BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

Transkripsi

1 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Enzim Enzim adalah protein yang diproduksi dari sel hidup dan digunakan oleh sel-sel untuk mengkatalisis reaksi kimia yang spesifik. Enzim memiliki tenaga katalitik yang luar biasa dan biasanya lebih besar dari katalisator sintetik. Spesifitas enzim sangat tinggi terhadap substratnya. Tanpa pembentukan produk samping enzim merupakan unit fungsional untuk metabolisme dalam sel, bekerja menurut urutan yang teratur. Sistem enzim terkoordinasi dengan baik menghasilkan suatu hubungan yang harmonis diantara sejumlah aktivitas metabolic yang berbeda (Shahib, 1992). Enzim dikatakan sebagai suatu kelompok protein yang berperan sangat penting dalam aktivitas biologis. Dalam jumlah yang sangat kecil, enzim dapat mengatur reaksi tertentu sehingga dalam keadaan normal tidak terjadi penyimpangan-penyimpangan hasil akhir reaksinya. Enzim ini akan kehilangan aktivitasnya akibat panas, asam atau basa kuat, pelarut organik, atau pengaruh lain yang bisa menyebabkan denaturasi protein. Enzim dikatakan mempunyai sifat sangat khas, karena hanya bekerja pada substratnya (Girindra, 1990). Untuk aktivitasnya kadang-kadang enzim membutuhkan kofaktor yang bisa berupa senyawa organik atau logam. Senyawa organik itu terikat pada bagian protein enzim. Bila ikatan itu lemah maka kofaktor tadi disebut co-enzim dan dan jika terikat erat melalui ikatan kovalen maka dinamakan gugus prostetis. Pada umumnya dua kofaktor itu tidak dibedakan dan disebut co-enzim saja. Apabila enzim itu terdiri dari bagian seperti yang diterangkan diatas maka keseluruhan enzim itu dinamakan holo enzim. Bagian protein dinamakan apo-enzim dan bagian non proteinnya disebut coenzim.fungsi logam pada umumnya adalah untuk memantapkan ikatan substrat pada

2 enzim atau mentransfer electron yang timbul selama proses katalisis (Soeharsono, 1989) Kerja Enzim Pada Substrat Enzim meningkatkan kemungkinan molekul-molekul yang bereaksi saling bertemu dengan permukaan yang saling berorientasi. Hal ini terjadi karena enzim mempunyai suatu afinitas yang tinggi terhadap substrat dan mempunyai kemampuan untuk mengikat substrat tersebut walaupun bersifat sementara. Penyatuan antara substrat dengan enzim sangat spesifik substrat terikat dengan enzim sedemikian rupa, sehingga setiap substrat terorientasi secara tepat untuk terjadi reaksi. Pembentukan ikatan yang sementara (biasanya ikatan nonkovalen) antara substrat dengan enzim menimbulkan penyebaran elektron dalam molekul substrat dan penyebaran ini menyebabkan suatu regangan pada ikatan kovalen spesifik dalam molekul substrat, sehingga ikatan kovalen tersebut menjadi mudah terpecah. Para ahli biokimia menamakan keadaan dimana terjadi regangan ikatan molekul substrat setelah berinteraksi dengan enzim disebut pengaktifan substrat (Shahib, 1992) Pengaruh Kadar Enzim dan Substrat Kecepatan reaksi bergantung pada konsentrasi enzim yang berperan sebagai katalisator dalam reaksi itu. Pada gambar terlihat hubungan jika konsentrasi enzim yang digunakan tetap, sedangkan substrat dinaikkan. Di sini dapat terlihat bahwa pada penambahan pertama kecepatan reaksi naik dengan cepat. Tetapi jika penambahan substrat dilanjutkan, dilanjutkan maka tambahan kecepatan mulai menurun sampai pada suatu ketika tidak ada tambahan kecepatan reaksi lagi (Girindra, 1990).

3 Kecepatan maksimum (v) Orde 0 (Fase II) Kecepatan reaksi v/2 Gabungan Orde 0 dan orde 1 Kinetika Orde pertama (Fase I) Konsentrasi substrat Gambar. 2.1 Pada Substrat yang spesifik, enzim akan mengkatalisis reaksi sehingga menghasilkan produk yang spesifik, juga pada penambahan pereaksi kimia tertentu dapat mengakibatkan enzim menunjukkan bentuk stereokimianya dimana interaksi enzim dengan substrat terjadi dalam ikatan, dimana kelebihan substrat tidak dapat diikat seluruhnya oleh enzim (Trevar, 1985). R R R C Substrat R Enzim A- A - A - Active site Gambar Enzim lipase Lipase yang berasal dari bakteri pada umumnya adalah protein yang memiliki sifat asam. Dan mempunyai berat molekul dari sampai Memiliki aktivitas

