III. METODOLOGI PENELITIAN

III. METODOLOGI PENELITIAN A. BAHAN 1. Tikus Percobaan Tikus percobaan yang digunakan merupakan tikus jantan jenis Albino Norway Rats (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley umur 21 23 hari hasil pengembangbiakan Pusat Studi Biofarmaka-IPB. 2. Bahan Pembuatan Ransum Tikus Bahan yang digunakan dalam pembuatan ransum tikus, yaitu pati jagung, minyak jagung, kasein, daging tenderloin, isolat protein kedelai, fruit soy bar, mineral mix, vitamin mix, CMC, dan air. 3. Bahan Pembedahan Tikus Bahan yang digunakan dalam pembedahan tikus meliputi tissue, allumunium foil, alkohol 70%, dan kapas. 4. Bahan Analisis Bahan yang digunakan untuk analisis dibagi menjadi tiga bagian yaitu bahan untuk analisis proksimat, bahan untuk analisis hematologi, dan bahan untuk analisis kolesterol. Bahan yang digunakan untuk analisis proksimat meliputi K 2 SO 4, HgO, H 2 SO 4, NaOH- Na 2 S 2 O 3, indikator merah metil dan biru metil, HCl, kapas bebas lemak, heksana, etanol, dan asam borat jenuh. Bahan yang digunakan untuk analisis hematologi dan kolesterol adalah tube yang berisi larutan EDTA, batu es, larutan lyse, dilluent, dan reagen analisis kolesterol lengkap. B. ALAT 1. Alat Pemeliharaan Tikus Alat-alat yang digunakan dalam pemeliharaan tikus meliputi kandang metabolik, botol minum, timbangan tikus, wadah pakan, timbangan analitik, dan baskom plastik. 2. Alat Preparasi Sampel dan Pembuatan Ransum Preparasi sampel dan pembuatan ransum menggunakan alat yaitu drum drier, slicer, disc mill, neraca analitik, gelas piala, arloji, spatula, mortar dan ayakan ukuran 60 mesh. 3. Alat Pembedahan Tikus Alat yang digunakan dalam pembedahan tikus meliputi papan bedah, alat bedah, cawan petri, gelas kimia, timbangan analitik, dan syringe. 16

4. Alat Analisis Alat yang digunakan dalam analisis proksimat adalah sudip, neraca analitik, cawan alumunium, oven, desikator, cawan porselin, tanur, labu lemak, tabung Soxhlet, heating mantle, labu Kjedhal, hotplate, desikator, labu Erlenmeyer, buret, ph meter, labu takar, kertas saring, dan pipet. Dan alat yang digunakan untuk analisis hematologi dan profil lipid darah adalah hematology analyzer dan clinical chemistry analyzer spectra junior yang berada di Labsekda Bogor, tabung sentrifuse, dan alat sentrifuse. C. METODE PENELITIAN 1. Penelitian Pendahuluan a. Pembuatan Tepung Daging Pembuatan tepung dilakukan dengan cara yaitu daging yang akan ditepungkan diiris tipis-tipis. Daging yang telah diiris dimasukkan ke dalam drum drier pada suhu 70⁰C dengan waktu 20 detik. Bahan yang telah berbentuk grits tersebut dimasukkan ke dalam disc mill untuk dihaluskan. Setelah itu, tepung daging yang telah halus diayak dengan ayakan berukuran 60 mesh. b. Pembuatan Tepung Fruit Soy Bar Pembuatan tepung fruit soy bar dilakukan dengan cara yaitu fruit soy bar yang akan ditepungkan dihancurkan menggunakan slicer. Fruit soy bar yang telah dihancurkan dimasukkan ke dalam drum drier pada suhu 70⁰C dengam waktu 20 detik. Fruit soy bar yang telah berbentuk grits tersebut dimasukkan ke dalam disc mill untuk dihaluskan. Setelah itu, tepung fruit soy bar yang telah halus diayak dengan ayakan berukuran 60 mesh. c. Persiapan dan Pembuatan Ransum Ransum yang diberikan kepada tikus percobaan mengacu pada AOAC (Association of Official Agricultural Chemist) 1995 (Muchtadi 1993). Komposisi ransum standar disusun berdasarkan standar AOAC seperti pada Tabel 2. Tabel 2. Rancangan komposisi ransum percobaan Komponen Sumber Jumlah Perhitungan (%) Protein Protein standar/ protein uji 10% Lemak Minyak jagung 8% ( ) Mineral Campuran mineral 5% ( ) Vitamin Campuran vitamin 1% 1 % 17

