S K R I P S I OLEH : A.A NGURAH DWI ARIESTA WIJAYA PUTRA

OPTIMASI WAKTU PRODUKSI DAN PENGHAMBATAN BAKTERIOSIN DARI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI AIR SUSU IBU (ASI) TERHADAP BAKTERI Escherichia coli ATCC 25922 S K R I P S I OLEH : A.A NGURAH DWI ARIESTA WIJAYA PUTRA 1011105024 JURUSAN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN UNIVERSITAS UDAYANA BUKIT JIMBARAN 2015

OPTIMASI WAKTU PRODUKSI DAN PENGHAMBATAN BAKTERIOSIN DARI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI AIR SUSU IBU (ASI) TERHADAP BAKTERI Escherichia coli ATCC 25922 S K R I P S I Skripsi Ini Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mencapai Gelar Sarjana Teknologi Pertanian Pada Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana Oleh A.A NGURAH DWI ARIESTA WIJAYA PUTRA 1011105024 JURUSAN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN UNIVERSITAS UDAYANA BUKIT JIMBARAN 2015 ii

A.A. Ngurah Dwi Ariesta Wijaya Putra. NIM. 1011105024. 2015. Optimasi Waktu Produksi Dan Penghambatan Bakteriosin Dari Bakteri Asam Laktat Yang Diisolasi Dari Air Susu Ibu (ASI) Terhadap Bakteri Escherichia coli ATCC 25922. Dibawah bimbingan Ir. I Gusti Ayu Ekawati, MS. sebagai Pembimbing I dan Ni Nyoman Puspawati, S.TP., M.Si. sebagai Pembimbing II. ABSTRAK Bakteriosin merupakan peptida yang bersifat antimikroba yang diproduksi oleh bakteri yang bersifat membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri lain. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui waktu optimum produksi bakteriosin dan mengetahui daya penghambatan bakteriosin dari BAL yang diisolasi dari ASI terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922. Penelitian ini terdiri dari 3 tahapan yaitu pertama adalah uji konfirmasi, kedua adalah aktivitas antimikroba SBS yang mengandung bakteriosin, dan ketiga adalah aktivitas antimikroba bakteriosin. Produksi bakteriosin dilakukan dengan menginkubasi 9 isolat BAL dalam berbagai waktu yaitu 12 jam, 24 jam, 36 jam, 48 jam, dan 60 jam. Metabolit yang dihasilkan diuji daya hambatnya dengan metode difusi agar. Hasil positif pada tahap ini dilanjutkan dengan tahap isolasi bakteriosin yang kemudian kembali diuji daya hambatnya terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922. Data hasil penelitian ini dianalisa secara deskriptif. Hasil uji konfirmasi menunjukkan bahwa isolat BAL dan Escherichia coli yang digunakan sesuai dengan karakteristik bakteri tersebut. Pada hasil uji aktivitas antimikroba SBS yang mengandung bakteriosin, menunjukkan bahwa isolat B10b memiliki zona penghambatan tertinggi yaitu sebesar 6,20 mm dengan waktu inkubasi 36 jam dan isolat B8 memiliki zona penghambatan terendah yaitu sebesar 0,10 mm dengan waktu inkubasi 48 jam. Pada hasil uji aktivitas antimikroba bakteriosin, menunjukkan bahwa isolat B10b memiliki zona penghambatan tertinggi yaitu sebesar 3,46 mm dan isolat A1 memiliki zona penghambatan terendah yaitu sebesar 1,10 mm dengan waktu inkubasi 60 jam. Kata kunci: bakteriosin, bakteri asam laktat, air susu ibu, Escherichia coli ATCC 25955. iii

