DETEKSI PENYAKIT HUANGLONGBING TANAMAN JERUK PADA TINGKAT KEPARAHAN BERBEDA DENGAN UJI AKUMULASI PATI DAN POLYMERASE CHAIN REACTION

Transkripsi

1 DETEKSI PENYAKIT HUANGLONGBING TANAMAN JERUK PADA TINGKAT KEPARAHAN BERBEDA DENGAN UJI AKUMULASI PATI DAN POLYMERASE CHAIN REACTION SUCI ADDMAS KALASYANK DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015

2

3 PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Deteksi Penyakit Huanglongbing Tanaman Jeruk pada Tingkat Keparahan Berbeda dengan Uji Akumulasi Pati dan Polymerase Chain Reaction adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, September 2015 Suci Addmas Kalasyank NIM A

4 iv

5 ABSTRAK SUCI ADDMAS KALASYANK. Deteksi Penyakit Huanglongbing Tanaman Jeruk pada Tingkat Keparahan Berbeda dengan Uji Akumulasi Pati dan Polymerase Chain Reaction. Dibimbing oleh KIKIN HAMZAH MUTAQIN. Huanglongbing yang disebabkan oleh bakteri Liberobacter asiaticus yang di Indonesia dikenal sebagai citrus vein phloem degeneration (CVPD) merupakan penyakit paling penting pada tanaman jeruk yang menyebabkan tanaman mengalami gangguan translokasi hasil fotosintesis. Tanaman yang terinfeksi mengalami klorosis yang tidak teratur secara asimetris pada bagian daun. Gejala huanglongbing pada tanaman mirip dengan gejala kekurangan hara mikro. Penelitian ini meliputi pengamatan tanaman yang terinfeksi huanglongbing berdasarkan gejala eksternal di lapangan dan gejala internal menggunakan uji akumulasi pati di laboratorium. Keberadaan patogen juga dikonfirmasi dengan menggunakan teknik deteksi molekuler polymerase chain reaction (PCR). Tanaman di lapangan diklasifikasikan berdasarkan tingkat keparahan penyakit. Bagian tanaman yang dideteksi adalah bagian daun yang menunjukkan maupun tidak menunjukkan gejala klorosis dan bagian ranting. Tanaman dengan tingkat keparahan berat ditunjukkan dengan kerdilnya tajuk yang disertai klorosis daun yang eksesif. Sedangkan tanaman dengan tingkat gejala ringan memiliki tajuk yang normal, namun daunnya mengalami klorosis. Tanaman sehat memiliki tinggi tajuk normal dan daunnya berwarna hijau. Daun-daun yang mengalami klorosis akibat huanglongbing memiliki bentuk daun lebih lanset dibandingkan daun yang sehat. Daun-daun yang mengalami klorosis dari tanaman pada tingkat keparahan berat dan ringan umumnya disertai dengan terjadinya akumulasi pati pada bagian floem, namun berdasarkan deteksi patogen dengan PCR, keberadaan akumulasi pati pada bagian daun tidak selalu menunjukkan hasil positif keberadaan patogen. Deteksi patogen dengan PCR memberikan hasil positif yang lebih banyak pada petiol dan tulang daun dibandingkan pada ranting. Kepekaan deteksi ditingkatkan dengan pengenceran DNA hasil isolasi yang digunakan sebagai template dalam PCR. Kata kunci: CVPD, huanglongbing, Liberobacter asiaticus, PCR, akumulasi pati.

6 vi

7 ABSTRACT SUCI ADDMAS KALASYANK. Detection of Huanglongbing Disease of Citrus at Different Severity Levels Using Starch Accumulation Test and Polymerase Chain Reaction. Supervised by KIKIN HAMZAH MUTAQIN. Huanglongbing also known as citrus vein phloem degeneration (CVPD) in Indonesia is the most important disease of citrus that causes impaired translocation of plant photosynthesis products. The symptom of infected plants is asymmetrical chlorosis referred to as blotchy mottle. This abnormality resemble to nutrient deficiency symptoms. This research was conducted to detect the causal agent from infected citrus plant at different levels of disease severity by using starch accumulation test and polymerase chain reaction technique.plant samples in the field are categorized into three disease severity levels, i.e. healthy, light, and severe. Leaf midribs and twigs are used in detection of the disease. Plants with severe symptom undergo canopy stunting with excessive leave chlorosis, whereas plants with light severity have normal canopy, but the leaves still undergo chlorosis. Healthy plants have a normal height and green leaves. Plants with heavy and light severity showed more lanceolate leaves than that of healthy plants. Chlorotic leaves also showed internal symptom as starch accumulation in their phloems. However, the presence of starch accumulation in the leave phloems do not always followed by positive resultwith PCR molecularly detection. PCR detection for pathogen in leaf petiols and midribs showed more positive results than that in twigs. Detection sensitivity was improved by dilution of isolated DNA used as template in PCR reaction. Keywords: CVPD, huanglongbing, Liberobacter asiaticus, PCR, starch accumulation.

8 viii

9 Hak Cipta milik IPB, tahun 2015 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah, dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar bagi IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.

