HASIL DAN PEMBAHASAN Karakter Morfologi B.theobromae Hasil pengamatan karakter morfologi pada penelitian ini menunjukkan bahwa pertumbuhan maksimum miselium B. theobromae dari berbagai tanaman inang pada media PDA dalam cawan petri berdiameter 9 cm secara umum pada 3-5 HSI. Pada awalnya, miselium isolat asal jeruk, kakao, karet, pisang berwarna putih sampai dengan 3 HSI kemudian berubah warna menjadi abu-abu muda sampai dengan umur 4-5 HSI dan setelah 10 HSI bertambah gelap sesuai dengan pertambahan umur isolat. Isolat cendawan asal manggis awalnya berwarna putih sampai dengan 3 HSI kemudian berubah warna menjadi dominan gelap sampai dengan umur 4-5 HSI dan bertambah gelap sesuai dengan pertambahan umur isolat. Gambar 3 Koloni isolat cendawan B. theobromae dari berbagai tanaman pada umur 21 Hari Setelah Isolasi (HSI) pada media PDA. Jeruk (A); kakao (B); karet (C); pisang (D); manggis (E).
Punithalingam (1976) dalam penelitiannya menyebutkan karakter morfologi cendawan B. theobromae ditandai dengan pertumbuhan miselium dari isolat B. theobromae seperti benang rambut halus atau kapas, miselium udara berlimpah. koloni mula-mula berwarna sepia berubah menjadi abu-abu kemudian menjadi hitam. Pertumbuhan koloni secara teratur membentuk lingkar sampai koloni memenuhi cawan petri. Koloni yang telah memenuhi cawan petri pada umur isolat 21 HSI tidak hanya memperlihatkan perbedaan warna namun juga telah membentuk piknidia. Warna dan penampilan koloni isolat B. theobromae yang diamati sangat bervariasi. Koloni jeruk berwarna abu-abu muda, kakao berwarna abu-abu, karet berwarna abu-abu gelap, pisang berwarna coklat, dan manggis berwarna dominan hitam (Gambar 2). Hasil pengamatan yang ditunjukkan Gambar 3 memperlihatkan bahwa pertumbuhan koloni B. theobromae isolat asal jeruk, kakao, karet, pisang, dan manggis pada media PDA memenuhi cawan setelah mencapai 4 HSI. Pada isolat asal jeruk, karet, dan pisang pertumbuhan koloni lebih cepat dibandingkan isolat asal kakao dan manggis. Rata-rata pertumbuhan koloni diantara kelima isolat B. theobromae memperlihatkan perbedaan kecepatan tumbuh. Gambar 4 Grafik pertumbuhan koloni cendawan B. theobromae pada media PDA 16
Secara mikroskopis, bentuk hifa B. theobromae bersekat pada isolat asal jeruk, kakao, karet, dan pisang sedangkan pada isolat asal manggis hifa muda membengkak seperti sate. Hifa awalnya hialin kemudian berubah warna menjadi coklat. Khlamidospora terbentuk pada isolat asal manggis secara interkaler (Gambar 4). A B Gambar 5 Morfologi hifa dan klamidospora pada manggis. Hifa membengkak seperti sate (A); pembentukan klamidospora secara interkaler (B), dengan perbesaran 40x. Piknidia B. theobromae isolat asal jeruk, kakao, karet, pisang, dan manggis terbentuk secara berkelompok pada media WA yang diberi bahan induksi berupa potongan jerami padi dan kulit manggis (Gambar 5). Ciri ini yang membedakan piknidia B. theobromae dengan piknidia yang dihasilkan oleh Diplodia sp. Menurut Barnett dan Hunter (1999) piknidia B. theobromae terbentuk secara bergerombol dan berwarna hitam sedangkan piknidia Diplodia sp. tunggal atau tidak berkelompok. 17