4 spesifik protein murni yang berubah-ubah dari 500 sampai unit lipase per mg protein (Fogarty, William, M. 1983). Gambar 2.3. Lipid (Triasilgliserol) Enzim lipase atau lengkapnya triasilgliserol lipase adalah enzim yang menghidrolisis ester karboksilat. Enzim ini mempunyai substrat alami berupa trigliserida dari asam lemak yang mana reaksinya memerlukan air, dan lipase ekstraseluler berhasil diisolasi dari Pseudomonas aeruginosa pada tahun Enzim lipase memiliki sub unit berupa glikoprotein dan lipoprotein. Sub unit tersebut dapat sebagai monomer, dimer, oligomer atau polimer. Enzim lipase stabil pada suhu optimumnya yaitu 30 o C, walaupun masih aktif pada 51 o C, (Nishio, 1987). Dan menurut penelitian Abigor dkk (2002) wijen digunakan sebagai katalis enzim lipase dan dapat bekerja dengan baik dan bertahan hidup pada ph 7-7,5. Pada banyak mikroorganisme, bagian yang kuat dari lipase ekstraseluler sebagian masih terikat pada dinding sel. Karena adanya ikatan antara enzim dan dinding sel mungkin menghambat ekskresi lipase berikutnya dalam media pertumbuhan dan dengan demikian menurunkan hasil lipase ekstraseluler. Zat yang dapat menstimulai pelepasan lipase dari dinding sel sehingga dapat meningkatkan pembentukan lipase yaitu dengan menambahkan ion magnesium kedalam media pertumbuhan ( Aisaka & Terada, 1979) Hipotesis Operon Dari aktivitas β-galaktosidase dalam sel E. Coli diusulkan hipotesis operon untuk kontrol genetik dari sintesis protein pada prokariota. Jenis peraturan sintesis protein yang diberikan oleh konsep operon membicarakan tentang kontrol transkripsi, karena

5 kontrol yang diberikan terutama pada transkripsi gen menjadi mrnas yang sesuai. Ada cara umum lain dalam sintesis protein, yaitu, dengan kontrol translasi laju sintesis dari rantai polipeptida dari template mrna-nya. Kontrol transkripsi tampaknya menjadi mekanisme utama untuk pengaturan ekspresi gen pada bakteri. Kontrol Translational, yang tidak dipahami dengan baik, tampaknya merupakan mekanisme sekunder pada bakteri tetapi sangat penting dalam eukariota. Dari eksperimen mereka Jacob dan Monod terdapat tiga gen struktural z, y, dan a coding untuk mensintesis β-galaktosidase, permease dan protein A, masingmasing, yang semuanya dapat diinduksi oleh laktosa, terletak berdekatan satu sama lain dalam kromosom E. coli dan DNA mengisi letak lain di dekat gen ini. Bagian i ini diusulkan menjadi gen regulasi coding untuk sekuens asam amino dari protein yang disebut represor, ketika gen i ditranskripsi untuk membentuk mrna yang sesuai, yang berdifusi terakhir ke ribosom dan ada bertindak sebagai template untuk sintesis represor. Protein represor mengikat bagian lain pada segmen tertentu pada DNA yang disebut operator. Pengikatan protein represor ke situs operator dalam DNA dipostulatkan untuk mencegah atau menekan transkripsi oleh RNA polimerase dari tiga gen struktural z, y, dan a coding untuk tiga enzim diinduksi oleh 3-galactosides, Gambar 2.4 Mekanisme Lac_Operon Untuk menjelaskan tindakan dari inducer, ketika glukosa tidak tersedia, tetapi laktosa ada, Jacob dan Monod mengajukan bahwa ia menggabungkan dengan letak