10 x

11 DETEKSI PENYAKIT HUANGLONGBING TANAMAN JERUK PADA TINGKAT KEPARAHAN BERBEDA DENGAN UJI AKUMULASI PATI DAN POLYMERASE CHAIN REACTION SUCI ADDMAS KALASYANK Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada Departemen Proteksi Tanaman DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015

12 xii

13 Judul Usulan : Deteksi Penyakit Huanglongbing Tanaman Jeruk pada Tingkat Keparahan Berbeda dengan Uji Akumulasi Pati dan Polymerase Chain Reaction Nama Mahasiswa : Suci Addmas Kalasyank NIM : A Disetujui oleh,.. Dr Ir Kikin Hamzah Mutaq in, MS i Dosen Pembimbing Asih Nawangsih, MSi epartemen Proteksi Tanaman Tllnggal Lulus: 2 2 SEP 1U1l

14 xiv

15 PRAKATA Bismillahirrohmanirrohim, Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT yang telah memberikan karunia dan hidayah-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir yang berjudul Deteksi Penyakit Huanglongbing Tanaman Jeruk pada Tingat Keparahan Berbeda dengan Uji Akumulasi Pati dan Polymerase Chain Reaction dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman dan pengamatan penyakit dilakukan di lahan pertanaman jeruk desa Situ Gede, Kecamatan Bogor Barat, Kabupaten Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Ir Kikin Hamzah Mutaqin, MSi selaku dosen pembimbing skripsi yang telah banyak memberikan pengarahan, saran, dan motivasi selama penelitian dan penulisan skripsi. Ucapan terima kasih juga diberikan kepada Dr Ir Supramana MSi selaku dosen pembimbing akademik yang telah memberikan bimbingan dan saran selama proses kegiatan belajar di Departemen Proteksi Tanaman. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Dr Ir Pudjianto MSi selaku dosen penguji tamu yang telah memberikan banyak saran dalam proses penulisan skripsi. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Yunus pemilik pertanaman jeruk di Desa Situ Gede tempat penelitian dilaksanakan. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan kepada teman-teman anggota Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan yaitu Kak Tatit, Kak Rizal, Ibu Indri, Ibu Arini, Bang Rois, Risna, Imam, dan Lutfi yang telah memberikan bantuan dan saran selama pelaksanaan penelitian dan penulisan skripsi. Terima kasih kepada teman-teman Departemen Proteksi Tanaman angkatan 47, Hagia, Ridho, Mas Dhanu, Bang Satria, Mas Mul, Aziz, Ofin, dan Imam atas dukungan dan bantuan yang telah diberikan. Terima kasih kepada sahabat Bilyan, Kiki, Beno, Uyuy, Titah, Syifa, Dwi Ayu, Retno, Riri, Mey, Ity, Tri, dan Yusuf Ardhika Atmaji atas kebersamaan dan dukungan selama masa perkuliahan di Institut Pertanian Bogor. Terima kasih kepada Allah SWT telah menghadirkan Pae, Bue, dan keluarga besar Penulis yang selalu mencurahkan kasih sayang, doa, dan dukungan tiada henti. Semoga tugas akhir ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya mengenai penyakit huanglongbing di Indonesia. Bogor, September 2015 Suci Addmas Kalasyank

16 xvi

17 1 DAFTAR ISI PENDAHULUAN Latar Belakang 1 Tujuan 2 Manfaat 2 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu 3 Metode Penelitian 3 Penentuan Contoh Tanaman dan Pengamatan Gejala Penyakit 3 Deteksi Keberadaan Patogen Penyebab Huanglongbing dengan Uji Akumulasi Pati 3 Deteksi Keberadaan Patogen Penyebab Huanglongbing dengan Polymerase Chain Reaction 3 HASIL DAN PEMBAHASAN Gejala Eksternal Penyakit Huanglongbing 5 Gejala Internal Uji Akumulasi Pati pada Tanaman Jeruk 7 Deteksi Patogen Huanglongbing dengan PCR pada Tanaman Jeruk 8 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan 13 Saran 13 DAFTAR PUSTAKA 14 LAMPIRAN 17 RIWAYAT HIDUP 21

18 2

19 1 DAFTAR GAMBAR 1 Tanaman jeruk pada tingkat keparahan gejala berbeda: berat (B), ringan (R), dan tidak bergejala (T) 5 2 Daun bergejala (I) dan tidak bergejala (H) klorosis dari tanaman dengan keparahan penyakit berat (B), ringan (R), dan tidak bergejala (T) sebanyak tiga ulangan. 6 3 Akumulasi pati ibu tulang daun jeruk menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 100 kali 9 4 Amplifikasi PCR dengan primer A2/J5 untuk huanglongbing pada tulang daun dan ranting (r) daun bergejala (I) dan tidak bergejala (H) klorosis dari tanaman dengan keparahan penyakit Berat (B), Ringan (R), dan Tidak bergejala (T) 10 5 Amplifikasi PCR dengan primer A2/J5 untuk huanglongbing terhadap contoh DNA templat dengan pengenceran pada 10-1 dari tulang daun dan ranting (r) daun bergejala (I) dan tidak bergejala (H) klorosis dari tanaman dengan keparahan penyakit Berat (B), Ringan (R), dan Tidak bergejala (T) 11 DAFTAR TABEL 1 Tinggi dan lebar tajuk tanaman jeruk pada berbagai keparahan penyakit huanglongbing 5 2 Panjang, lebar, dan rasio daun tanaman jeruk pada berbagai tingkat keparahan penyakit huanglongbing 7 3 Perbandingan panjang, lebar, dan rasio daun berdasarkan tingkat klorosis gejala huanglongbing 7 4 Intensitas akumulasi pati pada bagian ibu tulang daun tanaman jeruk 8 DAFTAR LAMPIRAN 1 Larutan Penyangga CTAB 18 2 Data tinggi dan lebar tajuk tanaman 18 3 Data Panjang daun bergejala dan tidak bergejala klorosis (cm) 18 4 Data Lebar daun bergejala dan tidak bergejala klorosis (cm) 18 5 Data Rasio Panjang terhadap Lebar daun bergejala dan tidak bergejala klorosis (cm) 19 6 Analisis ragam panjang daun bergejala dan tidak bergejala klorosis 19 7 Analisis ragam lebar daun bergejala dan tidak bergejala klorosis 20 8 Analisis ragam rasio daun bergejala dan tidak bergejala klorosis 20

