METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian Kegiatan identifikasi penyebab penyakit umbi bercabang pada wortel dilakukan di Laboratorium Nematologi dan Laboratorium Virologi Departemen Proteksi Tanaman Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Pengambilan sampel wortel yang terserang penyakit umbi bercabang dilakukan di daerah Dusun Sirangkel, Kecamatan Garung, Kabupaten Wonosobo, dan Dusun Condong Campur, Kecamatan Pejawaran, Kabupaten Banjarnegara. Penelitian dilakukan sejak bulan April 2011 hingga Oktober 2011. Metode Penelitian Penelitian dilakukan dalam empat tahap kegiatan: (1) survei dan pendataan, (2) identifikasi gejala penyakit pada tanaman wortel, (3) identifikasi sidik pantat, dan (4) identifikasi biologi molekuler. Survei dan Pendataan Survei Survei dilakukan secara acak di beberapa kebun wortel milik petani di daerah Dusun Sirangkel, Kecamatan Garung, Kabupaten Wonosobo, dan Dusun Condong Campur, Kecamatan Pejawaran, Kabupaten Banjarnegara. Lokasi pengambilan sampel pertama (lokasi 1) bertempat di Dusun Sirangkel dengan ketinggian lokasi 1300-1500 m dpl. Titik pengambilan sampel kedua dilakukan pula di Dusun Sirangkel dengan ketinggian yang berbeda dari lokasi pertama yakni 1500-1700 m dpl. Lokasi pengambilan sampel ketiga bertempat di Dusun Condong Campur dengan ketinggian > 1700 m dpl. Salah satu metode pengambilan sampel yang dapat digunakan adalah pola zig-zag, dan tidak menutup kemungkinan akan menggunakan metode lain sesuai dengan kondisi di lapangan (Barker and Campbell. 1981). Sampel yang diambil berupa sampel umbi dan perakaran wortel yang bergejala. Sampel umbi yang
19 bergejala diusahakan dalam keadaan lembab dan disimpan dalam kantung plastik secara terpisah. Bagian atas tumbuhan biasanya lebih cepat membusuk sehingga harus ditempatkan di dalam kantung khusus bila ingin disimpan dalam beberapa hari (Trigiano et al. 2004). Pendataan Pendataan dilakukan untuk mendapatkan informasi awal mengenai lokasi kebun, ketinggian tempat, luas kebun, varietas wortel yang ditanam, produksi per hektar, jumlah dan tipe puru, keberadaan wortel bercabang, adanya hairy root, teknik olah tanah, kedalaman olah tanah, jenis tanah, intensitas dan asal irigasi, serta penggunaan pupuk dan nematisida. Hasil pendataan dimaksudkan untuk dapat memberikan informasi tambahan tentang kondisi wilayah serta keberadaaan gejala penyakit di lahan pengamatan. Identifikasi Identifikasi Gejala Penyakit pada Tanaman Wortel Wortel yang terinfeksi oleh nematoda umumnya memiliki gejala yang terlihat pada tajuk, ditandai dengan menguningnya daun di sekitar tajuk, layu, dan tanaman menjadi kerdil. Pertumbuhan tanaman menjadi tidak maksimal akibat adanya gangguan saluran pengangkut nutrisi (xilem dan floem) (Agrios 2005). Individu tanaman yang terinfeksi tidak dapat tumbuh secara optimal sehingga terlihat berbeda dengan tanaman yang tidak terinfeksi. Selain itu, tanaman bergejala akan memperlihatkan keadaan umbi yang mengalami malformasi. Kegiatan identifikasi gejala penyakit pada pertanaman wortel dilakukan terhadap tanaman bergejala pada bagian tajuk (di atas permukaan tanah) dan terhadap perakaran tanaman. Gejala pada bagian tajuk yang diamati berupa tinggi tanaman (kerdil), warna daun (menguning, klorosis) dan kelayuan pada siang hari sedangkan gejala pada bagian perakaran (umbi) berupa bentuk, ukuran puru, dan keberadaan akar rambut (hairy root).