6 pengikatan spesifik yang kedua pada protein represor, letak inducer, untuk membentuk sebuah kompleks penginduksi-represor. Ikatan dari inducer disebabkan represor yang akan dibentuk dari operator pada DNA dengan penurunan afinitas untuk yang kedua. Setelah kompleks represor-inducer dilepaskan, gen struktural untuk β- galactosiclase dan dua lainnya protein menjadi tersedia untuk transkripsi oleh RNA polimerase untuk menghasilkan mrna yang sesuai. Ketiga protein kemudian disintesis dari template mrna pada ribosom, memungkinkan sel untuk menggunakan laktosa sebagai sumber karbon dan energi.sel-sel yang diambil dari media terakhir, dicuci, dan ditempatkan dalam sebuah medium, sedangkan-laktosa, D-glukosa, yang sel selalu dapat digunakan. Karena konsentrasi laktosa dalam sel sekarang akan menjadi rendah. induser terikat pada protein represor akan terpisahkan jauh, menyebabkan molekul represor untuk kembali ke bentuk aktif, sehingga sekarang terikat dengan afinitas yang tinggi ke bagian operator. Akibatnya, gen-gen struktural untuk β-galaktosidase dan dua protein lain tidak bisa lagi ditranskripsikan, dan karena kekurangan mrna, protein ini tidak bisa lagi dibuat. Oleh karena itu protein represor, melalui kapasitasnya untuk mengikat baik induser atau operator reversibel tapi tidak keduanya secara bersamaan, sehingga dapat dihitung induksi dan represi keduanya pada sintesis galaktosidase. Ketiga gen struktural z, - v, dan, a bersama-sama dengan operator o mereka, yang ditunjuk oleh Jacoob dan Monoc sebagai operon, khususnya, Lac_Operon. Sebuah operon tetap terdiri dari kelompok gen struktural fungsional terkait, yang dapat diaktifkan atau dinonaktifkan secara terkoordinasi, bersama dengan operator mereka.(lehninger, 1982) Ion Logam sebagai kofaktor-enzim Ion logam dapat digunakan sebagai aktivasi enzim dan pembawa elektron dengan mekanisme variasi yang berbeda dan lingkungan mikro yang berbeda dalam jenis protein yang berbeda. Fungsi dari ion logam tersebut pada semua enzim, mencakup:

7 a) secara tepat menjadi katalis pada enzim, b) Berpartisipasi dalam ikatan substrat pada sisi aktif, c) menjaga konformasi enzim agar tetap sebagai katalis, dan d) berpartisipasi dalam reaksi redoks. Beberapa logam seperti Fe 2+, Cu 2+, Zn 2+, Mn 2+, Co 2+, Mo 2+ berikatan sangat kuat dengan enzim dan membentuk metaloenzim, sedangkan logam Mg 2+, Ca 2+, Mn 2+ berikatan lemah dengan enzim sehingga membentuk metal-aktif enzim (Milton, S. H. 1987). Fakta lain tentang enzim lipase adalah adanya ion logam Ca 2+ dalam konsentrasi yang rendah akan mengaktifkan reaksi enzimatik lipase. Senyawa lain yang diketahui memiliki fungsi yang sama dengan Ca 2+ adalah EDTA. Tetapi kation divalent lainnya seperti Mg 2+, Zn 2+, Cu 2+, dan Cd 2+ pada konsentrasi rendah menghambat aktivitas enzim ini sampai 70%. Dilain pihak Kalium asetat mempertinggi aktivitas enzimatik lipase hingga 4 sampai 5 kali dikisaran konsentrasi 1yang lebih tinggi. Natrium Asetat mendorong kenaikan aktivitas enzimatik sampai dua kali lipat pada konsentrasi rendah dan tidak berpengaruh apa-apa walau dalam konsentrasi tinggi pada ph 7,0-75. Natrium Klorida hanya sampai batas konsentrasi rendah yang mempengaruhi aktivitas enzimatik lipase dan pengaruhnya berupa adanya kenaikan aktivitas enzimatik yang tipis (Schwimmer, S. 1981). Kofaktor akan terikat pada gugus aktif pada molekul protein enzim, sehingga kerja enzim yang ditunjukkan oleh aktivitas meningkat.(lehninger, 1982) 2.2 Minyak Minyak dan lemak tergolong kepada anggota dari golongan lipid yaitu lipid netral. Lipid itu sendiri dapat diklasifikasikan menjadi 4 kelas yaitu: 1) Lipid netral, 2) Fosfatida, 3) Spingolipid dan 4) Glikolipid. Minyak dan lemak yang telah dipisahkan dari jaringan asalnya mengandung sejumlah komponen selain trigliserida, yaitu: 1) Lipid kompleks (yaitu leshitin, cephalin, fosfatida, lainnya serta glikolipid), 2) Sterol, berada dalam keadaan bebas atau terikat dengan asam lemak, 3) Asam lemak bebas, 4) Lilin, 5) Pigmen yang larut dalam lemak, dan 6) Hidrokarbon (Ketaren, 1986).