20

21 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Huanglongbing yang di Indonesia lebih dikenal sebagai citrus vein phloem degeneration (CVPD) merupakan penyakit utama pada tanaman jeruk di berbagai wilayah di dunia (Sutton et al. 2005). Penyakit ini pertama kali dilaporkan di negara China pada tahun Penyakit huanglongbing mulai dilaporkan di Indonesia sekitar awal tahun 1948 (Graca 2008). Jutaan jeruk di pulau Jawa mati karena terinfeksi penyakit huanglongbing (Tirtawidjaja 1964). Saat ini penyakit huanglongbing diduga telah menyebar di seluruh Indonesia. Lafleche dan Bové pada tahun 1970 menyatakan bahwa penyebab dari penyakit huanglongbing adalah sejenis bakteri dari subdivisi α-proteobacteria (bakteri gram negatif). Bakteri ini belum dapat dikulturkan dalam media buatan sehingga belum memenuhi kriteria lengkap untuk mendeskripsikan sebagai suatu spesies maka klasifikasinya masih dalam status Candidatus (Murray dan Schleifer 1994). Bakteri penyebab huanglongbing diketahui terdiri atas tiga spesies, yaitu Ca. Liberobacter asiaticus yang pertama kali ditemukan di Asia, Ca. Liberobacter africanus di Afrika dan Ca. Liberobacter americanus di Benua Amerika (Chung dan Brlansky 2005). Penyakit huanglongbing tidak menular secara mekanis, namun dapat ditularkan melalui perbanyakan vegetatif (grafting dan okulasi) dan oleh serangga vektor dari famili Psyllidae; yaitu Trioza erytreae (Ca. L. africanus) dan Diaphorina citri (Ca. L. asiaticus dan Ca. L. americanus) (Li et al. 2005). Bakteri penyebab penyakit huanglongbing juga dapat ditularkan melalui tali putri (Cuscuta campestris) (Bové dan Teixeira 2005). Pada umumnya bibit jeruk ditanam petani berupa sambungan okulasi batang atas-batang bawah. Penggunaan batang atas atau batang bawah dari tanaman yang telah terinfeksi penyakit menjadi salah satu cara penyakit huanglongbing mudah menyebar. Metode deteksi penyakit yang cepat dan akurat diperlukan sebelum melakukan proses penyambungan atau okulasi sehingga diperoleh bahan perbanyakan yang terkonfirmasi bebas huanglongbing. Tanaman terinfeksi penyakit huanglongbing mengalami klorosis pada daun secara asimetris antara sisi kiri dan kanan ibu tulang daun. Gejala ini dapat ditemukan baik pada daun muda maupun daun tua pada tingkat keparahan tinggi. Pada tanaman muda, infeksi dapat mengakibatkan lambatnya perkembangan kuncup, daun menjadi lebih kecil, dan warna daun tidak hijau sempurna. Gejala akan diawali dengan blotching pada daun di cabang-cabang tertentu diiringi pertumbuhan tunas air yang lebih banyak daripada tanaman normal (Dwiastuti 2001). Setiap varietas tanaman menunjukkan gejala klorosis yang berbeda. Jika gejalanya berat, daun menjadi lebih kaku, menebal, dan mengalami pengerasan pada tulang daun. Tajuk tanaman sakit dapat menguning secara keseluruhan serta mengalami dieback yang parah (Capoor 1963). Buah yang akan masak pada tanaman terinfeksi mengalami perubahan warna buah yang dimulai dari ujung peduncular, sedangkan buah pada tanaman sehat mengalami perubahan warna buah dari ujung stilar (Bové 2006). Selain itu, buah yang dihasilkan oleh tanaman terinfeksi tidak menguning dengan sempurna. Benih yang terkandung dalam buah juga mengalami aborsi (Rosales dan Burns 2010).

22 2 Tanaman terinfeksi dapat menunjukkan gejala internal berupa akumulasi pati yang terjadi akibat gangguan proses pengangkutan hasil fotosintesis. Gangguan proses pengangkutan mengakibatkan tanaman mengalami klorosis. Gejala klorosisnya sering disalahartikan sebagai kekurangan hara karena klorosis akibat penyakit huanglongbing mirip dengan gejala kekurangan hara Zink (Zn) (Timmer et al. 2003). Deteksi dengan teknik polymerase chain reaction (PCR) sejauh ini merupakan metode yang paling sensitif dan spesifik dalam menentukan keberadaan suatu bakteri (Hocquellet et al. 1999). Akan tetapi deteksi menggunakan PCR masih relatif mahal, membutuhkan alat khusus, dan keterampilan yang mendukung. Sehingga dalam penelitian ini dilakukan evaluasi uji akumulasi pati sebagai alternatif dalam mendeteksi penyakit huanglongbing. Keberadaan akumulasi pati pada tanaman jeruk dapat menjadi indikator bahwa tanaman tersebut telah terinfeksi penyakit. Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini adalah mendeteksi keberadaan Liberobacter asiaticus pada bagian tanaman jeruk dengan berbagai tingkat keparahan menggunakan uji akumulasi pati dan metode PCR. Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat dalam mendeteksi keberadaan penyakit huanglongbing dan patogennya secara efektif dan efisien.

