BAHAN DAN METODE. Tempat dan Waktu Penelitian. Metode Penelitian

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Pengambilan sampel dilakukan pada 3 lokasi yang berbeda, yaitu: Dusun Sidomukti, Desa Kopeng, Kecamatan Getasan, Kabupaten Semarang pada ketinggian 1200-1400 m dpl (07 23 26 S, 110 24 42 E dan 07 24 16 S, 110 22 19 E); dan Dusun Deles, Desa Jogonayan, Kecamatan Ngablak, Kabupaten Magelang pada ketinggian 1400-1600 m dpl (07 24 34 S, 110 24 37 E dan 07 23 47 S, 110 24 53 E) dan >1600 m dpl ( 07 25 S dan 110 24 50 E). Identifikasi spesies Meloidogyne spp. dilakukan di Laboratorium Nematologi Tumbuhan dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan dari bulan April hingga November 2012. Metode Penelitian Penelitian dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu: survei dan pendataan, identifikasi gejala penyakit di lapangan, identifikasi spesies Meloidogyne spp. berdasarkan morfologi sidik pantat dan teknik Polymerace Chain Reaction (PCR), dan analisis distribusi spesies Meloidogyne spp. Survei dan Pendataan Survei Survei dilakukan secara acak di beberapa lahan pertanaman wortel milik petani di daerah sentra pertanaman wortel di Kabupaten Semarang dan Magelang. Lokasi penelitian tersebut dipilih dikarenakan kedua daerah tersebut merupakan sentra pertanaman wortel di Jawa Tengah dan belum adanya penelitian yang sama

20 di daerah tersebut. Survei lokasi berdasarkan keberadaan tanaman, gejala penyakit, dan ketinggian tempat. Berdasarkan hasil survei dilakukan pengambilan sampel di 3 lokasi yang berbeda, yaitu: lokasi 1 di Dusun Sidomukti, Desa Kopeng, Kecamatan Getasan, Kabupaten Semarang pada ketinggian 1200-1400 m dpl; lokasi 2 dan 3 di Dusun Deles, Desa Jogonayan, Kecamatan Ngablak, Kabupaten Magelang dengan ketinggian 1400-1600 m dpl dan >1600 m dpl. Metode pengambilan sampel tanaman/tanah yang digunakan adalah pola zig-zag, diagonal, dan tidak menutup kemungkinan menggunakan metode lain sesuai dengan kondisi di lapangan (Barker & Campbell 1981). Sampel yang diambil berupa umbi wortel yang sakit dan tanah dari setiap lokasi. Sampel wortel yang sakit sebagai bahan untuk mengetahui keberadaan nematoda dalam jaringan atau bagian dari umbi yang sakit tersebut. Sampel tanah diukur tingkat ph atau derajat keasaman tanah dan diidentifikasi jenis tanahnya. Sampel dibawa dalam keadaan lembab, sampel tanah dan umbi wortel dimasukkan ke dalam kantong plastik secara terpisah. Bagian atas tumbuhan biasanya lebih cepat membusuk sehingga harus ditempatkan di dalam kantong khusus jika ingin disimpan dalam beberapa hari (Trigiano et al. 2004). Pendataan Pendataan dilakukan untuk mengetahui informasi mengenai keadaan atau kondisi tanaman di lapangan. Pendataan yang dilakukan meliputi wilayah lahan, ketinggian tempat, luas kebun, varietas wortel yang ditanam, produksi, kehilangan hasil, jumlah dan tipe puru, keberadaan wortel bercabang, adanya hairy root, teknik pengolahan tanah, intensitas dan asal irigasi, jenis tanah, dosis pupuk kandang, penggunaan pupuk kimia dan nematisida. Hasil pendataan digunakan untuk mengidentifikasi faktor-faktor yang menyebabkan terjadinya infeksi, keragaman gejala yang muncul, populasi, dan distribusi setiap spesies Meloidogyne spp.