8 Rata-rata komposisi minyak terdiri dari 58,2% sebagai sampel jenuh, 28,6% senyawa aromatik dan 14,2% senyawa polar. Berdasarkan klasifikasi minyak, senyawa aromatik ini adalah senyawa hidrokarbon yang terdiri dari cincin yang mengandung enam atom karbon. Hampir kebanyakan senyawa aromatik ini bermassa rendah dan jumlahnya dalam minyak sekitar 10-30% (Syakti, 2005) Minyak Wijen Tanaman wijen (Sesamum indicum L) termasuk family Pedaliaceae, varietas Sesamum indicum sub spesies ialah S. orientale. (Ketaren, 1986) Minyak wijen mengandung zat tidak tersabunkan dalam jumlah relative tinggi. Tetapi kandungan tertinggi adalah sterol dan zat-zat yang tidak dapat dipisahkan dengan pemurnian, sedangkan kadar bahan non minyak lainnya relative rendah (Bailey, 1951). Minyak wijen mengandung kurang lebih 0,3-0,5 % sesameoline, fenol berikatan 1-4 yang dikenal sebagai sesamol, dan sesamine sekitar 0,5-0,1 %.. Minyak wijen juga mengandung asam-asam lemak, yaitu: Asam Lemak Rumus Persen Asam lemak jenuh Palmitat Stearat Arachidat C 16 H 32 O 2 C 18 H 36 O 2 C 20 H 40 O 2 9,1 4,3 0,8 Asam lemak tidak jenuh Oleat C 18 H 34 O 2 Linoleat C 18 H 32 O 2 linolenat C 18 H 30 O 2 ( Hilditch, 1947) Tabel 2.1 Komposisi Asam Lemak Minyak Wijen 45,4 40,4

9 Komposisi Air Protein Lemak Karbohidrat Ca P Fe Vitamin B1 Vitamin C Bagian yang dapat dimakan (Ketaren, 1986) Tabel 2.2. Komposisi Gizi Wijen / 100 gr Jumlah (gr) 6 19,3 57,1 18,1 0,0012 0,614 0,0095 0, , Analisis Kuantitatif Asam Lemak Bebas Kadar Asam lemak bebas dinyatakan sebagai jumlah rata-rata dari bobot asam lemak yang tidak lagi terikat dengan molekul trigliserida dari setiap gram minyak atau lemak. Soumano telah meneliti terbentuknya asam lemak yang bebas tersebut pada saat reaksi interesterifikasi enzimatik minyak nabati dengan biokatalis berbagai jenis lipase (Soumanou, M.M. 1997). Untuk menentukan kadar minyak atau lemak dapat digunakan bilangan penyabunan yaitu jumlah milligram KOH yang diperlukan untuk menyabunkan satu gram minyak atau lemak. Dalam penetapan bilangan penyabunan biasanya larutan alkali yang dipergunakan adalah KOH, yang diukur dengan hati-hati dengan menggunakan buret dan pipet. Campuran minyak atau lemak dengan larutan KOH didihkan pada pendingin alir balik sampai terjadi penyabunan yang lengkap, kemudian larutan KOH yang tersisa ditetapkan dengan jalan titrasi dengan larutan HCl 0,5 N. Bilangan penyabunan dapat ditetapkan dengan jalan mengurangkan jumlah miliequivalen larutan alkali beralkohol yang dipergunakan, dikalikan dengan berat molekul dari larutan alkali

10 tersebut, dibagikan dengan berat contoh dalam gram. Berat molekul untuk larutan KOH adalah 56,1 : sedangkan berat molekul larutan NaOH adalah 39,9. Bilangan Penyabunan = 56,1( ml KOH x N KOH ) ( ml HCl x N HCl) gram contoh (Ketaren, 1986). Cara lain untuk menentukan kadar asam lemak bebas dalam minyak nabati yaitu dengan memodifikasi perhitungan menjadi bilangan asam atau acid value (AV). Bilangan asam dinyatakan sebagai mg KOH yang dibutuhkan untuk mentitrasi asam lemak bebas yang terkandung dalam 1 g minyak. Karenanya, pada perhitungan bilangan asam, harus diketahui berat minyak yang bersangkutan (AOCS, 1989). Terdapat sejumlah metode penentuan kadar asam lemak bebas selain metode titri metri yaitu seperti metode yang didasarkan pada pengukuran PH atau tingkat keasaman, dan teknik-teknik spektoskopi dengan atau tanpa pelarut (Velasco Arjona, A. et al, 1998). 2.3 Bakteri Bakteri adalah mikroorganisme bersel satu dan berkembang biak dengan membelah diri. Ukuran bakteri bervariasi baik penampang maupun panjangnya, tetapi pada umumnya penampang bakteri adalah sekitar 0,7-1,5 µm dan panjangnya sekitar 1-6µm. Bentuk bakteri dibagi menjadi 3 yaitu : 1. Sferis (kokus) Bakteri ada yang berbentuk sferis atau bulat, seperti ada yang ditemukan pada genus Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria dan lain-lain 2. Batang (basil) Bakteri yang berbentuk batang lurus misalnya dapat dijumpai pada famili Enterobacteriaceae seperti Escheria coli, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae maupun famili Bacillaceae seperti genus Clostridium dan genus