23 3 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan lahan jeruk milik petani Desa Situgede, Kecamatan Bogor Barat, Kabupaten Bogor, Jawa Barat pada Agustus 2014 hingga November Metode Penentuan Contoh Tanaman dan Pengamatan Gejala Penyakit Tanaman jeruk yang digunakan adalah tanaman jeruk limau (Citrus amblycarpa) berumur 1.5 tahun milik petani di Desa Situgede, Kecamatan Bogor Barat, Kabupaten Bogor. Contoh tanaman dikategorikan berdasarkan tingkat keparahan gejala klorosis menjadi tiga tingkat, yaitu gejala berat (B), ringan (R), dan tidak bergejala (T). Tanaman yang tidak bergejala merupakan tanaman sehat yang juga dijadikan sebagai kontrol. Untuk setiap tingkat keparahan masingmasing diambil tiga ulangan. Tajuk tanaman diukur panjang, lebar, dan tingginya. Setiap ulangan tanaman dari ketiga tingkat keparahan dibagi menjadi bagian daun yang menunjukkan gejala klorosis dan tidak menunjukkan gejala klorosis. Berdasarkan pengelompokan tersebut dipilih masing-masing 15 contoh daun kemudian diukur panjang, lebar, dan rasio panjang:lebar. Deteksi Patogen Penyebab Huanglongbing dengan Uji Akumulasi Pati Tanaman contoh diambil beberapa daunnya untuk dilakukan uji akumulasi pati. Pengambilan contoh daun setiap tanaman dibagi menjadi daun bergejala dan tidak bergejala. Uji akumulasi pati ini merupakan metode yang digunakan oleh Noordam (1973) dengan sedikit modifikasi. Daun tanaman contoh direndam dalam alkohol 70% mendidih pada suhu maksimal 80 o C untuk melepas klorofil hingga daun nampak putih agak transparan. Ibu tulang daun diiris melintang dan direndam dalam larutan pewarna. Larutan tersebut dibuat dengan cara mencampurkan Iodin (I 2 ) 2% dan Kalium Iodida (KI) 6%. Setiap 1,5 ml larutan tersebut ditambahkan 30 ml asam laktat. Preparat lalu diamati menggunakan mikroskop pada perbesaran 100 kali. Deteksi Patogen Penyebab Huanglongbing dengan Polymerase Chain Reaction Contoh tanaman yang telah dikelompokkan menjadi bagian tanaman bergejala dan tidak bergejala dipisahkan bagian daun dan ranting. Daun diambil bagian tulang daunnya dan ditimbang sebanyak 0.1 gram. Bagian ranting diambil bagian kulitnya hingga terlihat jaringan kayu dan ditimbang sebanyak 0.1 gram. Masing-masing contoh jaringan tanaman tersebut dilakukan ekstraksi DNA menggunakan metode dari Doyle dan Doyle (1990). Ekstraksi dilakukan dengan menggerus contoh pada mortar dingin. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung ependorf kemudian disuspensikan dengan campuran buffer CTAB yang mengandung 1% merkaptoethanol yang telah dihangatkan pada suhu 60 o C. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, lalu dihangatkan dalam suhu 60

24 4 o C selama 1 jam. Setiap 10 menit tabung dibolak-balikkan supaya suspensi tetap homogen. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi pada 5000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung baru. Ke dalam supernatan ditambahkan 500 µl kloroform:isoamil alkohol (24:1) dan divortex selama 5 menit. Suspensi disentrifuse pada 12000rpm selama 15 menit dan diambil cairan bening pada lapisan epifasenya. Kemudian ditambahkan NaOAc 3 M ph 5.2 sebanyak 1/10 dari epifase yang dimasukkan ke dalam tube baru. Selanjutnya ditambahkan isopropanol sebanyak 2/3 campuran epifase dan NaOAc. Tabung dibolak-balikkan perlahan. Suspensi diinkubasi pada suhu -20 o C selama 24 jam. Suspensi disentrifuse pada rpm selama 10 menit. Bagian supernatan dibuang, lalu endapan DNA dicuci dengan ethanol 70% dingin (20 o C) dan disentrifuse pada rpm selama 5 menit. Bagian supernatan dibuang dan pelet dikeringkan selama 1 jam. Pelet kemudian diresuspensikan dengan ddh 2 O atau buffer TE sebanyak 30 µl. DNA hasil ekstraksi dijadikan cetakan (template) dalam reaksi PCR. Setiap 1 µl contoh hasil ekstraksi ditambahkan 12.5 µl DREAM Taq Green PCR Master Mix 2 X (PCR buffer, MgCl 2, dnntps (AGCT), taq polymerase), 1µl primer forward A2 (5 -TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT-3 ), 1 µl primer reverse J5 (5 -ACAAAAGCAGAAATAGCA CGAACAA-3 ) (Ruangwong & Akarapisan 2006), dan 9.5 µl ddh 2 O, sehingga total campuran adalah 25 µl. Kondisi PCR yang digunakan adalah denaturasi awal 92 o C selama 2 menit, denaturasi pada 94 o C selama 1 menit, annealing pada 55 o C selama 30 detik, ekstensi pada 72 o C selama 1 menit, ekstensi akhir pada 72 o C selama 10 menit, dan diakhiri dengan suhu 4 o C. Tahap berurutan denaturasi, annealing, dan ekstensi diulang sebanyak 40 kali. Reaksi amplifikasi ini menggunakan mesin PCR Gene AMP PCR System DNA hasil amplifikasi dielektroforesis menggunakan gel agarose 1%. Gel agarose dilarutkan menggunakan buffer TAE 2X. DNA yang dielektroforesis adalah sebanyak 5 µl. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 75 volt selama 30 menit. Hasil elektroforesis divisualisasi menggunakan transiluminator UV. Untuk memperkirakan ukuran DNA digunakan marker VC 1kb DNA Ladder (Vivantis). Contoh positif ditunjukkan dengan keberadaan pita DNA pada 703 pb.