20 Identifikasi Spesies NPA Berdasarkan Morfologi Sidik Pantat Identifikasi dilakukan melalui sidik pantat nematoda betina. Akar-akar terinfeksi NPA dicuci untuk menghilangkan partikel tanah yang menempel. Nematoda betina yang membengkak pada jaringan puru akar dicungkil hati-hati. Bagian anterior dipotong dengan pisau khusus kemudian bagian posterior ditekan agar kandungan di dalamnya keluar. Potongan dipindahkan ke dalam laktofenol dingin (0.03% cotton blue) dan dibiarkan sedikitnya 24 jam. Bagian posterior disayat dan jaringan di dalam dibuang secara hati-hati. Sidik pantat kemudian dipindahkan ke gelas objek lain dengan ditetesi setetes laktofenol (0.01% cotton blue). Gelas penutup direkat dengan kutek kuku kemudian diamati lebih lanjut di bawah mikoskop cahaya dengan perbesaran 400x (Eisenback et al. 1981; Shurtleff and Averre 2005). Sampel betina yang diamati secara keseluruhan berjumlah 150 ekor Identifikasi Spesies NPA Secara Molekuler (PCR ITS r-dna) Identifikasi biologi molekuler dilakukan dengan menggunakan teknik PCR ITS r-dna. Secara sistematis proses dimulai dari ekstraksi DNA nematoda langsung dari akar yang berpuru. Sebanyak 0,5 g puru akar ditambahkan dengan nitrogen cair, digerus dengan mortar dan pestle. Kemudian ditambahkan buffer ekstrak (50 mm Tris-HCl ph 8.0, 0.7 NaCl, 10 mm EDTA, 1 % CTAB) hingga menjadi homogen dengan pistil. Hasil gerusan dimasukan ke dalam tabung mikro 2 ml, kemudian diinkubasi dalam penangas air (water bath) pada suhu 60 o C selama 2 jam (setiap 10 menit tabung mikro dibolak-balik untuk membantu proses lisis). Tabung mikro dari penangas selanjutnya didinginkan sekitar 3-5 menit pada suhu ruang. Proses selanjutnya adalah penambahan chloroform dengan perbandingan 1:1, dicampurkan hingga homogen dengan cara divorteks selama 3 menit. Suspensi yang terbentuk disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 12.000 rpm. Supernatan hasil sentrifugasi, diambil secara hati-hati sebanyak 500 µl dan dipindahkan ke dalam tabung mikro yang baru. Sodium asetat (CH 3 COONa 3M; ph 5,2) ditambahkan ke dalam supernatan dengan perbandingan 1:10 dan dicampur hingga homogen. Sebanyak 1 ml alkohol absolut ditambahkan untuk presipitasi DNA dan dicampur hingga
21 homogen. Selanjutnya, tabung diinkubasi pada suhu -20 o C selama 1 malam (overnight). Suspensi kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Cairan dalam tabung dibuang dan pelet (endapan DNA) yang terbentuk dicuci dengan alkohol 70% sebanyak 200 ml, kemudian dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit. Cairan alkohol yang digunakan untuk mencuci pelet dibuang dan endapan DNA dikeringkan. Buffer TE ditambahkan pada tabung mikro sebanyak 30-100 µl sesuai dengan ketebalan endapan DNA. Amplifikasi DNA menggunakan teknik PCR dengan primer spesifik untuk M. javanica, M arenaria, M. incognita, dan multipleks primer untuk M. chitwood, M. hapla, M. falax. Primer didesain dari bagian mitokondria untuk mengkode sitokrom oksidase unit II dan 16S rrna (Tabel 1). Tabel 1 Primer yang digunakan untuk setiap jenis NPA Spesies NPA Tipe Primer Sequence 5-3 Sumber M. incognita Spesifik MI-F 5 -GTG AGG ATT CAG TCT CCC AG-3 MI-R 5 -ACG AGG AAC ATA CTT CTC CGT CC-3 (Meng et al. 2004) M. javanica Spesifik Fjav 5 -GGT GCG CGA TTG AAC TGA GC-3 Rjav 5 -CAG GCC CTT CAG TGG AAC TAT AC-3 (Zijlstra et al. 2000) M. arenaria Spesifik Far 5 -TCG GCG ATA GAG GTA AAT GAC-3 Rar 5 -TCG GCG ATA GAC ACT ACA AAC T-3 (Zijlstra et al. 2000) M. hapla M. chitwood M. falax Multipleks JMV1 5 -GGA TGG CGT GCT TTC AAC- 3 /JMV2 5 -TTT CCC CTT ATG ATG TTT ACC C-3 /JMV-hapla 5 AAA AAT CC CTC GAA AAA TCC ACC-3 (Wishart et al. 2002)
