DOSEN PEMBIMBING: Awik Puji Dyah Nurhayati, S.si, M.Si Prof. Dr. Drs. Sukardiman. Apt. M.Sc. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Spons Laut Aaptos suberitoides terhadap Sel Kanker Colon WiDr secara in vitro LOGO
Latar Belakang Tigabesarkankeryang melanda wanita Indonesia: Kanker serviks, Kanker payudara, Kanker kolon (Tjindarbumi dan Mangunkusumo, 2002 dalam Heti, 2008) Existing condition of antineoplastik: Kemoterapi: menimbulkan efek samping Pembedahan : tidak dapat dilakukan jika telah metastesis Alternatif: Herbal Spons Menghasilkan Metabolit Sekunder Aaptos suberitoides berpotensi sebagai obat antikanker aaptamin (Nurhayati et al, 2008). Aaptamin (alkaloid) berpotensi sebagai obat anti kanker Uji in vivo Brine Shrimp Lethality Test (BST) LC50 sebesar 134 ± 36.6 ppm (Nurhayati et al., 2008). Uji Sitotoksisitas Potensi Sitotoksik ekstrak spons laut A. suberitoides.
Permasalahan Sitotoksi sitas in vivo Sitotok sisitas?? in vitro BST (Studi pendahuluan) Aaptos suberitoides memiliki senyawa bioaktif paling potensial untuk antikanker dengan nilai LC 50 134.13621362 ± 36.6114 ppm Mengetahui aktivitas it Aaptos suberitoides dalam menghambat pertumbuhan sel-sel kanker Bagaimana mengukur kemampuan ekstrak spons Aaptos suberitoides dalam menghambat pertumbuhan sel kanker kolon WiDr dengan kajian sitotoksisitas.
Uji apoptosis sel jumlah sel hidup dan sel yang mengalami apoptosis dimana sel hidup tampak berwarna hijau sedangkan sel yang mengalami apoptosis berwarna orange
untuk melakukanevaluasi evaluasi invitro toksisitas ekstrakspons laut Aaptosis suberitoides terhadap pertumbuhan sel kanker kolon WiDr Sebagai produk farmasi untuk dasar pengembangan obat antikanker baru Manfaat Sebagai dasar pengembangan dalam upaya pemanfaatan sumber daya hayati laut di Jawa Timur
Metodologi Penelitian Waktu Bulan Juni-Agustus 2010 Tempat Laboratorium Program Studi Biologi FMIPA ITS Surabaya LPPT UGM Yogyakarta
Skema Kerja Pemanenan Sel Kanker Propagasi Sel Kanker Penentuan Konsentrasi Eksrtrak spons dan cisplatin Pembuatan Medium Kultur (Penumbuh) RPMI 1640 Uji Sitotoksisitas MTT Doubling Time
1. Uji Sitotoksisitas dengan Metode MTT (OD kontrol sel OD kontroal media) (OD sampel OD kontrol media) x 100% OD kontrol sel OD kontrol media
Pengamatan Kinetika Proliferasi Sel Kehidupan sel (%) = (Absorbansi sumuran uji absorbansi kontrol media) x 100% Absorbansi kontrol sel absorbansi kontrol media ANOVA HASIL Uji Least Significant Difference (LSD)
Pengamatan Apoptosis Sel WiDr Data Kuantitatif Pengamatan Morfologi Data kualitatif tif %A i J l h l i 100% % Apoptosis = Jumlah sel apoptosis x 100% Total sel
Presentase kematian sel kanker kolon WiDr perlakuan kontrol, ekstrak, dan cisplatin setelah inkubasi 24 jam dengan pewarnaan MTT Perlakuan Konsentrasi (μg/ml) % kematian Perlakuan Konsentrasi (μg/ml) % kematian 7,5 6,147 Ekstraks spons laut 1440 94,846 15 10,686 A.suberitoides 1920 90,496 Ekstraks spons laut A.suberitoides 30 15,603 Kontrol negatif 0 4,728 60 18,77 2 6.195 120 19,385 4 16.135 Cisplatin 240 31,253 8 29.866 480 89,551 16 63.939 960 98,676
Hasil uji sitotoksisitas ekstrak spons laut A.suberitoides dengan metode MTT assay 120.000 100.000 persen kem matian sel( (%) 80.000000 60.000 40.000 20.000 0.000 20.000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 log konsentrasi ekstrak