25 5 HASIL DAN PEMBAHASAN Gejala Eksternal Penyakit Huanglongbing Tanaman jeruk berumur 1.5 tahun yang dikategorikan tidak bergejala memiliki tinggi lebih dari 2 meter dan keseluruhan daun berwarna hijau. Tanaman jeruk dengan kategori keparahan berat menunjukkan klorosis eksesif hampir pada seluruh daun dan tajuk tampak kerdil. Sedangkan tanaman dengan kategori keparahan ringan menunjukkan klorosis pada sebagian daun namun masih memiliki tinggi tajuk tidak berbeda nyata dengan tanaman sehat (Tabel 1 dan Gambar 1). Tabel 1 Tinggi dan lebar tajuk tanaman jeruk pada berbagai keparahan penyakit huanglongbing Tingkat gejala Tinggi tajuk (cm) Lebar tajuk (cm) Berat Ringan Tidak Bergejala 103.3a 229.0b 247.6b 46.7a 123.0b 155.0c a Angka yang diikuti huruf berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan nyata dengan Uji Berganda Duncan pada taraf 5% B R Gambar 1 Tanaman jeruk pada tingkat keparahan gejala berbeda: berat (B), ringan (R), dan tidak bergejala (T) Tanaman sakit mengalami nekrosis pada bagian floem ang tersebar secara tidak teratur pada sistem pembuluh daun-daun dewasa, sehingga menghambat aliran translokasi fotosintat. Abnormalitas anatomis yang lain sebagai akibat penghambatan translokasi fotosintat adalah terdapatnya akumulasi pati di dalam plastid. Aktivitas kambium yang terganggu mengakibatkan pembentukan floem yang berlebihan namun akhirnya mengalami nekrosis (Schneider 1968). Infeksi penyakit huanglongbing mempengaruhi proses pemindahan hara mikro dari xylem ke seluruh bagian tanaman. Hara yang tidak diserap secara sempurna mengakibatkan tanaman tidak dapat tumbuh secara optimal. Penyerapan hara yang terganggu pada tanaman jeruk yang terinfeksi menimbulkan gejala pada daun berupa klorosis. Gejala dari penyakit huanglongbing meliputi klorosis yang tidak teratur dan asimetris pada kedua sisi daun (Bassanezi et al 2009). Namun T

26 6 tidak semua gejala yang ditemukan di lapangan memiliki klorosis yang asimetris. Terdapat pula daun yang menunjukkan gejala simetris (Gambar 2). Pada tanaman B1, B2, R1, dan R3, daun bergejala menunjukkan klorosis pada bagian tulang daun dan menguning di beberapa bagian daun. Klorosis pada daun dapat terlihat dari bagian depan dan belakang daun. Pada tanaman B3 dan R3, daun yang bergejala mengalami klorosis pada seluruh bagian daun secara merata, namun bagian tulang daun masih tetap hijau. Daun pada tanaman yang terinfeksi mengalami pengerasan pada bagian tulang daun sehingga ketika diraba maka daun akan terasa lebih kaku dan cenderung lebih melengkung kedua tepinya ke arah dalam. Daun baru yang muncul tidak mengalami pengerasan pada bagian tulang daun, namun ukurannya lebih kecil jika dibandingkan dengan daun baru pada tanaman sehat. Hal ini disebabkan oleh kurangnya hara yang dibutuhkan untuk membentuk daun baru dengan ukuran normal (Gambar 2). Menurut Su dan Huang (1990), pengerasan tulang daun berhubungan dengan xylem primer yang mengalami penonjolan ke epidermis. Hasil penelitian Aubert et. al (1985) dan Graca (1991) menunjukkan bahwa pada daun yang bergejala huanglongbing didapatkan kandungan Pottasium yang tinggi dan Kalsium, Magnesium, serta Zink yang lebih rendah. BI BH RI2 RI3 RI1 Gambar 2 Daun bergejala (I) dan tidak bergejala (H) klorosis dari tanaman dengan keparahan penyakit Berat (B), Ringan (R), dan Tidak bergejala (T).