21 Pengambilan Sampel Wortel Sakit Penentuan lokasi untuk pengambilan sampel dilakukan berdasarkan keberadaan tanaman, gejala penyakit, dan ketinggian tempat. Metode pengambilan sampel yang digunakan adalah pola zig-zag, diagonal, dan metode lain sesuai dengan kondisi di lapangan (Barker & Campbell 1981). Sampel yang diambil berupa umbi wortel yang sakit dan tanah dari setiap lokasi pengambilan sampel. Sampel dimasukkan ke dalam kantong plastik dan ditata dalam cooling box. Penghitungan Tingkat Kejadian Penyakit oleh Meloidogyne spp. Penghitungan persentase kejadian penyakit dilakukan saat sedang melakukan panen wortel. Hal tersebut memudahkan dalam melihat gejala dan menentukan jumlah sampel yang diamati. Sampel wortel sakit yang digunakan sebanyak 100 umbi. Pengambilan sampel dari setiap guludan secara acak sistematis. Perhitungan kejadian penyakit menggunakan rumus sebagi berikut: Kejadian penyakit (%) : Σ Σ x 100% Identifikasi Spesies NPA Berdasarkan Morfologi Sidik Pantat Nematoda di dalam jaringan tumbuhan dapat dicat setempat atau dipisahkan dari jaringan. Nematoda yang telah dipisahkan dari jaringan tumbuhan dan tanah harus segera dipersiapkan untuk diamati dengan mikroskop stereo. Nematoda mempunyai kandungan air yang tinggi di dalam jaringan tubuhnya, sehingga dibutuhkan metode khusus untuk membuat preparat permanen. Nematoda cenderung mengkerut dan distorsi, untuk tidak demikian maka secara bertahap air harus diganti dengan gliserin (Dropkin 1989). Pembuatan sidik pantat dapat disiapkan dari bahan akar yang telah disimpan dalam beberapa minggu di lemari

22 es. Pembuatan preparat sidik pantat berdasarkan metode yang telah dilakukan oleh Hartman & Sasser (1985) (gambar 4). Gambar 4 Teknik pembuatan preparat permanen sidik pantat nematoda betina Meloidogyne spp. (Sumber: Saavendra et al. 1997 ) Nematoda betina dewasa diambil dari puru pada jaringan atau akar. Puru tersebut diletakkan dalam cawan sirakus yang telah diisi sedikit air. Puru yang tunggal akan lebih mudah dari pada puru yang banyak isi nematoda betinanya. Jaringan akar yang menutupi nematoda betina disobek dengan pisau bedah dan jarum bedah untuk mengeluarkan nematodaa betina dewasa. Kutikula pada bagian leher betina nematoda dipotong dan tubuh betina nematoda ditekan dengann kuat hingga isii tubuhnya keluar. Bagian tubuh yang tersisa ditetesi asam laktat 45% dalam cawan petri. Asam laktatt membantu menghilangkan isi tubuh yang masih melekat pada kulit setelah dikeluarkan isi tubuhnya. Bagian pertengahan tubuh dipotong dengan pisau bedah. Pisau bedah harus dalam keadaan tajam. Kulit bagian depan dan bagian pantat nematoda diangkat dari tetesan asam laktat. Bagian pantat nematoda ditempatkan pada tempat yang datar atau gelas obyek. Bagian samping dari pantat nematoda yang terlalu lebar dipotong

23 keseluruhan hingga menyisakan bagian sidik pantatnya. Sidik pantat di pindahkan ke gelas obyek yang telah ditetesi dengan gliserin. Bagian muka sidik pantat diarahkan menghadap ke atas. Gelas obyek ditutup dengan cover glass secara perlahan. Gliserin sebaiknya ditetesi dengan tetesan yang sedikit saja. Gliserin yang terlalu banyak dapat diserap dengan kertas penyerap. Bagian sisi cover glass ditutup dengan perekat dan preparat diberi label. Preparat permanen sidik pantat nematoda dilihat dibawah mikroskop stereo untuk diamati ciri morfologinya untuk menetukan spesies nematoda. Spesies Meloidogyne spp. ditentukan berdasarkan kunci identifikasi yang telah dibuat oleh Eisenback et al. (1981). Identifikasi Spesies Meloidogyne spp. dengan Teknik PCR Ekstraksi DNA Nematoda Betina Nematoda betina sebanyak 10-20 ekor dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml. Buffer ekstrak (200 mm Tris HCl ph 8.5, 250 mm Na Cl, 25 mm EDTA ph 8.0 dan 0.5% SDS) sebanyak 150 µl ditambahkan ke dalam tabung dan nematoda digerus sampai halus dengan menggunakan cornical grinder steril. Larutan C:I = 24:1 sebanyak 150 µl ditambahkan ke dalam tabung, kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 11000 rpm. Hasil sentrifugasi akan terbentuk endapan dan supernatan, supernatan diambil sebanyak 100 µl dan dipindahkan ke dalam tabung mikro yang baru. Larutan sodium asetat (CH3COONa 3M: ph 5.2) sebanyak 0.5 volume (50 µl) ditambahkan ke dalam tabung dan disimpan dalam suhu -20 C selama 10 menit. Suspensi disentrifugasi selama 20 menit pada kecepatan 12000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil sebanyak 100 µl dan dipindahkan ke dalam tabung mikro yang baru. Sebanyak 1 volume (100 µl) isopropanol ditambahkan ke dalam tabung (larutan dibolak-balik hingga homogen) dan disimpan dalam suhu ruang selama 30 menit. Suspensi disentrifugasi selama 20 menit pada kecepatan 12000 rpm. Cairan isopropanol atau suspensi di dalam tabung dibuang dan ditambahkan 1 volume (100 µl) ethanol 80%. Suspensi disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 12000 rpm.