Serat CMC 1% ( ) Air Air minum 5% ( ) Karbohidrat Pati jagung % sisanya 100 (lainnya) Sumber: AOAC (1995). d. Analisis Proksimat Prosedur analisis proksimat yang dilakukan terhadap 4 sampel (kasein, isolat protein kedelai, tepung daging, dan tepung fruit soy bar) dan 5 jenis ransum yang dibuat adalah sebagai berikut : 1) Kadar Air (AOAC 1999) Cawan kosong yang bersih dikeringkan dalam oven selama 1 jam dengan suhu 105 110 o C dan didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang dengan ketelitian mendekati 0.001 gram. Sebanyak 5 gram sampel dimasukkan ke dalam cawan yang telah ditimbang dan dikeringkan dalam oven pada suhu 103 110 o C selama 6-10 jam. Cawan yang telah berisi sampel tersebut selanjutnya dipindahkan ke dalam desikator, didinginkan dan ditimbang kembali. Pengeringan diulangi hingga perbedaan hasil antara 2 penimbangn tidak melebihi 0.0005 gram. Kadar air dihitung berdasarkan kehilangan berat, yaitu selisih antara berat awal dan berat akhir sampel dengan menggunakan perhitungan sebagai berikut : Kadar air (%bb) = ( ) Kadar air (%bk) = ( ) Keterangan : a = Berat cawan kosong kering (g) x = Berat sampel awal (g) y = Berat cawan + sampel kering (g) 2) Kadar Abu (SNI 01-2891-1992) Sampel (2 3 gram) ditimbang ke dalam cawan porselen yang telah diketahui bobotnya. Sampel dalam bentuk cairan diuapkan di atas penangas air sampai kering. Sampel diarangkan di atas nyala pembakar, lalu diabukan dalam tanur listrik pada suhu maksimum 550 o C sampai pengabuan selesai (sesekali pintu tanur dibuka sedikit agar oksigen bisa masuk). Kemudian, sampel didinginkan dalam desikator lalu ditimbang hingga bobot tetap. Kadar abu dihitung menggunakan perhitungan sebagai berikut: Kadar abu (%) = Keterangan : a = Berat cawan kosong kering (g) w = Berat sampel awal (g) x = Berat abu + berat cawan (g) 18

3) Kadar Protein Kasar (Metode Kjedhal) (AOAC 1995) Sampel sebanyak 0.1-0.5 gram ditimbang, kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjedhal. Ditambahkan 2 ml H 2 SO 4 pekat, 1.9 gram K 2 SO 4, 40 mg HgO dan beberapa batu didih. Sampel didestruksi hingga larutan berwarna jernih. Setelah dingin, ditambahkan sejumlah kecil air secara perlahan-lahan lalu didinginkan kembali. Isi labu dipindahkan ke dalam alat destilasi, labu dicuci, dan dibilas 2-3 kali dengan akuades dan air cucinya dipindahkan ke dalam alat destilasi dengan penambahan 8-10 ml larutan NaOH-Na 2 S 2 O 3. Labu Erlenmeyer 125 ml yang berisi larutan 5 ml H 3 BO 3 dan 2-4 tetes indikator (campuran 1 bagian metilen blue 0.2% dalam alkohol) dihubungkan dengan destilator, dimana ujung saluran destilator harus terendam di dalam larutan H 3 BO 3. Selanjutnya dilakukan destilasi hingga tertampung kira-kira 15 ml destilat berwarna hijau dalam Erlenmeyer. Selanjutnya, destilat dititrasi dengan larutan HCl 0.02 N hingga terjadi perubahan warna hijau menjadi ungu. Dan tak lupa blanko pun dititrasi. Kadar N dalam bahan pangan dapat dihitung. Lalu presentase protein dapat dihitung dengan mengalikan presentase nitrogen di dalam bahan dengan 6.25. %N = ( ) x N x 14.007 x 100 % protein = %N x 6.25 4) Kadar Lemak Kasar Metode Soxhlet (AOAC 1995) Labu lemak dikeringkan dalam oven bersuhu 100⁰C. Kemudian labu lemak didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sebanyak ± 5 gram sampel dibungkus kertas saring dan dimasukkan ke dalam tabung Soxhlet. Kondensor dirangkaikan pada bagian atas dan bagian bawahnya dihubungkan dengan labu lemak yang berisi 30 ml pelarut heksana di atas heating mantle. Refluks dilakukan selama kira-kira 6 jam. Setelah itu, sampel dikeluarkan dari tabung Soxhlet dan dilakukan destilasi heksana. Labu lemak yang berisi lemak sampel hasil ekstraksi kemudian dipanaskan dalam oven bersuhu 105⁰C selama 30 menit hingga pelarut menguap seluruhnya. Setelah dikeluarkan dari oven, labu lemak didinginkan dalam desikator selama 15 menit dan kemudian ditimbang. Kadar lemak (%) = x 100%) Keterangan : B = Bobot labu lemak + lemak hasil ekstraksi (g). A = Bobot labu lemak kosong (g). 5) Kadar Serat Kasar Sampel ditimbang sebanyak 2 gram kemudian lemaknya diekstrak menggunakan Soxhlet dengan pelarut petroleum eter. Sampel yang telah bebas lemak dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu Erlenmeyer 600 ml lalu ditambahkan 0.5 g abses yang telah dipijarkan dan 2 tetes zat anti buih. Setelah itu, ditambahkan 200 ml larutan H 2 SO 4 mendidih lalu labu Erlenmyer diletakkan di dalam pendingin balik selama 30 menit. Setelah selesai, suspensi disaring dengan kertas saring dan residu yang tertinggal 19

