi

4 Parameter yang menentukan Mikroorganisme Substrat Produk Kondisi fermentasi Bioreaktor Tahap Isolasi dan purifikasi Pengolahan limbah

5 Mikroorganisme Fisiologi Morfologi Pertumbuhan Karakteristik pertumbuhan Kebutuhan lingkungan Pola produksi metabolit Stabilitas genetik

6 Substrat Komposisi Sifat fisika dan kimia Proses sterilisasi Konversi Rancangan formulasi media Limbah post-fermentation process

7 Produk Intrasel, ekstrasel Proses panen Perhitungan hasil Sensitivitas terhadap degradasi By-product

8 Kondisi fermentasi Lingkungan fisik Lingkungan kimia DO2, pco2 Mass transfer Kadar nutrisi Karakteristik mixing Aerasi dan agitasi

9 Bioreaktor Jenis bioreaktor Komponen instrumen Cara Sterilisasi Parameter proses

10 Tahap Isolasi dan purifikasi Proses aseptik Pemisahan, fraksinasi, isolasi Purifikasi

11 Pengolahan limbah Jenis limbah Proses pengolahan Parameter keamanan lingkungan

12 Jenis Fermentasi Fermentasi padat (Solid Substrate Fermentation) Fermentasi cair /bawah permukaan (Submerged Fermentation)

13 Metabolisme Katabolisme : proses degradasi nutrien menjadi fragmen-fragmen yang lebih kecil. Proses katabolisme menghasilkan ATP, proton motive force, menurunkan tenaga dan pengambilan nutrisi serta pembentukan rangka karbon dalam jalur metabolisme inti Jalur degradasi ini bisa pendek (misalnya pembentukan asetat) atau bisa pula panjang (misalnya pembentukan asam benzoat)

14 Amphibolisme : proses pembentukan intermediate (senyawa antara) Terjadi pembentukan building blocks (senyawa pembangun), misalnya asam amino, purin, pirimidin, gula-gula fosfat, asam organik, dan metabolit lain

15 Anabolisme : biosintesis polimer dari monomer (asam amino, nukleotida dan lipid) dari rangka karbon utama melalui pemanfaatan ATP dan NADPH Pertumbuhan sel dengan menggabungkan struktur makromolekul melalui proses polimerisasi monomer-monomer yang dihasilkan dari proses biosintesis, melibatkan berbagai nukleotida fosfat Polimer sel a.l. protein, asam nukleat, dinding sel, makanan cadangan, dll.

16 Tahap Utama Metabolisme KH, Lemak, Protein Asam amino, asam nukleat, dll ADP NTP Katabo lisme ATP NADP NADPH Biosin tesis NDP Tumbuh CO2 Kerangka karbon Protein, lipid, struktur sel

17 Regulasi metabolisme Seluruh kegiatan metabolisme berlangsung sangat cepat dan harus bekerja di dalam sel Mikroorganisme memiliki potensi genetik untuk memproduksi lebih dari 1000 enzim Enzim ini harus dibentuk dalam jumlah yang tepat dan dalam sistem yang terkoordinasi dengan baik agar sel bekerja secara efisien Mikroorganisme dapat dengan cepat mengantisipasi perubahan lingkungan sehingga dapat dengan segera memperbaiki sistem metabolismenya Regulasi untuk sistem yang demikian terjadi pada level sintesis enzim atau pada level kerja enzim

18 Faktor yang mempengaruhi regulasi metabolisme Jenis dan jumlah enzim Jenis dan jumlah substrat Adanya induktor, aktivator, represor dan inhibitor Faktor lingkungan Faktor genetik

19 Pemanfaatan mikroorganisme Biomassa Enzim Metabolit primer Metabolit sekunder Biotransformasi Bioinformatik

20 Beberapa contoh metabolit sekunder mikroba dan manfaatnya Antibiotik : penisilin (Penicillium chrysogenum), sefalosporin (Cephalosporium acremonium), Imunosupresan : silosporin (Trichoderma polysoprum) Bidang pertanian : growth promoter Zearalonone (Gibberella zeae) Enzim : amilase (Aspergillus niger), lipase (Pseudomonas aeruginosa) Pigmen : ankaflavin (Monascus purpureus)

21 Pertumbuhan sel mikroba Pertumbuhan sel : bertambahnya jumlah sel atau massa sel Growth (pertumbuhan) merupakan hal yang penting dalam fungsi mikroba Bakteri membelah diri dalam waktu menit Ragi : menit Kapang : 4-8 jam

22 Syarat mikroba tumbuh Ada sel hidup Ada sumber energi Ada nutrisi dan faktor pertumbuhan Tidak ada inhibitor atau toksin Kondisi fisiko-kimia yang mendukung

23 Kurva pertumbuhan mikroorganisme (sistem batch) Biomasa (X) c d e µ x = dx/dt b µ =laju pertumbuhan X=konsentrasi sel a t=waktu Waktu (t) Ket : a: fase lag ; b: fase log ; c:fase stasioner ; d:fase kriptik ; e:fase kematian