27 Pada setiap tanaman dilakukan pengukuran panjang, lebar, dan rasio panjang terhadap lebar daun (Tabel 2). Daun pada tanaman dengan tingkat keparahan berat memiliki ukuran panjang dan lebar yang lebih pendek dibandingkan dengan tanaman tingkat keparahan ringan maupun tidak bergejala. Rasio panjang terhadap lebar daun dari tanaman bergejala berat lebih tinggi dan berbeda nyata jika dibandingkan dengan bergejala ringan maupun tidak bergejala. Hal ini menunjukkan bahwa daun terinfeksi memiliki bentuk yang lebih lanset. Jika dibandingkan antara daun bergejala klorosis dan tidak bergejala pada tingkat keparahan yang sama maka daun dengan gejala klorosis memiliki ukuran yang lebih panjang, namun memiliki lebar yang lebih pendek. Daun bergejala klorosis memiliki daun yang lebih lanset dibandingkan daun tanpa gejala klorosis (Tabel 3). Tabel 2 Panjang, lebar, dan rasio panjang:lebar daun tanaman jeruk pada berbagai tingkat keparahan penyakit huanglongbing Tingkat keparahan Berat Ringan Tidak Bergejala Ukuran daun a (cm) Panjang Lebar Rasio panjang:lebar 3.85c 1.87c 2.11a 5.14b 3.10b 1.62b 6.46a 4.69a 1.65b a Angka yang diikuti huruf berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan nyata dengan Uji Berganda Duncan pada taraf 5% Tabel 3 Perbandingan panjang, lebar, dan rasio daun berdasarkan tingkat klorosis gejala huanglongbing Rasio Panjang (cm) Lebar (cm) Keparahan panjang:lebar (cm) Gejala daun tanaman Ratarata dev rata dev rata Std Rata- Std Rata- Std dev Berat klorosis non klorosis Ringan klorosis non klorosis Tidak bergejala non klorosis non klorosis Gejala Internal Uji Akumulasi Pati pada Tanaman Jeruk Kadar pati di dalam daun tanaman yang terinfeksi lebih tinggi dibandingan di dalam tanaman sehat. Pada tingkat keparahan berat dan ringan baik pada daun yang menunjukkan gejala maupun yang tidak bergejala terdapat bagian berwarna ungu kehitaman di bagian parenkim tulang daun (Tabel 4). Tanaman jeruk yang terinfeksi dan bergejala klorosis mengalami akumulasi pati pada bagian floem (Fan et al 2010). Luas area yang berwarna ungu kehitaman menunjukkan area yang terinfeksi bakteri L. asiaticus. Perbedaan luas area terinfeksi setiap daun dipengaruhi oleh konsentrasi dan daya invasi bakteri di dalam jaringan tanaman (Gambar 3). Kekurangan hara mikro tersebut menyebabkan gangguan pada proses fotosintesis dan penyebaran hasil fotosintesis. Masuknya patogen ke dalam sel floem menyebabkan reaksi molekul antara floem dan patogen. Diduga L. asiaticus 7

28 8 menghasilkan toksik yang mengganggu metabolisme tanaman (Wirawan et. al. 2004), sehingga tanaman mengalami gangguan dalam memenfaatkan hara maupun hasil fotosintesis dan menunjukkan gejala klorosis. Tabel 4 Intensitas akumulasi pati pada bagian ibu tulang daun tanaman jeruk Keparahan tanaman Gejala daun Ulangan Tingkat akumulasi pati a Berat klorosis non klorosis Ringan klorosis non klorosis Tidak bergejala non klorosis a Keterangan: = sangat banyak, = banyak, + + = sedikit, + = sangat sedikit, - = tidak ada. Deteksi Patogen Huanglongbing dengan PCR pada Tanaman Jeruk Hasil deteksi keberadaan L. asiaticus pada organ tanaman jeruk menggunakan PCR standar (tanpa optimasi) yang disajikan pada Gambar 4 ditunjukkan bahwa hasil positif pada contoh daun bergejala klorosis baik yang berasal dari tanaman dengan keparahan berat (tiga contoh BI1, BI2, dan BI3) maupun tanaman keparahan ringan (dua contoh, yaitu dengan kode RI1 dan RI2). Dengan PCR standar, bagian ranting daun dengan gejala klorosis yang memberikan hasil positif hanya pada satu contoh tanaman saja yaitu tanaman dengan tingkat keparahan berat (Contoh kode BIr1). Sedangkan pada daun dan ranting tanpa klorosis baik pada tanaman keparahan penyakit berat dan ringan tidak ditemukan hasil positif. Hasil positif tidak ditemukan pada ekstraksi DNA patogen dari tanaman tanpa gejala penyakit huanglongbing. Untuk mengonfirmasi hasil deteksi PCR standar tersebut di atas dari adanya hasil negatif semu (false negatif) atau kemungkinan adanya zat penghambat dalam DNA hasil isolasi maka dilakukan optimasi dengan amplifikasi PCR menggunakan DNA template yang berasal dari pengenceran DNA total sebesar 10-1 dari contoh tanaman yang menunjukkan hasil negatif pada PCR standar. Hasil PCR optimasi ini (Gambar 5) menunjukkan bahwa hasil positif diperoleh pada ranting dari daun dengan gejala klorosis (BIr2) dan pada daun tanpa gejala klorosis pada tanaman dengan tingkat keparahan berat (Contoh kode BH2). Lebih jauh lagi, pada tanaman dengan tingkat keparahan ringan ditemukan pula hasil positif pada daun klorosis (RI3) dan ranting baik dari yang daunnya bergejala klorosis (RIr3) maupun ranting dari daun tanpa gejala klorosis (RHr2). Sedangkan pada tanaman tanpa gejala penyakit tetap tidak ditemukan hasil positif.

29 9 BI1 BI2 BI3 BH1 BH2 BH3 RI1 RI2 RI3 RH1 RH2 RH3 T1 T2 T3 Gambar 3 Akumulasi pati ibu tulang daun klorosis (I) dan non klorosis (H) dari tanaman dengan keparahan penyakit Berat (B), Ringan (R), dan Tidak bergejala (T) menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 100 kali.

30 10 Gambar 4 Amplifikasi PCR dengan primer A2/J5 untuk huanglongbing pada tulang daun dan ranting (r) daun bergejala (I) dan tidak bergejala (H) klorosis dari tanaman dengan keparahan penyakit Berat (B), Ringan (R), dan Tidak bergejala (T)

31 Gambar 5 Amplifikasi PCR dengan primer A2/J5 untuk huanglongbing terhadap contoh DNA templat dengan pengenceran pada 10-1 dari tulang daun dan ranting (r) daun bergejala (I) dan tidak bergejala (H) klorosis dari tanaman dengan keparahan penyakit Berat (B), Ringan (R), dan Tidak bergejala (T) 11

32 12 Hasil positif deteksi PCR standar pada bagian ranting cenderung sulit diperoleh dibaningkan dari daun, namun dapat ditingkatkan dengan pengenceran terlebih DNA hasil isolasi sebelum dijadikan template dalam PCR (optimasi). Hal ini kemungkinan disebabkan bahwa keberadaan bakteri (titer) dalam ranting lebih sedikit dibandingkan dalam floem daun, di samping konsentrasi zat penghambat PCR dalam jaringan ranting mungkin lebih tinggi dibandingkan dalam daun. Menurut Wirawan et. al. (2004), bakteri penyakit huanglongbing merupakan bakteri yang menyebar melalui seluruh jaringan floem pada tanaman, akan tetapi jumlah inokulum bakteri tidak merata pada setiap jaringan.