Nilai LC 50 uji sitotoksisitas metode MTT assay Berdasarkan nilai LC 50 ekstrak spons A.suberitoides bersifat tidak toksik terhadap sel kanker WiDr. Ekstrak A.suberitoides 500,310 µg/ml Standar NCI : suatu senyawa bersifat sitotoksik jika LC 50 lebih kecil dari 20 μg/ml (Suffness, 1991 dalam Puspitasari, 2001) Cisplatin 12,813 µg/ml
Hasil uji statistik Uji Anova (Analysis of Variance): p<005artinya 0,05 artinya.. Terdapat perbedaan secara bemakna antar konsentrasi perlakuan ekstrak F hitung > F tabel pada α= 0,05 (F hitung = 481,227 F tabel = 2,77) artinya.. ada pengaruh penambahan ekstrak pada sel WiDr Uji LSD Secara umum nilai LSD rata-rata lebih besar daripada harga LSD hitung maka terdapat perbedaan bermakna dari masing-masing konsentrasi
Prosentase kehidupan sel WiDr dengan perlakuan ekstrak spons laut hasil uji doubling time Waktu inkubasi Konsentrasi (jam) sampel (µg/ml) % hidup 144,54 40,413 24 48 72 72,27 41,585 36,135 49,226 0 100,047 144,54 25,917 72,27 42,903 36,135 53,030 0 100,040 144,54 14,449 72,27 24,501 36,135 32,058
Korelasi antara prosentase hidup sel WiDr dengan berbagai waktu inkubasi hasil uji doubling time menggunakan ekstrak 60.000 144.54 50.000 72.27 36.135 Kehidupan Sel (%) 40.000 30.000 Linear (144.54) Linear (72.27) Linear (36.135) Linear (36.135) 20.000 10.000 y = 0.357x + 61.94 R² = 0.590 0.000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Waktu Inkubasi y = 0.355x + 53.41 R² = 0.692 y = 0.540x + 52.89 R² = 0.995
Korelasi antara prosentase hidup sel WiDr dengan berbagai waktu inkubasi hasil ujidoubling time menggunakancisplatin 60.000 12.05 50.000000 6.025 40.000 3.0125 Linear (12.05) 30.000 Linear (6.025) Kehidu upan sel (% %) 20.000 10.000 Linear (3.0125) y = 0.294x + 59.26 R² = 0.961 0.000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 y = 0.268x + 50.69 R² = 0.996 0996 10.000 20.000 Waktu inkubasi (jam) y = 1.091x + 65.62 R² = 0.996
Inhibitory Concentration 50 (IC 50 ) Perlakuan Nilai IC 50 Ekstrak spos laut A.suberitoides Cisplatin 46,45 µg/ml 2.613 µg/ml Berdasarkan Mans et.al (2000) dalam Arjuna (2007) ekstrak spon laut A.suberitoides berpotensi untuk dikembangkansebagai antikanker
Aktivitas sitotoksik terjadi dengan menginduksi apoptosis (Coutinho, 2002) Spons A.suberitoides menghasilkan senyawa bioaktif aaptamin (Coutinho, 2002) Aaptamin peningkatan apoptosis induksi ekspresi dari protein p21 yang berfungsi untuk menahan siklus sel pada fase G2/M
Pengamatan Apoptosis Morfologi sel WiDr sebagai kontrol Morfologi sel WiDr perlakuan cisplatin Morfologi sel WiDr sebagai kontrol Pelarut Morfologi sel WiDr perlakuan ekstrak
Prosentase Kematian secara Apoptosis p Perlakuan Rata rata Prosentase Apoptosis LC 50 Ekstrak A.suberitoides 28,024 LC 50 cisplatin 67,094 Kontrol sel 0,000 Kontrol DMSO 0,253
Apoptosis sel WiDr Pewarna doublestaining Ethidium bromide dan acridine orange mampu menembus membran sel kemudian berinterkasi dengan DNA Sel hidup acridine orange berpendar dengan warna hijau Sel mati ethidium bromide berpendar orange Acridine orange dapat memasuki sel dan mewarnai inti sel menjadi hijau Ehidi Ethidium bromide hanya dapat memasuki sel yang mengalami kerusakan membran dan mewarnai inti sel menjadi merah.