24 Sistem kultur untuk pertumbuhan dan produksi menggunakan mikroorganisme Sistem batch (kultur curah) Sistem fed-batch (kultur curah umpan) Sistem continuous (kultur sinambung) Batch Fed-batch Continuous

25 Medium pertumbuhan Substrat organik dan non-organik Kebutuhan hidup tergantung pada proses metabolisme, kebutuhan akan oksigen, suhu, dll Menentukan jenis mikroba : Mikroba aerob, an-aerob, obligat, fakultatif Mikroba psikrofil, termofil dll

26 Kebutuhan mikroorganisme Untuk tumbuh, mikroorganisme memerlukan nutrisi Medium untuk pertumbuhan mikroorganisme dapat berupa bahan alam (sifatnya kompleks) atau bahan kimia (sifatnya terukur)

27 Elemen dalam sel mikroorganisme Elemen % brt.krng Fungsi fisiologis C 50 komponen sel organik O 20 komponen sel organik, Akseptor e- pd respirasi N 14 utk protein, as.nukleat, Ko-enzim H 8 komponen sel organik P 3 Fosfolipid, as.nukleat S 1 as.amino, protein K 1 kation dan kofaktor pd reaksi enzimatis Na 1 kation dan membran transpor Ca 0,5 kation dan kofaktor Mg 0,5 kation dan kofaktor Cl 0,5 anion

28 Komposisi rata-rata sel mikroba Mikroba % C % N % Protein % KH %Lipid %As. Nukleat %Abu Bakteri Ragi Kapang

29 Komponen Medium untuk mikroorganisme Karbon : sebagai sumber energi dan komponen utama biomasa Sumber karbon dapat berasal dari : Polisakarida atau monosakarida, contoh : Karbohidrat, glukosa, molase, amilum, malt extract, dll. Nitrogen : sebagai sumber pembentukan komponen utama sel Sumber nitrogen dapat berasal dari : garam ammonium, urea, asam amino, sumber kompleks seperti CSL (Corn Steep Liquor), Yeast Extract, Pepton, dll.

30 Komponen Medium untuk mikroorganisme Mineral : P, K, Na, Mg, S, Ca, dll P sebagai salah satu unsure penting dalam pembentukan asam nukleat (dalam bentuk Fosfat), S sebagai unsure pembentukan beberapa asam amino esensial, Mg sebagai kofaktor dalam proses fosforilasi. Unsur-unsur lain : trace elements misalnya : vitamin, EDTA, dll

31 Komponen Medium untuk mikroorganisme Air : komponen utama terbesar dalam medium Oksigen : kebutuhan utama mikroba aerob sebagai aksptor electron pada proses respirasi, yang umumnya diperoleh dari komponen air (H 2 O)

32 Hubungan antara pertumbuhan sel, penggunaan substrat dan pembentukan produk (metabolit) Laju pertumbuhan Laju pertumbuhan vs konsentrasi nutrisi Koefisien hasil (yield coefficient) Nilai metabolit (metabolic quotient) Persamaan Monod Persamaan Michaelis-Menten Pembentukan produk (type I, II dan III)

33 PRODUKSI ASAM SITRAT SECARA FERMENTASI

34 Pendahuluan Asam sitrat merupakan asam organik Berguna dalam industri makanan, farmasi dan tambahan dalam makanan ternak Dapat diproduksi secara kimiawi, atau secara fermentasi menggunakan mikroorganisme

35 Sejarah Asam sitrat Sebelum tahun 1800 asam sitrat diperoleh dari tumbuhan (buah lemon) 1893 : ditemukan diproduksi oleh jamur berfilamen (filamentous fungi) 1923 : produksi pertama asam sitrat menggunakan mikroorganisme dengan cara fermentasi pada permukaan (surface culture) 1930 : produksi menggunakan fermentor diperoleh sebanyak 5000 ton 1979 : produksi menggunakan fermentor mencapai ton dari 220 m 3

36 Kegunaan asam sitrat Industri makanan : flavouring agent, ekstrak jus buah, perasa permen, es krim,dll Industri farmasi : dapar ph, pengawet dalam sediaan farmasi, perasa asam, dll Industri kimia : antifoam agent, softener, campuran warna tekstil, campuran deterjen, dll

37 Mikroba penghasil asam sitrat Merupakan metabolit primer Aspergillus niger Aspergillus wentii Penicillium luteum, P.citrinum Mucor piriformis Citromyces pfefferianus Candida lipolytica Trichoderma viridae Corynebacterium sp. dll

38 Biosintesis asam sitrat dalam mikroorganisme Asam sitrat (2-hidroksipropana-1,2,3-asam karboksilat) adalah produk metabolisme primer dan dibentuk dalam siklus asam trikarboksilat (TCA cycle) Sumber karbon utama adalah glukosa Enzim dalam jalur EMP terlibat dalam penguraian glukosa menjadi piruvat Ketika piruvat mengalami dekarboksilasi membentuk asetil koa, residu asetat masuk dalam siklus TCA