33 13 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Tanaman yang mengalami penyakit huanglongbing mengalami gangguan dalam pertumbuhan dan perkembangan yang ditunjukkan dengan semakin parah penyakit maka tajuk tanaman menjadi semakin kerdil yang disertai dengan ukuran daun yang semakin kecil dan perubahan bentuk daun menjadi semakin lanset. Tanaman sakit memiliki daun baik yang telah mengalami klorosis dan maupun daun yang non klorosis. Semakin parah tingkat penyakit maka semakin banyak daun yang mengalami klorosis berat. Daun-daun non klorosis dari tanaman pada berbagai tingkat keparahan tidak menunjukkan perbedaan ukuran maupun perubahan bentuk. Daun yang mengalami klorosis pada tanaman sakit mengalami gangguan internal pada proses penyebaran hasil fotosintesis yang ditunjukkan dengan adanya akumulasi pati pada bagian parenkim ibu tulang daun. Konfirmasi keberadaan bakteri L. asiaticus sebagai patogen huanglongbing dengan teknik PCR menunjukkan bahwa dari semua daun-daun yang mengalami klorosis dan akumulasi pati, baik pada tanaman gejala berat maupun tanaman gejala ringan hanya beberapa saja menunjukkan hasil PCR positif terutama dengan keparahan berat. Hasil positif PCR menjadi lebih banyak termasuk dengan keparahan ringan setelah dilakukan optimasi melalui pengenceran DNA template. Deteksi PCR dari tangkai dan ibu tulang daun lebih banyak memberikan hasil positif daripada dari bagian ranting. Saran Perlu dilakukan analisis lanjut penyebab akumulasi pati pada daun serta perlu diteliti kejadian akumulasi pati dan PCR pada bagian tanaman lainnya seperti buah, akar, dan ranting.

34 14 DAFTAR PUSTAKA Aubert B, Garnier M, Guillaumin D, Herbagyandono B, Setiobudi L, Nurhadi F Greening, a serious threat for the citrus productions of the Indonesian Archipelago. Future prospects of integrated control. Fruits. 40(1): Bassanezi RB, Montesino LH, Stuchi ES Effect of huanglongbing on fruit quality of sweet orange cultivars in Brazil. J Plant Pathol. 125(1): Bové JM Huanglongbing: a destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. J Plant Pathol. 88(1):7-37. Bové JM dan Teixeira DC Diagnostics of huanglongbing: detection of the causal liberibacters, Candidatus Liberibacter asiaticus, Ca. L. Africanus, and Ca. L. Americanus, in plants and insects by electron microscopy, DNA hybridization, and PCR. Di dalam: Gotwalld TR, Dixon WN, Graham JH, Berger P, editor. Proceedings of the International Citrus Canker and Huanglongbing Research Workshop; 2005 November 7-11; Orlando. Orlando (US): United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service. hlm Capoor SP Decline of citrus trees in India. Sci India. 24(1): Chung KR, Brlansky RH Citrus diseases exotic to Florida: huanglongbing (citrus greening) [Fact Sheet PP-210]. Gainesville (US): University of Florida IFAS Extension. hlm 1-4. Tersedia pada Doyle JJ, Doyle JL A rapid total DNA preparation procedure for fresh plant tissue. Focus. 12(1): Dwiastuti ME Perkembangan deteksi penyakit CVPD jeruk di Indonesia, aplikasi dan implikasi pengendaliannya. Seminar dan Pameran Nasional Hortikultura Nov Malang (ID): Universitas Brawijaya Fan J, Chen C, Brlansky RH, Gmitter Jr FG, Li ZG Changes in carbohydrate metabolism in Citrus sinensis infected with Candidatus Liberibacter asiaticus. J Plant Pathol. 59: Graca JV Citrus greening disease. Annu Rev Phytopathol. 29: Graca JV Biology, history, and world status of huanglongbing. I Taller Intl. sobre Huanglongbing de los citricos (Candidatus Liberobacter spp.) y el psilido asiaticuo de los citricos (Diaphorina citri). Hermosillo, Sonora, Mexico. Tersedia pada: Asiatico/Memor C3ADa1Graca.pdf. Hocquellet A, Toorawa P, Bové JM, and Garniner M Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the operon. Molec Cell Probes. 13(1): Li W, Hartung JS, Levy L Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J Microbiol Methods. 6 (2005): Murray RGE, Schleifer KH Taxonomic notes: a proposal for recording the properties of putative taxa of procaryotes. Int J Syst Bacteriol. 44(1): Noordam D Identification of Plant Viruses Methods and Experiments. Wegeningen (NL): Centre of Agriculture Publishing and Documentation.