Secara morfologi apoptosis.. 1. Pengerutan sel sitoplasmanya padat 2. Kondensasi kromatin (piknotik) 3. Intinya sendiri dapat pecah membentuk 2 fragmen atau lebih (karyorhexis) 4. Pembentukan tonjolan sitoplasma bebbling 5. Fagositosis oleh sel tetangga (Contran, 1999)
Kesimpulan 1. Aktivitas sitotoksisitas ekstrak spons laut A.suberitoides ditunjukkan dengan nilai LC 50 (Lethal concentration 50%) sebesar 500,310 μg/ml dan aktivitas penghambatan proliferasi sel kanker ditunjukkan dengan IC 50 (Inhibitory Concentration 50%) sebesar 46,4545 μg/ml inkubasi 48 jam. 2. Prosentase kematian secara apoptosis pada konsentrasi LC 50 adalah 28,024% untuk ekstrak A.suberitoides dan 67,094% untuk cisplatin
Terimakasih.. ih LOGO
Pembuatan Medium Kultur RPMI 1640 Fetal Bovine Serum (FBS) 10% dimasukkan ke dalam botol steril ditambah 2 ml penisilin streptomisinstreptomisin 1% ditambah 1mL fungizon 0,5% disterilisasi ditambah 200 ml medium RPMI 1640 murni semuaperlakuan dibuatdi dalam LAF disimpan di dalam lemari pendingin pada suhu ± 4 C Hasil
Penentuan Konsentrasi Ekstrak Spons Ekstrak diperkecil konsentasi untuk memperoleh nilai LC50 yang akurat terdiri dari 10 seri kadar bertingkat yaitu 7,5; 5;15; 30; 60; 120; 240; 480; 960; 1440; 1920 µg/ml dimasukkan 1 ml DMSO 10% steril ditambahkanmediumpenumbuh medium RPMI1640 dibuat larutan uji dalam Laminar Air Flow. Hasil
Penentuan Konsentrasi Cisplatin Cisplatin Hasil disiapkan larutan dengan konsentrasi 1.000 µg/ml dilakukan pengenceran dengan seri yang sama seperti pembuatan larutan uji sehingga diperoleh 4 seri kadar bertingkat yaitu 2; 4; 8; 16 µg/ml. semua perlakuan di atas dilakukan k dalam Laminar Air Flow
Propagasi Sel Kanker Ampul Kultur Sel Kanker diambil dari stok yang disimpan dalam tangki cair yang diletakkan dalam locator pada suhu 196 C dicairkan dalam air sampai suhunyamencapai ± 37 C Ampul Kultur Sel disemprot dengan alcohol 70% HeLa dibuka dan sel dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi 10ml medium RPMI 1640 Suspensi Sel Kanker Hasil disentrifuge suspensi sel dengan kecepatan 1500 rpm selama ± 5 menit Supernatan dibuang, pellet ditambah 1 ml medium penumbuh RPMI 1640 yang mengandung FBS 10% diresuspensikan perlahan sampai homogeny ditumbuhkan dalam beberapa (2 3) buah tissue culture flask kecil diinkubasi dalam incubator pada suhu 37 C dengan aliran 5% CO 2 dan 95% O 2 selama 24 jam media diganti ditumbuhkan sel sampai konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian
Sel Kanker Pemanenan Sel dilihat hingga jumlahnya cukup atau konfluen (± 70%) lalu medium digantii dengan medium RPMI 1640 baru sebanyak k5 ml diresuspensi secara perlahan dengan menggunakan pipet untuk melepaskan sel dari dinding flask dipindahkan ke dalam tabung konus (conical) steril dimasukkan ke dalam bilik haemacytometer sebanyak 10 µl untuk dihitung jumlahnya dibawah mikroskop inverted ditambah sejumlah medium kultur RPMI 1640 sehingga diperoleh konsenrasi sel sebesar 3 x 10 4 sel/ 100 µl media siap digunakan untuk penelitian Hasil
Uji Sitotoksisitas Metode MTT (Microculture Tetrazolium) Suspensi Sel Kanker didistribusikan 100 µl dg kepadatan 3 x 10 4 sel/100 µl media ke dalam sumuran diinkubasikan selama 24 jam Medium kultur didistribusik an 100 µl ke sumuran Ditambahkan 100 µl ekstrak 15;30:60;120 µg/ml ditambahkan 100 µl doxorubicin 2;4;8;16 µg/ml ditambahkan 100 µl medium kultur ditambahkan 100 µl DMSO 15;30.60;120 µg/ml diinkubasi selama 24 jam Perla kuan ekstrak Kontrol Positif Kontrol Sel Kontrol pelarut Kontrol mediu m Dibuang media kultur diinkubasi i 24 jam dg 5% CO2 95% O2 ELISA reader diinkubasi semalam dibungkus aluminium foil ditambah 10 µl lar. MTT diinkubasi 3-4 jam reagen stopper SDS (100 µl) diseker ±5
Pengamatan Kinetika Proliferasi Sel ( Uji Doubling Time) Suspensi Sel Kanker diistribusikan 100 µl dg kepadatan 3 x 10 4 sel/100 µl media ke dalam sumuran diinkubasikan selama 24 jam Medium kultur Ditambahkan 100 µl larutan uji pada konsentrasi LC 50 dan 2 dibawah LC 50 ditambahkan 100 µl doxorubicin pada pada konsentrasi LC 50 dan 2 dibawahlc 50 ditambahkan 100 µl medium kultur Perlaku an ekstrak kt k Dibuang media kultur Kontrol Positif Kontrol Sel diinkubasi 24; 48; 72 jam ELISA reader ditambah1 0 µl lar. MTT diinkubasi 3-4 jam reagen stopper SDS (100 µl) ditambahkan diinkubasi 100 µl DMSO semalam pada Kontrol konsentrasi LC 50 pelarut diseker didistribu dan 2 dibawah nya ±5 sikan 100 µl ke sumuran diinkubasika n selama 24 jam dibungkus aluminium foil
Uji Apopotosis dengan Metode Double Staining Suspensi Sel Kanker Ditambahkan 500 µl larutan uji pada konsentrasi LC 50 dan 2 dibawah LC 50 didistribusikan 500 µl dg kepadatan 3 x 10 4 sel/100 µl media ke dalam sumuran ditambahkan 500 µl doxorubicin pada konsentrasi LC 50 dan 2 Perlaku an ekstrak Kontrol Positif difoto diinkubasi 24; 48; 72 jam diamati di bawah mikroskop fluroseen Didiamkan ± 2 menit dibawah LC 50 diinkubasikan selama 24 jam dg CO 0 2 37 C ditambahkan 500 µl medium kultur Kontrol Sel Dibuang media kultur Ditambah 5µl lar.staining Medium kultur didistribuib sikan 100 µl ke sumuran ditambahkan 500 µl DMSO diinkubasikan selama 24 jam Kontrol pelarut Kontrol medium diletakkan pada gelas benda Poly L Lysine rangkap dua
UjiApoptosis: p Pembuatan Larutan Staining 50 mg ethidium bromide + 15 mg acridine orange 1 ml ethanol 95% 49 ml aquades diambil larutan stok 1 ml diencerkan dalam PBS perbandingan 1:100 100