22 PCR reagen yang digunakan terdiri dari ddh 2 O, Taq buffer 10x Mg 2+, sukrosa, dntp, primer F (forward), primer R (reverse), dan Taq DNA polymerase. Komposisi bahan yang digunakan dibuat untuk 18 kali reaksi dengan komposisi sesuai keterangan pada Tabel 2 berikut. Tabel 2 Komposisi bahan PCR reagen Bahan 18 Kali Reaksi (µl) 1x Reaksi (µl) ddh 2 O 292,5 16,25 Taq buffer 10x Mg 2+ 45 2,5 Sukrosa 45 2,5 dntp 9 0,5 Primer F 18 1 Primer R 18 1 Taq DNA polymerase 4,5 0,25 Total 432 25 Mesin PCR (thermo cycle) di program sesuai dengan primer yang digunakan. Barulah proses amplifikasi DNA nematoda dilakukan melalui lima tahap, yakni denaturasi, annealing, extension/elongation, final elongation, dan final hold. Proses denaturasi extension/elongation, final elongation, dan final hold untuk setiap DNA spesies Meloidogyne umumnya memerlukan suhu dan waktu yang sama, hanya proses annealing saja yang berbeda untuk setiap DNA spesies yang diuji. Proses annealing untuk setiap DNA spesies nematoda diprogram secara terpisah, tergantung primer yang digunakan. Proses anneling spesies M. incognita membutuhkan suhu antara 57-59 o C selama 45 detik, M. javanica membutuhkan suhu antara 55-58 o C selama 45 detik, M. arenaria membutuhkan suhu 56 o C selama 45 detik, dan M. hapla membutuhkan suhu 58 o C selama 45 detik. Kondisi PCR yang digunakan untuk amplifikasi adalah 94 o C selama 4 menit untuk proses denaturasi, 72 o C selama 1 menit untuk proses extension/elongation, 72 o C selama 5 menit untuk proses final elongation, dan 4 o C selama 5 menit untuk proses final hold. Siklus PCR cycle dilakukan sebanyak 45 kali. Produk PCR dari masing-masing spesies NPA dengan primer pada Tabel 1 memiliki perbedaan satu sama lain. M. incognita memiliki produk PCR yang
23 berukuran ± 1000 bp, M. javanica memiliki ukuran ± 720 bp, M. arenaria memilki ukuran ± 420 bp, dan M. hapla memiliki ukuran ± 440 bp. DNA nematoda hasil amplifikasi dianalisis untuk melihat visualisasi DNA melalui elektroforesis menggunakan gel agarose 1% dalam 40 ml buffer TBE (sebanyak 0,403 g) dengan komposisi bahan Tris-HCl 1 M ph 8 sebanyak 5 ml, EDTA 0,25 M sebanyak 2,5 ml, NaCl 2,5 M sebanyak 2,5 ml, SDS 10% sebanyak 1,25 ml, dan air 13,75 ml. Setelah agarose dipanaskan selama 2 menit dan agarose dingin, bahan tersebut ditambahkan dengan ethidium bromide sebanyak 0,5 µl untuk setiap 10 ml bahan. Kemudian sebanyak 40 ml agarose dingin dituangkan ke dalam wadah cetakan. Pengukuran DNA menggunakan penanda 1 Kb ladder. Sampel disiapkan dengan mencampurkan 7 µl sediaan DNA yang masing-masing sampel diisikan dalam sumuran gel dengan mikro pipet. Elektroforesis dilakukan dengan tegangan 100 V DC selama 20 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan transiluminator UV dan direkam dengan kamera. Selain ekstraksi menggunakan puru, digunakan pula ekstraksi nematoda betina Meloidogyne spp.. Sebanyak 20 ekor nematoda betina dimasukan ke tabung mikro 2 ml. Kemudian ditambahkan buffer ekstrak (200 mm Tris HCl: ph 8,5, 250 mm Na Cl, 25 mm EDTA: ph 8,0, dan 0,5% SDS) sebanyak 150 µl ke dalam tabung. Selanjutnya nematoda dalam tabung digerus sampai halus dengan menggunakan cornical grinder steril. Larutan sodium asetat (CH 3 COONa 3 M: ph 5,2) sebanyak 0,5 volume ditambahkan ke dalam tabung dan disimpan dalam suhu -20 0 C selama 10 menit. Kemudian suspensi tersebut disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 13.000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil dan dipindahkan ke dalam tabung mikro yang baru. Selanjutnya ditambahkan 1 volume isopropanol ke dalam tabung dan disimpan salam suhu ruang selama 30 menit. Suspensi tersebut kemudian disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 13.000 rpm. Cairan isopropanol yang digunakan dalam tabung, dibuang dan ditambahkan 1 volume alkohol 80%. Kemudian suspensi disentrifugasi kembali selama 15 menit pada kecepatan 13.000 rpm. Cairan alkohol dibuang dan endapan DNA dapat dikeringkan. Selanjutnya buffer TE ditambahkan pada tabung mikro sebanyak 30-100 µl sesuai dengan ketebalan endapan DNA.