dicuci dengan air mendidih (pencucian dilakukan hingga air tidak bersifat asam lagi). Residu yang terdapat di kertas saring dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu Erlenmeyer kembali. Kemudian labu Erlenmeyer didihkan kembali selama 30 menit dengan pendingin balik sambil sesekali digoyang-goyangkan. Sampel disaring kembali menggunakan kertas saring yang diketahui beratnya sambil dicuci dengan K 2 SO 4 10%. Residu yang terdapat di kertas saring dicuci dengan air mendidih, kemudian dengan alkohol 95%. Setelah itu, kertas saring dikeringkan dalam oven 110 C (1-2 jam), didinginkan dalam desikator lalu ditimbang. Berat residu serat kasar dapat diketahui dengan menghitung selisih antara berat contoh dan kertas saring dengan berat kertas saring. Kadar serat kasar dihitung dengan menggunakan perhitungan sebagai berikut. Kadar serat kasar (g/100g contoh) = Keterangan : W2 = berat residu dan kertas saring yang telah dikeringkan (g) W1 = berat kertas saring (g) W = berat contoh yang dianalisis (g) 6) Kadar Karbohidrat (by Difference) Perhitungan kadar karbohidrat dilakukan dengan metode pengurangan (by difference) sebagai berikut : Karbohidrat = 100% - (kadar air + abu + protein + lemak + serat)% 2. Penelitian Utama Penelitian utama akan menguji pengaruh konsumsi fruit soy bar terhadap profil hematologi dan lipid darah tikus percobaan selama 28 hari pemberian pakan. a. Persiapan Kandang Kandang yang digunakan adalah kandang metabolik yang berukuran 17.5 x 23.75 x 17.5 cm milik Laboratorium Hewan Percobaan SEAFAST. Kandang terbuat dari stainless steel, berlokasi pada tempat yang bebas dari suara ribut, dan terjaga dari asap industri atau polutan lainnya. Lantai harus mudah dibersihkan dan disanitasi. Suhu optimum ruangan untuk tikus adalah 22-24 o C dan kelembaban udara 50-60% dengan ventilasi yang cukup (namun tidak ada jendela terbuka) (Muchtadi 1993). b. Masa Adaptasi Hewan Percobaan Tikus percobaan diadaptasikan terlebih dahulu sebelum diberi perlakuan. Masa adaptasi bertujuan untuk membiasakan tikus terhadap lingkungan percobaan. c. Seleksi Tikus dan Kelompok Perlakuan Lima hari setelah masa adaptasi, tikus diseleksi berdasarkan keseragaman bobot tubuh dan dibagi menjadi lima kelompok yaitu casein, beef, soy protein isolate, dan fruit soy bar (Tabel 3). Tiap kelompok tikus memiliki perbedaan bobot kurang dari 10 gram dan antar tikus di setiap kelompok memiliki perbedaan bobot sebesar 5 gram. 20

Tabel 3. Klasifikasi tikus perlakuan Kelompok Tikus Casein Beef Soy protein isolate Fruit soy bar Non-protein Perlakuan Tikus yang diberi ransum dengan protein kasein (standar) Tikus yang diberi ransum dengan protein daging sapi Tikus yang diberi ransum dengan protein isolat protein kedelai Tikus yang diberi ransum dengan protein fruit soy bar Tikus yang diberi ransum non-protein d. Pengukuran Bobot Tubuh Bobot tikus diukur dengan cara menimbang tikus menggunakan timbangan tikus. Penimbangan pertama dilakukan setelah masa adaptasi. Penimbangan dilakukan terusmenerus selama 28 hari. Bobot tikus dinyatakan dalam satuan gram. e. Pembedahan Tikus Pembedahan tikus dilakukan pada hari ke-29 sejak dipelihara. Tikus yang akan dibedah dipingsankan terlebih dahulu dengan metode cervical dislocation. Saat pembedahan, dilakukan pengambilan darah dengan menggunakan syringe bervolume 5 ml. Darah disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit untuk memisahkan serum dan sel-sel darah. Serum darah diambil untuk analisis profil lipid darah lengkap. f. Analisis Hematologi Analisis dilakukan di Laboratorium Kesehatan Daerah (Labsekda) Bogor dengan prosedur analisis yaitu sampel darah tikus yang diambil dari tikus dimasukkan ke dalam tube yang berisi EDTA untuk analisis hematologi dan tabung sentrifuse untuk analisi profil lipid darah. h. Analisis Lipid Darah Analisis lipid darah secara lengkap dilakukan di Laboratorium Kesehatan Daerah (Labsekda) Bogor dengan menggunakan alat clinical chemistry analyzer slectra junior. Analisis lipid darah yang dilakukan meliputi analisis kadar kolesterol total, kadar trigliserida, kadar HDL, dan kadar LDL darah. Prosedur analisis kolesterol lengkap dapat dilihat pada Lampiran 38. 3. Rancangan Percobaan Rancangan penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap, dengan model matematika sebagai berikut: Keterangan : Yij = pengaruh perlakuan pada tikus (kelompok tikus) ke-i dan ulangan ke-j µ = nilai tengah perlakuan 21

αi = pengaruh perlakuan ke-i Ɛij = galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j 22