A.A. Ngurah Dwi Ariesta Wijaya Putra. NIM. 1011105024. 2015. Optimization Production Time and Inhibition of Bacteriocin from Lactic Acid Bacteria isolated from breast milk against Escherichia coli ATCC 25922. Under the guidance of Ir. I Gusti Ayu Ekawati, MS. as a Supervisor I and Ni Nyoman Puspawati, S.TP., M.Si. as Supervisor II. ABSTRACT Bacteriocin is an antimicrobial peptide that is produced by bacteria that kills or inhibits the growth of other bacteria. This study aims to determine the optimum time production of bacteriocin and determine the inhibitory of LAB bacteriocin isolated from breast milk to the bacterium Escherichia coli ATCC 25922. This study consists of three stages: the first is a confirmatory test, the second is the antimicrobial activity of Cell-free Supernatant (CFS) containing bacteriocins, and the third is a bacteriocin antimicrobial activity. Bacteriocin production was performed by incubating 9 isolates of LAB in various times of 12, 24, 36, 48, and 60 hours. Metabolites produced were tested for inhibitory by wellagar diffusion method. The positive results were continued with the isolation of bacteriocin and then re-tested for the inhibitors against Escherichia coli ATCC 25922. The research data was analyzed descriptively. Confirmation test results showed that the isolates of LAB and Escherichia coli used are suitable with the characteristics of the bacteria. The results of the antimicrobial activity of CFS containing bacteriocin showed that the B10b isolate has the highest inhibition with incubation time of 36 hours with the zone inhibition of 6.20 mm, and the B8 isolate has the lowest inhibition with incubation time of 48 hours with the zone inhibition of 0.10 mm. The results of the antimicrobial activity of bacteriocin showed that the B10b isolate has the highest inhibition with incubation time of 36 hours with the zone inhibition of 3.46 mm and the A1 isolate has the lowest inhibition with incubation time of 60 hours with the zone inhibition of 1.10 mm. Keywords: bacteriocin, lactic acid bacteria, breast milk, Escherichia coli ATCC 25922. iv

RINGKASAN Escherichia coli merupakan mikroba patogen yang paling sering dijumpai pada makanan sehingga sering dijadikan indikator dalam penilaian terhadap mutu pangan. Escherichia coli pertama kali diidentifikasikan oleh dokter hewan Jerman, Theodor Escherich dalam studinya mengenai sistem pencernaan pada bayi hewan. Escherichia coli merupakan bakteri yang banyak dijumpai pada pangan terutama pada pangan yang memiliki kandungan protein tinggi seperti daging segar. Strain patogen Escherichia coli dapat menimbulkan penyakit diare berdarah, pembengkakan dan kelainan ginjal, demam, kelainan saraf, bahkan kematian (Veclerc et al., 2002). Escherichia coli ATCC 25922 merupakan strain Escherichia coli yang bersifat areob, hidup pada suhu 37 o C dan tidak memproduksi verotoksin. Strain ini khusus dipergunakan untuk riset, seperti tes kerentanan terhadap antibiotik (Anon, 2014 a ). Penanganan penyakit yang ditimbulkan oleh bakteri Escherichia coli dapat dilakukan dengan menggunakan bakteri asam laktat (BAL). Hal ini disebabkan karena BAL memiliki kemampuan sebagai antimikroba terhadap mikroba patogen. Aktivitas antimikroba yang dimiliki oleh BAL disebabkan oleh senyawa-senyawa metabolit yang dihasilkan seperti asam organik, CO2, H2O2, diasetil, dan bakteriosin. Beberapa strain BAL dapat memproduksi bakteriosin yang dapat mencegah mikroba pembusuk dan patogen (Anon, 2009 dalam Ruzanna, 2011). Kemampuan sebagai antimikroba menyebabkan BAL dapat digunakan sebagai probiotik, yaitu mikroba hidup yang apabila dikonsumsi dalam jumlah cukup mampu memberikan manfaat kesehatan v

bagi inangnya (Anon, 2001). BAL berpotensi memberikan dampak positif bagi kesehatan dan nutrisi manusia, beberapa di antaranya adalah meningkatkan nilai nutrisi makanan, mengontrol infeksi pada usus, mengendalikan beberapa tipe kanker, dan mengendalikan kolesterol dalam darah (Gilliland, 1990). BAL dapat bersumber dari makanan, feses, maupun Air Susu Ibu (ASI). Berdasarkan penelitian yang dilakukan Puspawati dan Nocianitri (2012), diperoleh 28 isolat BAL dari ASI yang diantaranya terdapat 9 isolat BAL yang memiliki sifat sebagai kandidat probiotik yaitu isolat A1, A3, A6, A8, A, B3, B7, B8, dan B10b. Karakteristik dari 9 isolat BAL tersebut adalah memiliki karakteristik gram positif, katalase negatif, bentuk koloni bulat, batang pendek dan seperti huruf Y, mampu tumbuh pada suhu 10 o C sampai suhu 45 o C, tahan dan mampu tumbuh pada media yang mengandung garam NaCl, bersifat homofermentatif (tidak memproduksi gas CO2 dari glukosa), tidak membentuk dekstran dari sukrosa, tahan dan mampu tumbuh pada ph 2 sampai ph 6, mampu tumbuh pada kondisi lingkungan yang mengandung garam empedu dari konsentrasi 0,2 mm sampai 0,6 mm. Hasil penelitian lanjutan yang dilakukan Sundari (2014), diketahui bahwa BAL yang diisolasi dari ASI memiliki aktivitas antimikroba terhadap bakteri patogen Escherichia coli ATCC 25922. Aktivitas antimikroba tersebut berasal dari senyawa-senyawa metabolit yang dihasilkan BAL berupa asam laktat, diasetil karbondioksida, hidrogen peroksida, dan bakteriosin. Pada penelitian tersebut belum diketahui waktu produksi optimum bakteriosin dari tiap isolat sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui waktu optimum produksi dan daya penghambatan Supernatan Bebas Sel (SBS) yang mengandung bakteriosin vi