Gambar 6 Piknidia B. theobromae yang terbentuk pada media WA + jerami padi (A, B, C, D) dan WA + kulit manggis (E). Jeruk (A); kakao (B); karet (C); pisang (D); manggis (E) dengan perbesaran 100x. Gambar 7 Piknidia yang pecah mengeluarkan konidia (pewarnaan dengan laktofenol) pada isolat B. theobromae. Piknidia B. theobromae yang ditumbuhkan pada media PDA dapat terbentuk pada isolat asal jeruk dan isolat asal karet sedangkan pada media WA yang diberi bahan induksi berupa potongan jerami terbentuk pada semua isolat kecuali isolat asal manggis. Piknida isolat asal manggis hanya dapat terbentuk pada media WA yang diberi bahan induksi berupa kulit manggis (Tabel 1). Hal ini menunjukkan bahwa dalam pembentukan piknidia diperlukan nutrisi tertentu agar dapat memaksimumkan pembentukannya. Menurut Winarsih (2007) jerami padi mengandung serat sampai 67%. Kandungan serat yang tinggi ini yang memicu pertumbuhan dan merangsang sporulasi cendawan. Salah satu enzim yang penting 18
dihasilkan cendawan adalah enzim selulase. B.theobromae adalah salah satu cendawan yang menghasilkan enzim selulase. Menurut Shivas dan Beasley (2005) media agar-agar yang kaya sumber gulanya merupakan kondisi yang tidak baik untuk terjadinya sporulasi pada kebanyakan cendawan patogen tanaman. Sporulasi biasanya ditingkatkan dengan penambahan material daun inang yang telah disterilkan, misalnya jerami gandum, daun jagung, daun bunga anyelir, atau media yang kurus seperti WA. Tabel 1 Pembentukan piknidia cendawan B. theobromae asal beberapa tanaman pada berbagai media sampai dengan 34 HSI Media pembentukan piknidia Piknidia B. theobromae asal Jeruk Kakao Karet Pisang Manggis PDA + - + - - WA + jerami padi + + + + - WA + pelepah pisang - - - - - WA + kulit manggis - - - - + Keterangan: + Piknidia terbentuk - Piknidia tidak terbentuk Konidia B. theobromae secara umum berbentuk jorong atau ovoid, hialin, tidak bersekat, dan memiliki dinding ganda saat muda dan saat matang berwarna coklat, bersekat, dan memiliki dinding tunggal. Pada konidia isolat asal jeruk, kakao, karet yang masih muda konidia hialin, tidak bersekat, dan memiliki dinding ganda namun setelah matang menjadi berwarna coklat, bersekat tebal seperti membentuk dua buah sel, dan memiliki dinding tunggal yang tebal. Barnett dan Hunter (1999) mendeskripsikan cendawan B.theobromae memiliki kekhasan yang ditandai dengan piknidia berwarna gelap dan terbentuk secara berkelompok dalam stroma, konidia berwarna gelap dan memiliki dua buah sel saat matang, berbentuk jorong atau ovoid. Konidia B. theobromae asal isolat jeruk, kakao, karet, pisang, dan manggis memiliki ukuran yang berbeda-beda (Tabel 2). Konidia pada jeruk berukuran 24-29 µm x 10-15 µm, konidia kakao berukuran 23-24 µm x 12-15 µm, konidia karet berukuran 22-26 µm x 10-16 µm, konidia pisang berukuran 14-16 µm x 9-11 µm, dan konidia manggis berukuran 10-16 µm x 6-10 µm. Menurut Semangun (2007) rata-rata konidia pada jeruk berukuran 24 µm x 15 µm, sedangkan pada kakao 19
konidia berukuran 24-30 µm x 11,5 13,5 µm (Semangun 2000). B. theobromae pada pisang memiliki konidia berukuran 20-30 µm x 10-18 µm (Goos 1961). Ukuran konidia bervariasi yaitu panjangnya 10,00 µm 28,64 µm, lebarnya 6,36 µm 15,91 µm, dan tebal dindingnya 0,80 µm 2,50 µm. Pavlic et al. (2004) menemukan ciri umum pada isolat B.theobromae yang berasal dari Amerika Serikat, Amerika Selatan, Afrika Selatan dan Asia memiliki konidia berukuran 18 30 µm x 10 15 µm. Hasil uji lanjut Duncan's Multiple Range Test (DMRT) pada tabel 2 menunjukkan bahwa ukuran panjang, lebar, dan tebal dinding konidia muda berbeda sangat nyata pada isolat asal jeruk, kakao, karet, pisang, dan manggis. Perbedaan yang ditunjukkan oleh konidia muda memperlihatkan keragaman ukuran konidia cendawan B. theobromae yang diperoleh dari inang berbeda. Pada konidia muda asal isolat jeruk memiliki rasio panjang/lebar