BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilakukan terhadap sampel yang dikoleksi selama tujuh bulan mulai September 2009 hingga Maret 2010 di Kabupaten Indramayu. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Virologi FKH IPB. Bahan dan Alat Media transport yang digunakan adalah brain heart infusion (BHI) dalam tabung eppendorf berukuran 2 ml. Virus (A/chicken/Indonesia/SmiWN18/2009); JF302895 digunakan sebagai kontrol positif. Sampel usap diambil menggunakan cotton swab steril. Untuk isolasi genom virus digunakan MagMAX AI/ND Viral RNA Isolation kit dari Ambion, plat ekstraksi 96 sumuran, dan magnetic stand. RT-PCR konvensional menggunakan SuperScript III One Step RT-PCR with Platinum Taq dari Invitrogen dengan strip tabung PCR pada mesin BIO- RAD MJ Mini, sedangkan RRT-PCR dilakukan menggunakan Ag-Path ID One-Step RT-PCR kit dari Ambion dengan plat optik 96 sumuran pada mesin Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System. Peralatan dan bahan yang juga diperlukan selama penelitian antara lain mikropipet, tips mikropipet, titer plate shaker, vortex, alkohol, dan reservoir reagen. Sampel Sampel berasal dari sentinel dan non-sentinel yang ditempatkan di enam peternakan itik yang dibedakan berdasarkan cara itik memperoleh makanan, yaitu (tipe 1) peternakan itik angon; (tipe 2) peternakan itik dengan sistem angon dan pemberian pakan tambahan; (tipe 3) peternakan itik dengan pemberian pakan tanpa diangon dan hanya disediakan pekarangan untuk mencari makan tambahan. Pada masing-masing tipe, sentinel ditempatkan di dua peternakan dan bila terjadi kematian atau tanda terlepas maka sentinel diganti dengan itik yang ada di peternakan. Sampel yang diuji dalam penelitian ini meliputi sampel usap kloaka dan usap orofaring dari itik sentinel dan non-sentinel masing-masing sebanyak 30 ekor
32 di enam peternakan (P1-P6). Sampel sentinel berasal dari bulan pengambilan 0-6 sedangkan sampel non-sentinel berasal dari bulan pengambilan 0 dan 6. Sehingga jumlah total sampel adalah 3240 sampel usap kloaka dan orofaring. Sampel ditangani secara individual, dikemas, dan diberi kode berdasarkan jenis, asal, dan tanggal pengambilan sampel. Seluruh sampel ditransportasikan dalam rantai dingin (4-8 C) sebelum sampai ke laboratorium untuk dilakukan pengujian. Sampel usap disimpan pada kondisi deep freezer -80 C. Metode Pertama dilakukan pengujian untuk membandingkan PCR konvensional dan real time dalam mendeteksi VAI H5. Kontrol positif H5 diencerkan secara serial dengan menambahkan sampel kedalam dh 2 O dengan perbandingan 1:1. Sampel usap kloaka dan usap orofaringeal diuji keberadaan gen matriks dan VAI H5 dengan RRT-PCR. Sampel usap dipool di laboratorium sesuai jenis, peternakan asal, dan nomor individu dengan jumlah maksimal 5 sampel per pool sebelum pengujian matriks (uji tapis influenza A). Sedangkan pengujian H5 dilakukan terhadap individu dalam pool yang positif influenza A. Semua proses penanganan sampel dilakukan dalam biological safety cabinet class II. Pooling Sampel usap dikelompokkan berdasarkan bulan pengambilan (0-6), asal peternakan, dan jenis (kloaka atau orofaring). Sampel usap dari tiap peternakan/bulan yang terdiri atas 30 individu (1-30) dikelompokkan menjadi 6 pool yang masing-masing terdiri atas 5 individu. Pool kloaka pertama terdiri atas sampel kloaka individu 1-5 yang masing-masing diambil 100 µl, pool kloaka kedua terdiri atas sampel kloaka individu 6-10 yang masing-masing diambil 100 µl, dan seterusnya. Setelah didapatkan pool, sampel individu kembali disimpan dalam deep freezer untuk pengujian H5 individu bila pool didapati positif influenza A. Uji tapis yang mendeteksi gen matriks dilakukan terhadap sampel pool sedangkan deteksi gen H5 dilakukan terhadap individu dalam pool yang teridentifikasi positif uji tapis.