dari BAL yang diisolasi dari ASI dan mengetahui daya penghambatan bakteriosin dari BAL yang diisolasi dari ASI terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922. Penelitian ini dilakukan terhadap 9 isolat BAL yang diisolasi dari ASI yaitu isolat A1, A3, A6, A8, A9, B3, B7, B8, dan B10b. Penelitian ini diawali dengan proses penyegaran dan pembuatan kultur kerja serta kultur stok terhadap 9 isolat BAL dari ASI dan bakteri Escherichia coli ATCC 25922, kemudian dimulai dengan tahap pertama yaitu uji konfirmasi terhadap isolat BAL dan bakteri Escherichia coli ATCC 25922, tahap kedua pengujian aktivitas antimikroba SBS yang mengandung bakteriosin terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922 dan tahap ketiga pengujian aktivitas antimikroba bakteriosin terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922. Produksi bakteriosin dilakukan dengan menginkubasi BAL dalam berbagai waktu inkubasi dari 12 jam, 24 jam, 36 jam, 48 jam, hingga 60 jam. Metabolit yang dihasilkan dari BAL kemudian diisolasi dan diuji dengan metode difusi agar. Data yang diperoleh dianalisa secara deskriptif. Pada uji konfirmasi seluruh isolat BAL dari ASI memiliki ciri-ciri Gram positif, katalase negatif, dan berbentuk kokus dan bakteri patogen Escherichia coli ATCC 25922 memiliki ciri-ciri gram negatif dan berbentuk batang. Pada tahap pengujian aktivitas antimikroba SBS yang mengandung bakteriosin dari 9 jenis isolat BAL yang digunakan, 2 isolat menunjukkan hasil negatif tidak ada aktivitas antimikroba sedangkan 7 isolat menunjukkan hasil positif ada penghambatan terhadap bakteri patogen Escherichia coli ATCC 25922. Isolat yang memiliki hasil positif adalah A1, A8, A9, B3, B7, B8, dan B10b. Hasil negatif dimiliki oleh vii

isolat A3 dan A6. Ketujuh isolat BAL yang menunjukkan hasil positif tersebut memiliki waktu optimum produksi bakteriosin yang berbeda-beda. Zona penghambatan yang dihasilkan pada pengujian aktivitas antimikroba SBS yang mengandung bakteriosin berkisar antara 0,10 mm sampai 6,20 mm. Hasil tertinggi dihasilkan oleh isolat B10b pada waktu inkubasi 36 jam dengan diameter zona penghambatan 6,20 mm dan hasil terendah dihasilkan oleh isolat B8 pada waktu inkubasi 48 jam dengan diameter zona penghambatan 0,10 mm. Pada isolat B7 waktu optimum produksi bakteriosin adalah 12 jam, pada isolat A8, A9, B8, dan B10b waktu optimum produksi bakteriosin adalah 36 jam, dan pada isolat A1 dan B3 waktu optimum produksi bakteriosin adalah 60 jam. Pada tahap pengujian aktivitas antimikroba bakteriosin, diameter zona penghambatan berkisar antara 1,10 mm sampai 3,46 mm. Hasil tertinggi ditunjukkan oleh isolat B10b dengan rata-rata penghambatan 3,46 mm, diikuti oleh isolat B7 dan B8 dengan rata-rata penghambatan 2,66 mm dan 2,63 mm. Isolat A8, B3, A9, dan A1 memiliki rata-rata penghambatan masing-masing 2,49 mm, 1,74 mm, 1,69 mm dan 1,10 mm. viii