11 Bacillus yaitu Bacillus anthracis penyebab penyakit anthraks. Selain bentuk batang lurus, dijumpai pula bentuk batang bengkok misalnya pada bakteri Vibrio cholera penyebab penyakit cholera. 3. Spiral Bakteri berbentuk spiral dijumpai pada penyebab penyakit sifilis yaitu Treponema pallidum, bakteri penyebab demam bolak-balik yaitu Borelia reccurentis (Tim Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya,2003) Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa merupakan salah satu spesies dari genus Pseudomonas. Pseudomonas aeruginosa bergerak aktif dengan flagella polar dan mempunyai ukuran lebar 0,5-1 µm dan panjang 3-4 µm dan bersifat aerob. Bakteri ini dapat menggunakan lebih dari 80 macam bahan organik untuk pertumbuhannya, tetapi Pseudomonas dapat menggunakan arginine dan nitrat sebagai elektro akseptor sehingga dapat tumbuh pada suasana anaerob. Pseudomonas aeruginosa tumbuh pada suhu o C. P.aeruginosa menghasilkan pigmen piosianin (Tim Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya,2003). Menurut Donnel, 1994 klasifikasi bakteri Pseudomonas adalah sebagai berikut: Kingdom : Prokaryotae Divisio : Gracilitutes Kelas : Protobakteria Famili : Pseumonadacae Genus : Pseudomonas Spesies : Pseudomonas sp. Berbagai penelitian telah menunjukkan bahwa Pseudomonas sp merupakan salah satu anggota bakteri gram negative yang umumnya menggunakan protein atau lipid sebagai sumber energi maupun sumber carbon dan juga mampu menguraikan berbagai jenis substrat (Mc Clay, 1996 dan Wischnak, 1998).

12 2.4 Media Fermentasi Untuk mendapatkan biakan murni bakteri, bahan pemeriksaan klinis tersebut ditanam pada media pembenihan. Media pembenihan yang digunakan untuk isolasi primer tergantung dari dugaan kemungkinan bakterinya, namun biasanya digunakan media pembenihan padat yang mengandung agar-agar untuk mendapatkan koloni bakteri yang terpisah (isolated colony). Bakteri pada umumnya akan tumbuh dan berkembang dengan cepat, membentuk suatu koloni bila ditanam pada media pembenihan yang sesuai setelah diinkubasikan selama jam pada suhu yang sesuai pula. (Tim Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya,2003). Medium kultur harus mengandung semua elemen yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikrobia, dalam proporsi yang serupa dengan yang ada pada sel mikrobia yaitu : Unsur Fungsi Fisiologi Berat kering (%) Hidrogen Oksigen Karbon Nitrogen Sulfur Fosfor Magnesium Mangan Kalsium Besi Kobalt Tembaga, seng Molybdenum Penyusun senyawa organik Penyusun senyawa organik Penyusun senyawa organik Penyusun protein, asam nukleat, dan koenzim Penyusun protein, dan beberapa koenzim Penyusun asam nukleat, fosfolipida, dan koenzim Kofaktor pada sejumlah reaksi enzim (ATP) Kofaktor pada beberapa enzim Kofaktor pada beberapa enzim (Protease) Penyusun sitokrom, protein, non-heme dan kofaktor pada beberapa enzim Penyusun vitamin B 12 Penyusun beberapa enzim Tabel 2.3. Unsur yang ada pada mikrobia

13 Umumnya yang disebut makronutrien adalah yang dibutuhkan dalam jumlah besar seperti C, H, O, N,. Mesonutrien dibutuhkan dalam jumlah lebih sedikit seperti Mg, P, S, dan mikronutrien dibutuhkan dalam jumlah sangat sedikit seperti Fe, Cu, Zn, dan Mo. (Hidayat N, dkk. 2006). Salah satu unsur yang sangat penting dalam media adalah karbon. Secara umum sumber karbon yang optimal digunakan yaitu karbohidrat, hidrokarbon dan minyak nabati. Beberapa organisme mengkonsumsi beberapa substrat, yang dikombinasi atau secara terpisah (Desai et al., 1994).