tertinggi yaitu 2,18 dan konidia muda asal isolat manggis memiliki nilai rasio panjang/lebar terendah yaitu 1,50. Hal ini menunjukkan bentuk konidia yang semakin elips memiliki nilai rasio panjang/lebar yang tinggi dan cenderung bulat untuk nilai rasio panjang/lebar yang rendah. Tabel 2 Ukuran panjang, lebar, dan tebal dinding konidia muda cendawan B. theobromae pada lima tanaman inang Ukuran Konidia B. theobromae Rasio Tebal dinding Panjang (µm) Lebar (µm) panjang/lebar (µm) Jeruk 25,68 ± 1,62 a 11,95 ± 1,44 b 2,18 ± 0,34 a 1,23 ± 0,28 c Kakao 23,26 ± 0,53 b 14,02 ± 1,20 a 1,82 ± 0,12 b 1,91 ± 0,15 a Karet 24,77 ± 1,80 ab 13,79 ± 2,00 a 1,69 ± 0,22 bc 1,80 ± 0,40 a Pisang 15,32 ± 0,68 c 10,32 ± 0,91 c 1,67 ± 0,18 bc 1,52 ± 0,17 b Manggis 13,45 ± 2,08 d 8,09 ± 0,88 d 1,50 ± 0,36 c 1,34 ± 0,21 bc Keterangan: Angka selajur yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata (uji selang ganda Duncan, α = 0,01). Pada Tabel 3 menunjukkan bahwa ukuran panjang, lebar, dan tebal dinding konidia cendawan B. theobromae berbeda nyata pada isolat asal jeruk, kakao, dan karet. Perbedaan yang ditunjukkan oleh konidia matang 20
memperlihatkan keragaman ukuran konidia cendawan B. theobromae yang diperoleh dari inang berbeda. Pada konidia matang asal isolat jeruk memiliki rasio panjang/lebar 1,96, konidia asal isolat kakao 1,90, dan konidia asal isolat karet 1,83. Hasil pengukuran rasio panjang/lebar menunjukkan bahwa ukuran konidia kelima cendawan > 1 (bentuk jorong). Punithalingam (1976) dalam penelitiannya menyebutkan konidia B. theobromae memiliki bentuk subovoid-elipsoid oblong. Tabel 3 Ukuran panjang dan lebar konidia matang cendawan B. theobromae pada tiga tanaman inang B. theobromae Ukuran konidia Panjang (µm) Lebar (µm) Rasio panjang/lebar Jeruk 26,88 ± 2,52 a 13,88 ± 0,59 a 1,96 ± 0,22 a Kakao 25,38 ± 1,56 ab 13,75 ± 0,71 a 1,90 ± 0,07 a Karet 24,50 ± 1,34 b 13,00 ± 1,05 b 1,83 ± 0,20 a Keterangan: Angka selajur yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata (uji selang ganda Duncan, α = 0.05). Konidia secara umum berbentuk jorong atau ovoid, hialin, tidak bersekat, dan memiliki dinding ganda saat muda dan saat matang berwarna coklat, bersekat, dan memiliki dinding tunggal. Pada konidia jeruk, kakao, karet yang masih muda konidia hialin, tidak bersekat, dan memiliki dinding ganda (Gambar 7) namun setelah matang menjadi berwarna coklat, bersekat tebal seperti membentuk dua buah sel, dan memiliki dinding tunggal yang tebal (Gambar 8). Barnett dan Hunter (1999) mendeskripsikan cendawan B.theobromae memiliki kekhasan yang ditandai dengan piknidia berwarna gelap dan terbentuk secara berkelompok dalam stroma. Konidia hialin dan tidak bersekat saat muda. Konidia berwarna gelap dan memiliki dua buah sel saat matang. Konidia berbentuk jorong atau ovoid. 21
Gambar 8 Konidia muda isolat cendawan B. theobromae dari berbagai tanaman inang. Jeruk (A); karet (B); kakao (C); manggis (D); pisang (E) dengan perbesaran 100x. Gambar 9 Konidia matang isolat cendawan B. theobromae dari berbagai tanaman inang.jeruk (A); karet (B); kakao (C) dengan perbesaran 100x. Karakter Molekuler B. theobromae Penanda molekuler DNA telah digunakan untuk mengenali dan mengkarakterisasi populasi cendawan. Teknik RAPD sering digunakan untuk membedakan organisme tingkat tinggi atau kelompok eukaryote (Suryanto 2003). B. theobromae termasuk ke dalam kelompok eukaryote sehingga teknik ini dapat digunakan untuk menganalisis DNA cendawan tersebut. Teknik RAPD melibatkan penempelan primer tertentu yang dirancang sesuai dengan kebutuhan. Tiap primer dapat berbeda untuk menelaah keanekaragaman genetik kelompok yang berbeda (Suryanto 2003). Analisis molekuler dilakukan dengan teknik RAPD-PCR dengan menggunakan dua primer yaitu OPB 01 dan OPB 07. Hasil elektroforesis produk RAPD-PCR pada Gambar 10 dan Gambar 11 menunjukkan bahwa kedua primer yang digunakan mampu mengamplifikasi 22