LEMBAR PENGESAHAN Skripsi ini telah mendapat persetujuan pembimbing Pembimbing I Pembimbing II Ir. I Gusti Ayu Ekawati, MS. NIP. 19571216 198503 2 001 Ni Nyoman Puspawati, S.TP., M.Si NIP. 19791005 200312 2 003 Mengesahkan : Dekan Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana Dr. Ir. I Dewa Gede Mayun Permana, MS. NIP. 19591107 198603 1 004 Tanggal lulus : ix

RIWAYAT HIDUP A.A Ngurah Dwi Ariesta Wijaya Putra dilahirkan di Denpasar, Bali pada tanggal 19 April 1992. Penulis merupakan putra pertama dari tiga bersaudara dari pasangan Drs. A.A Ngurah Kesuma Putra dan Ni Luh Made Wijayati, S.E., M.Si. Penulis memulai pendidikan di TK Kumara Adi 1 Denpasar, Bali tahun 1996. Penulis menempuh pendidikan Sekolah Dasar di SD N 1 Sesetan, Denpasar Selatan, Bali tahun 1998. Pada tahun 2004 penulis melanjutkan pendidikan tingkat menengah pertama di SMP N 6 Denpasar, Bali hingga tahun 2007. Penulis menyelesaikan pendidikan tingkat menengah atas di SMA Kristen Harapan Denpasar, Bali pada tahun 2010. Pada tahun 2010 penulis tercatat sebagai mahasiswa pada Jurusan Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana melalui jalur PMDK gelombang 2. Penulis juga aktif dalam organisasi kemahasiswaan seperti Himpunan Mahasiswa Jurusan Ilmu dan Teknologi Pangan periode 2011-2012 dan Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Teknologi Pertanian periode 2012-2013. x

KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa atas segala rahmat, berkah dan karunia-nya sehingga skripsi ini dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi dengan judul Optimasi Waktu Produksi dan Penghambatan Bakteriosin dari Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Air Susu Ibu (ASI) Terhadap Bakteri Escherichia coli ATCC 25922, diselesaikan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian pada Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana. Penulisan skripsi ini tidak terlepas dari bantuan, bimbingan, serta dukungan banyak pihak, oleh karena itu pada kesempatan ini penulisan menyampaikan ucapan terima kasih kepada : 1. Ibu Ir. I Gst Ayu Ekawati, MS., sebagai dosen pembimbing I dan Ibu Ni Nyoman Puspawati, S.TP., M.Si., sebagai dosen pembimbing II yang telah meluangkan waktunya untuk membimbing, mengarahkan dan memberikan saran serta motivasi pada penulis selama penyusunan skripsi ini. 2. Bapak Dr. Ir. I Dewa Gede Mayun Permana, MS., selaku Dekan Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana. 3. Rektor Universitas Udayana melalui Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat (LPPM) atas bantuan dana penelitian Hibah Unggulan Udayana. 4. Bapak/Ibu Dosen dan pegawai di lingkungan Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana atas fasilitas dan dukungan selama menempuh kuliah hingga penyusunan skripsi. xi

5. Ibu Gung Mirah dan staff laboratorium Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana yang telah membimbing penulis selama pelaksanaan penelitian. 6. Keluarga tercinta, Ayah (Drs. A.A. Ngurah Kesuma Putra), Ibu (Ni Luh Made Wijayati, S.E., M.Si.), kakak (A.A. Sagung Rina Kesuma Dewi, S.E.), dan adik (A.A. Sagung Candra Permatasari), terima kasih atas segala motivasi, kesabaran, doa tanpa henti, dukungan baik moril dan materil yang diberikan selama kuliah hingga penyusunan skripsi. 7. Vinanta, Sri Sundari, Wira, Hugo, Arif, Wardhana, Ira dan seluruh teman angkatan 2010 yang telah membantu selama penulis melakukan penelitian terima kasih atas dukungannya. 8. Kekasih tercinta, A.A. Bulan Ginitri, S.Ked., terima kasih atas kesabaran dan dukungan tanpa henti selama menjalin kasih bersama sehingga penulis mampu menyelesaikan tugas akhir dengan baik. Penulis menyadari bahwa penyajian penulisan ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, segala bentuk saran dan kritik yang bersifat membangun kearah peningkatan kualitas sangat penulis harapkan demi kemajuan bersama. Akhir kata penulis berharap agar skripsi ini dapat bermanfaat sebagai media keilmuan serta informasi bagi semua pembaca. Bukit Jimbaran, Januari 2015 Penulis xii