39 Selama proses idiophase, enzim sitrat sintase meningkat 10 kali selama produksi asam sitrat, sedangkan enzim asonitase dan sitrat dehidrogenase berkurang Glukosa juga mengalami katabolisme melalui jalur pentosa fosfat. Enzim untuk siklus ini terdapat pada A.niger

40 Diagram biosintesis asam sitrat PEP Piruvat Asetil coa Malat oksaloasetat Sitrat Fumarat Suksinat IsoSitrat

41 Fermentasi asam sitrat Dapat dilakukan menggunakan 2 macam metode fermentasi : permukaan (surface process) dan bawah permukaan (submerged process) Pada tahap tropofase, sebagian dari glukosa digunakan untuk membentuk miselium dan respirasi Pada tahap idiofase, sisa glukosa diubah menjadi asam organik, termasuk asam sitrat Produksi berkisar antara 40-69% dalam bentuk asam sitrat-1-hidrat (123 g per 100 g sukrosa) atau asam sitrat anhidrat (112 g per 100 g sukrosa)

42 Medium untuk nutrisi Sumber karbon : berbagai amilum dapat digunakan (kentang, hidrolisat amilum, sirup glukosa, sukrosa, molase, dll) Penambahan trace elements (Cu, Mn, Mg, Fe, Zn, Mo) dalam skala ppm. Bila berlebih dapat berakibat toksik Fe merupakan faktor penentu, jumlahnya tergantung pada sumber karbon yang digunakan. Contoh : bila digunakan sukrosa murni, jumlah optimal Fe adalah 2.0 ppm, sedangkan bila hidrolisat amilum yg digunakan, jumlah optimal Fe adalah 0,2 ppm

43 Komponen medium lainnya : sumber nitrogen, fosfat, juga diperlukan ph harus diatur < 3.0, untuk menekan pembentukan asam oksalat dan asam glukonat. Selain itu dapat mengurangi kemungkinan terkontaminasi

44 Proses produksi Penyiapan suspensi spora A.niger pada 25 C, inkubasi selama hari Inokulum dibuat dengan 15% gula (misalnya dari molase) Ditambahkan ion sianida untuk menginduksi pembentukan miselium dalam bentuk pelet dengan ukuran 0,2-0,5 mm Setelah 24 jam, pelet dapat digunakan untuk produksi dalam fermentor

45 Proses dengan metode permukaan (surface process) Medium untuk metode ini dapat berupa substrat padat atau cair Substrat padat : wheat bran, amilum ubi (sweet potato) Setelah disterilisasi, substrat ditaburkan dalam loyang setebal 3-5 cm lalu diinkubasi pada 28 C Pertumbuhan dapat dipercepat dengan penambahan enzim amilase Proses fermentasi berlangsung 5-8 hari

46 Substrat cair lebih banyak digunakan karena efisien. Spora inokulum sebanyak 2 5 x 10 7 spora/m 2 Komposisi medium : (g/l) Sukrosa NH 4 NO 3 1,6 3,2 CaH 2 PO 4 0,3 1,0 MgSO 4.7 H 2 0 0,2 0,5 ZnSO 4 0,01 0,02 Ca heksasianoferat 0,4 2,0

47 Kondisi fermentasi Suhu inkubasi C Ventilasi penting untuk pertukaran gas karena produksi asam sitrat akan berkurang bila CO 2 di atmosfir meningkat > 10% ph diatur supaya asam

48 Proses dengan metode bawah permukaan (submerged process) 80% produksi asam sitrat di dunia menggunakan metode ini Waktu fermentasi 8 hari 3 parameter yang menentukan keberhasilan proses : kualitas fermentor, struktur miselium, pasokan oksigen

49 Fermentor harus terbuat dari bahan yang tahan terhadap asam, misalnya SS (Stainless Steel) Bentuk miselium yang ideal adalah bentuk pelet dengan diameter kecil. Bila terjadi filamen dan tidak membentuk klamidospora, asam sitrat yang terbentuk menjadi sedikit Rasio jumlah Cu dan Fe mempengaruhi bentuk miselium ini Oksigen harus antara 20 25% jenuh, dengan laju aerasi 0,2 1 vvm Tidak perlu dilakukan pengadukan karena viskositasnya tidak tinggi

50 Perolehan kembali (product recovery) Jika asam oksalat terbentuk sebagai produk samping (side product), maka asam oksalat harus diendapkan dengan Ca agar membentuk endapan Ca-oksalat pada suasana asam. Asam sitrat akan tetap tertinggal dalam larutan sebagai mono-kalsium sitrat Asam sitrat selanjutnya diendapkan pada ph 7,2 dengan suhu C

51 Pemurnian selanjutnya dengan asam sulfat, lalu diendapkan sebagai kalsium sulfat Penambahan kabon aktif, atau ion exchange, dan kristalisasi sebagai asam sitrat atau asam sitrat monohidrat pada 36,5 C