DNA cendawan B. theobromae dari berbagai tanaman pada lokasi yang berbeda. Keberhasilan amplifikasi DNA genom dalam teknik RAPD ditentukan salah satunya oleh kesesuaian primer dan efisiensi serta optimasi proses PCR (Suryanto 2003). Kualitas pita yang tajam dipengaruhi oleh konsentrasi semua komponen dalam reaksi campuran (Edel 1998). Menurut Takamatsu (1998) komponen reaksi Mg 2+, DNA polimerase, primer, template DNA, dan suhu yang digunakan mempengaruhi konsistensi produk amplifikasi DNA. Shah et al. (2010) melaporkan bahwa pendekatan RAPD mampu mendeteksi keanekaragaman genetik B. theobromae. Dalam penelitian Henuk (2010) melalui pendekatan PCR, cendawan B. theobromae telah berhasil diidentifikasi dengan menghasilkan produk PCR yang sesuai dengan yang dilaporkan Begoude et al. (2009). Profil DNA antara kelima isolat cendawan yang ditunjukkan Tabel 4 memperlihatkan bahwa jumlah dan ukuran pita DNA yang dihasilkan berbedabeda kecuali antara isolat asal karet dan manggis menunjukkan pola yang serupa. Jumlah dan ukuran pita DNA yang dihasilkan oleh isolat asal karet dan manggis memiliki kesamaan. Hal ini menunjukkan berdasarkan penggunaan primer OPB 01 antara isolat cendawan asal jeruk, kakao, dan pisang memiliki perbedaan genetik kecuali antara isolat asal karet dan manggis. Berbeda dengan pada pita DNA yang dihasilkan oleh primer OPB 07 (Tabel 5) memperlihatkan bahwa jumlah dan ukuran pita DNA yang dihasilkan berbeda-beda kecuali antara isolat asal jeruk dan pisang. Hal ini menunjukkan berdasarkan penggunaan primer OPB 07 antara isolat cendawan asal kakao, karet, dan manggis memiliki perbedaan genetik kecuali antara isolat asal jeruk dan pisang. Berdasarkan penggunaan kedua primer dalam RAPD tersebut ditunjukkan bahwa antara kelima isolat cendawan B. theobromae terdapat perbedaan genetik. 23
2072-600- Gambar 10 Profil DNA lima isolat cendawan B. theobromae yang diamplifikasi dengan RAPD-PCR menggunakan primer OPB 01. M 1 molecular marker (DNA leader); isolat jeruk (J); isolat kakao (C); isolat karet (K); isolat pisang (P); isolat manggis (M); pembanding R. solani asal nanas (N). Tabel 4 Ukuran fragmen DNA cendawan B. theobromae asal berbagai tanaman inang menggunakan primer OPB 01 Isolat Ukuran pita DNA (bp) B. theobromae 1 2 3 4 5 6 7 Jeruk 500 700 900 1200 > 2072 Kakao 500 600 1500 2072 > 2072 Karet 500 600 900 1200 1300 1500 2072 Pisang 500 700 900 1200 1500 2072 Manggis 700 1200 2072 Kontrol 700 1300 24
2072-600- Gambar 11 Profil DNA lima isolat cendawan B. theobromae yang diamplifikasi dengan RAPD PCR menggunakan primer OPB 07. M 1 molecular marker (DNA leader); isolat jeruk (J); isolat kakao (C); isolat karet (K); isolat pisang (P); isolat manggis (M), pembanding R. solani asal nanas (N). Tabel 5 Ukuran fragmen DNA cendawan B. theobromae asal berbagai tanaman inang menggunakan primer OPB 07 Isolat Ukuran pita DNA (bp) B. theobromae 1 2 3 4 5 6 7 8 Jeruk 1200 2072 > 2072 Kakao 800 1000 > 2072 Karet 800 1200 1300 1500 1600 1700 2072 > 2072 Pisang 800 1000 1100 1700 2072 >2072 Manggis 500 1000 1700 >2072 Kontrol 800 1000 1100 1200 1600 2072 25