24 Cairan ethanol dibuang dan endapan dikeringkan. Buffer TE ph 8 ditambahkan pada tabung mikro sebanyak 30-100 µl sesuai ketebalan endapan DNA. DNA disimpan pada suhu -20 C hingga digunakan. Amplifikasi DNA Nematoda Amplifikasi DNA menggunakan mesin Thermo Cycle PCR. Primer yang digunakan dalam amplifikasi DNA berbeda untuk setiap spesies. M. incognita, M. javanica, dan M. arenaria menggunakan primer spesifik. M. hapla, M. chitwoodi, dan M. fallax menggunakan primer multipleks (tabel 2). Tabel 2 Primer yang digunakan untuk mendiagnosa keberadaan spesies Meloidogyne spp. pada deteksi dengan PCR Spesies NPA Tipe primer Sequence 5-3 Fragmen DNA (bp) Sumber M. incognita Spesifik MI-F 5 - GTG AGG ATT CAG TCT CCC AG-3 MI-R 5 - ACG AGG AAC ATA CTT CTC CGT CC-3 M. arenaria Spesifik Far 5 -TCG GCG ATA GAG GTA AAT GAC-3 Rar 5 -TCG GCG ATA GAC ACT ACA ACT-3 M. javanica Spesifik Fjav 5 -GGT GCG CGA TTG AAC TGA GC-3 Rjav 5 -CAG GCC CTT CAG TGG AAC TAT AC-3 1000 Meng et al. 2004 420 Zijlstra et al. 2000 720 Zijlstra et al. 2000

25 Spesies NPA Tipe Sequence 5-3 Fragmen Sumber primer DNA (bp) M. hapla Multipleks JMV 1 F 5 -GGA TGG 440 Wishart et al. CGT GCT TTC AAC-3 2002 JMV hapla R 5 - AAA AAT CCC CTC GAA AAA TCC ACC-3 M. chitwoodi JMV 1 F 5 -GGA TGG 540 M. fallax CGT GCT TTC AAC-3 670 JMV 2 R 5 -TTT CCC CTT ATG ATG TTT ACC C-3 PCR reagen yang digunakan terdiri dari ddh 2 O, Taq buffer 10x Mg 2+, sukrosa, dntp, primer F (forward), primer R (reverse), dan Taq DNA polymerase. Komposisi bahan yang dibuat untuk 18 kali kali reaksi yaitu untuk masing-masing spesies Meloidogyne yang akan dideteksi (M. incognita, M. javanica, M. arenaria, M. hapla, M. chitwoodi, dan M. fallax). Keenam spesies tersebut akan dideteksi pada ketiga sampel nematoda betina yang diperoleh dari ketiga lokasi ketinggian pengambilan sampel yang berbeda. Komposisi bahan dibuat untuk mendeteksi enam spesies dari masing-masing lokasi ketinggian, sehingga dibutuhkan 12 komposisi reaksi. M. incognita, M. javanica, M. arenaria dideteksi dengan menggunakan primer spesifik untuk setiap spesies Meloidogyne spp. M. hapla, M. chitwoodi, M. fallax dideteksi dengan menggunakan primer multipleks. Primer ini dapat sekaligus mendeteksi ketiga spesies tersebut. Komposisi PCR reagen yang digunakan ditunjukkan pada tabel 3.