35 Rosales R, Burns JK Phytohormone changes and carbohydrate status in sweet orange fruit from huanglongbing-infected trees. J Plant Growth Regul. 30(1): Ruangwong O, Akarapisan A Detection of Candidatus Liberibacter asiaticus causing Citrus Huanglongbing disease. J Agric Technol. 2(1): Schneider H Anatomy of greening-diseased sweet orange shoots. Phytopathology. 58: Su HJ dan Huang AL The nature of Likubin Organism, life cycle, morphology, and possible strains. Proceedings of the 4th International Asia Pacific Conference on Citrus Rehabilitation Feb Chiangmay (TL). hlm Sutton BD, Duan YP, Halbert S, Sun X, Schubert T, Dixon WN Detection and identification of citrus huanglongbing (greening) in Florida. Di dalam: Gotwalld TR, Dixon WN, Graham JH, Berger P, editor. Proceedings of the International Citrus Canker and Huanglongbing Research Workshop; 2005 November 7-11; Orlando. Orlando (US): United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service. hlm 59. Timmer LW, Garnsey SM. Broadbent P Diseases of citrus. Di dalam: Ploetz RC, editor. Diseases of Tropical Fruit Crops. St. Paul (US): APS Press. hlm Tirtawidjaja S Citrus Vein-Phloem Degeneration Virus: Penyebab dari citrus chlorosis di Jawa [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor Wirawan IGP, Sulistyowati L, Wijaya IN Penyakit CVPD pada Tanaman Jeruk, Analisis Baru Berbasis Bioteknologi. Jakarta (ID): Direktoral Jenderal Bina Produksi Hortikultura, Departemen Pertanian 15

36

37 LAMPIRAN 17

38 18 Lampiran 1 Larutan Penyangga CTAB Nama bahan Konsentrasi Jumlah untuk 100 ml CTAB 2% 2 g NaCl 1.4 M g Tris 100 mm g EDTA 20 mm g Polyvinylpyrrolidone (PVP-40) 1 % 1.0 g Akuades steril - Ditambahkan sampai 100 ml Lampiran 2 Data tinggi dan lebar tajuk tanaman Keparahan Tinggi Lebar (cm) (cm) B B B R R R T T T Lampiran 3 Data Panjang daun bergejala dan tidak bergejala klorosis (cm) Keparahan Gejala B1 I H B2 I H B3 I H R1 I H R2 I H R3 I H T1 I H T2 I H T3 I H Lampiran 4 Data Lebar daun bergejala dan tidak bergejala klorosis (cm) Keparahan Gejala B1 I H B2 I H

39 B3 I H R1 I H R2 I H R3 I H T1 I H T2 I H T3 I H Lampiran 5 Data Rasio Panjang terhadap Lebar daun bergejala dan tidak bergejala klorosis (cm) Keparahan Gejala B1 I H B2 I H B3 I H R1 I H R2 I H R3 I H T1 I H T2 I H T3 I H Lampiran 6 Analisis ragam panjang daun bergejala dan tidak bergejala klorosis Sumber db JK KT F Pr > F Model <.0001 Galat Total Terkoreksi R 2 Koefisien varians Akar MSE Rata-rata panjang Sumber db JK KT F Pr > F keparahan <.0001 gejala(keparahan)

40 20 Lampiran 7 Analisis ragam lebar daun bergejala dan tidak bergejala klorosis Sumber db JK KT F Pr > F Model <.0001 Galat Total terkoreksi R 2 Koefisien varians Akar MSE Rata-rata lebar Sumber db JK KT F Pr > F keparahan <.0001 gejala(keparahan) Lampiran 8 Analisis ragam rasio daun bergejala dan tidak bergejala klorosis Sumber db JK KT F Pr > F Model <.0001 Galat Total Terkoreksi R 2 Koefisien varians Akar MSE Rata-rata rasio Sumber db JK KT F Pr > F Keparahan <.0001 Gejala(keparahan)

41 21 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Terbanggi Besar, Lampung pada 07 Juli 1993 dari seorang ibu bernama Sumarni dan bapak Bambang Setiyawan. Penulis adalah anak pertama dari tiga bersaudara. Penulis menamatkan pendidikan sekolah menengah atas di SMAN 1 Terbanggi Besar pada tahun Penulis resmi menjadi mahasiswi Institut Pertanian Bogor pada Juli 2010 melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis diterima di Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian. Penulis juga mempelajari perkuliahan minor Departemen Agronomi dan Hortikultura. Kegiatan intra dan ekstrakulikuler yang pernah diikuti penulis di IPB adalah menjadi asisten praktikum Dasar-Dasar Proteksi Tanaman (2012/2013 dan 2013/2014), Biologi Dasar (2012/2013 dan 2013/2014), Biologi Cendawan (2013/2014), Manajemen Vertebrata Hama (2013/2014), dan Pengendalian Hama Terpadu (2014/2015). Penulis juga aktif sebagai pengurus unit kegiatan mahasiswa Koperasi Mahasiswa (KOPMA) IPB pada tahun sebagai staf Pengembangan Sumber Daya Anggota (PSDA), pengurus Biro Perwakilan Angkatan Himpunan Mahasiswa Proteksi Tanaman (BPA HIMASITA) pada tahun , Anggota Organic Farming Club Proteksi Tanaman, Anggota Entomology Club Proteksi Tanaman dan Anggota Gardening and Decoration Club Institut Pertanian Bogor. Penulis juga aktif pada berbagai kepanitiaan di Institut Pertanian Bogor. Pada tahun 2012 penulis mengikuti magang keprofesian di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Institut Pertanian Bogor. Pada tahun 2013, penulis melaksanakan Kuliah Kerja Profesi di Desa Bunder, Kecamatan Widasari, Kabupaten Indramayu. Selama masa perkuliahan, penulis merupakan penerima beasiswa dari Persatuan Orangtua Mahasiswa IPB (POM IPB) pada tahun , Beasiswa Toyota Astra pada tahun , dan Beasiswa Woman International Club (WIC) Jakarta pada tahun