33 Isolasi RNA Sebanyak 50 µl sampel dimasukkan kedalam 100 µl buffer lisis pada plat ekstraksi 96 sumuran kemudian ditambahkan larutan beads magnetik sebanyak 20 µl. Plat kemudian diagitasi selama 4 menit lalu didiamkan di atas magnetic stand selama 2 menit untuk mengendapkan beads, setelah itu supernatan dibuang dengan cara disedot menggunakan mikropipet. Plat diturunkan dari magnetic stand kemudian ditambahkan 100 µl buffer pencuci I lalu diagitasi selama 30 detik dan didiamkan di atas magnetic stand selama 1 menit, setelah itu supernatan dibuang. Proses pencucian ini dilanjutkan menggunakan buffer pencuci II sebanyak dua kali setelah itu beads dikeringkan dengan cara agitasi selama 2 menit. Buffer elusi 50 µl ditambahkan untuk melarutkan RNA kemudian plat diagitasi selama 3 menit lalu didiamkan di atas magnetic stand selama 1 menit untuk mengendapkan beads, setelah itu supernatan (RNA) diambil dan dipindahkan kedalam plat 96 sumuran yang baru untuk nantinya digunakan sebagai template PCR atau disimpan pada suhu -80 C hingga digunakan. Untuk setiap proses isolasi RNA sampel disertakan satu kontrol positif (A/chicken/ Indonesia/SmiWN18/2009, accession number: JF302895) dengan nilai C t 35 dan 1-2 kontrol negatif. RT-PCR Konvensional Campuran PCR disiapkan dalam di atas cold block dalam biosafety cabinet (BSC). Secara berurutan reagen PCR dicampur kedalam tabung eppendorf kemudian disimpan pada -20 o C hingga digunakan dengan urutan dan volume/reaksi sebagai berikut: RNAse-free dh 2 O 1,5 µl, buffer 2X 12,5 µl, primer forward (20 M) 1,0 µl, primer reverse (20 M) 1,0 µl, enzim mix 1,0 µl. Sekuens primer yang digunakan sebagai berikut: H5 forward (J3): 5 -GAT AAA TTC TAG CAT GCC ATT CC-3 dan H5 reverse (B2a): 5 -TTT TGT CAA TGA TTG AGT TGA CCT TAT TGG-3 Kedalam tabung PCR dimasukkan 17 µl campuran PCR kemudian ditambahkan 8 µl RNA template hasil isolasi. Tabung ditutup kemudian di tempatkan pada thermo cycler BIO-RAD dengan kondisi sebagai berikut:
34 1. Tahap 1 (1 ): Reverse transkripsi 50 o C 30 menit; denaturasi 94 o C 4 menit. 2. Tahap 2 (35 ): Denaturasi 94 o C 45 detik; annealing 50 o C 45 detik; ekstensi 72 o C 2 menit. Hasil PCR selanjutnya dielektroforesis menggunakan agarose 1% pada 120V selama 45 menit. Hasil elektroforesis dibaca di atas uv iluminator. Real Time RT-PCR Campuran PCR disiapkan dalam di atas cold block dalam biosafety cabinet (BSC). Secara berurutan reagen PCR dicampur kedalam tabung eppendorf kemudian disimpan pada -20 o C hingga digunakan dengan urutan dan volume/reaksi sebagai berikut: RNAse-free dh 2 O 1,08 µl, buffer 2X 12,50 µl, primer forward (20 M) 0,25 µl, primer reverse (20 M) 0,25 µl, enzim mix 25X 1,00 µl, probe (6 M) 0,25 µl, dan detection enhancer 1,67 µl. Sekuens primer/probe yang digunakan sebagai berikut: matriks forward (M+25): 5 -AGA TGA GTC TTC TAA CCG AGG TCG-3 ; matriks reverse (M- 124): 5 -TGC AAA AAC ATC TTC AAG TCT CTG-3 ; probe AIV Matrix (M+64): 5 d FAM-TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA-BHQ1-3 ; H5 forward (IVA-D148H5): 5 -AAA CAG AGA GGA AAT AAG TGG AGT AAA ATT-3 ; H5 reverse (IVA-D149H5): 5 -AAA GAT AGA CCA GCT ACC ATG ATT GC- 3 ; probe IVA-H5a: 5 d FAM-TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA- BHQ1-3. Kedalam masing-masing sumuran plat optik 96 sumuran dimasukkan 17 µl campuran PCR kemudian ditambahkan 8 µl RNA template hasil isolasi. Plat ditutup dengan seal optik kemudian di tempatkan pada mesin Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System dengan kondisi berbeda untuk PCR matriks dan H5. Untuk PCR matriks, mesin diatur agar siklus PCR berjalan sebagai berikut: 1. Tahap 1 (1 ): Reverse transkripsi 45oC 10 menit; denaturasi 95oC 10 menit. 2. Tahap 2 (45 ): Denaturasi 94oC 1 detik; annealing + ekstensi 60oC 30 detik. Sedangkan untuk PCR H5, mesin diatur agar siklus PCR berjalan sebagai berikut: 1. Tahap 1 (1 ): Reverse transkripsi 45 o C 10 menit; denaturasi 95 o C 10 menit. 2. Tahap 2 (40 ): Denaturasi 94 o C 1 detik; annealing 57 o C 30 detik; ekstensi 72 o C 5 detik.
35 Untuk setiap run disertakan satu kontrol positif amplifikasi berupa RNA hasil isolasi dengan nilai C t 25 dan satu kontrol negatif. Hasil PCR dianalisis menggunakan Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System software. Hasil dinyatakan layak bila diperoleh nilai C t kontrol positif isolasi RNA 35, kontrol positif PCR 25, dan tidak satupun kontrol negatif memiliki nilai C t (undetected). Sampel positif MA ditetapkan pada C t 38 dan H5 36. Analisis Data Seluruh data yang didapatkan dari studi ini dianalisa secara deskriptif.