26 Tabel 3 Komposisi bahan PCR reagen yang digunakan Bahan 1 kali reaksi (µl) 12 kali reaksi (µl) ddh 2 O 16.25 195 Taqbuffer 10x Mg 2+ 2.5 30 Sukrosa 2.5 30 dntp 0.5 6 Primer F 1 12 Primer R 1 12 Taq DNA polymerase 0.25 3 DNA nematoda 1 12 Total 25 300 Mesin PCR (thermo cycle) diprogram sesuai dengan primer yang digunakan dan spesies yang akan dideteksi. Amplifikasi DNA melalui lima tahapan yaitu denaturasi, annealing, extension/elongation, final elongation, final hold. Proses denaturasi, extension/elongation, final elongation, final hold pada proses thermo cycle setiap spesies umumnya sama, yang berbeda yaitu pada proses annealing. Proses amplifikasi DNA spesies M. incognita, yaitu proses denaturasi pada suhu 94 C selama 4 menit, annealing 57 C selama 45 detik, extension/elongation pada suhu 72 C selama 1.30 menit, siklus tersebut diulang sebanyak 45 kali. Setelah 45 siklus dilanjutkan proses final elongation pada suhu 72 C selama 7 menit dan proses final hold pada suhu 4 C. Perbedaan proses annealing pada setiap spesies dikarenakan perbedaan primer yang digunakan pada deteksi setiap spesies. Proses penempelan annealing setiap primer pada cetakan memerlukan suhu yang berbeda pada setiap prosesnya. Proses annealing M. javanica membutuhkan suhu 55 C selama 45 detik, M. arenaria 56 C selama 45 detik, dan M. hapla 50 C selama 30 detik.

27 Elektroforesis DNA Nematoda Betina Proses elektroforesis memerlukan empat komponen yaitu, 1) buffer, 2) zat padat atau medium gel. 3) arus listrik, ) dan 4) cara untuk memvisualisasikan molekul pada medium setelah elektroforesis. TAE dan TBE adalah buffer standar yang cukup membuffer daya untuk banyak aplikasi. Gel agarose murni dari agar dan digunakan biasanya pada konsentrasi 1% sampai 3%. Gel agarose digunakan untuk memisahkan asam nukleat (DNA dan RNA) dan kelas lain dari molekul, tetapi umumnya bukan untuk protein. Gel agarose dilelehkan dengan pemanasan di dalam microwave atau sumber lain, dan kemudian dituangkan secara horisontal atau dalam papan cetakan. Proses elektroforesis memerlukan muatan kutub (kutub positif dan negatif) untuk menggerakan sampel melalui gel, sehingga arus DC dibutuhkan sebagai tenaga elektromotor yang mendorong beban partikel negatif melalui gel menuju kutub negatif. Tegangan yang digunakan diantaranya 50 dan 300 V, walaupun tegangan 100 V juga digunakan dalam banyak aplikasi. Molekul DNA yang dipisahkan dalam gel agarose mudah divisualisasikan melalui pewarnaan zat warna yang berpengaruh seperti methylene blue atau melalui pewarnaan fluorescent seperti ethidium bromide (Trigiano et al. 2008). DNA nematoda hasil amplifikasi dianalisis untuk melihat visualisasi DNA melalui proses elektroforesis. Bahan yang digunakan yaitu gel agarose 1% sebanyak 25 g yang dilarutkan di dalam larutan buffer TBE (Tris-HCl 45 mm, asam borat 45 mm, EDTA 1 mm). Larutan gel agarose dipanaskan pada microwafe selama 2 kali 1 menit, kemudian didinginkan. Larutan gel agarose yang telah dingin ditambahkan EtBr 0.7 µl, kemudian dituangkan ke dalam wadah cetakan dan dibiarkan hingga mengeras. Pengukuran DNA menggunkan penanda 100 bp ladder. Setiap sampel DNA disiapkan sebanyak 10 µl dan dimasukan ke dalam sumuran yang telah terbentuk pada gel agarose dengan mikro pipet. Elektroforesis dilakukan menggunakan tegangan 50 V DC selama 60 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan transluminator UV dan direkam dengan kamera.