Lampiran 1. Diagram Alir Penelitian

Transkripsi

1 Lampiran 1. Diagram Alir Penelitian Kultur Isolat S. pneumoniae hasil seleksi pada Media BA 5% + Gentamisin Uji Mikrobiologis (Uji sensitivitas antibiotik) Ekstraksi DNA Duplex PCR Gen erm(b) Gen mef(a) & erm(b) Gen mef(a) Analisis Data

2 Lampiran 2. Spesifikasi Alat dan Bahan No. Nama Alat Merek/Tipe Kegunaan Tempat 1. Erlenmeyer Duran, 100 dan 500 ml Tempat pembuatan media 2. Cawan petri plastik LabServ Tempat media agar 3. ph meter Thermo Orion 2 Star ph Benchtop Mengukur ph 4. Heater dan pengaduk elektrik Barnstead Thermolyne Mengaduk suspensi media Cimarec 5. Timbangan digital Precisa Mengukur berat bahan pembuat media 6. Laminar Air Flow Cabinet Esco 7. Mikropipet Eppendorf; 0,5 µl µl 8. Tips Thermo ; 0,5 µl µl Tempat bekerja secara aseptis Meneteskan suatu larutan dengan akurasi tinggi Tempat meneteskan larutan pada mikropipet 9. Autoklaf Hirayama Tempat sterilisasi mekanik 10. Refrigerator Sanyo Tempat penyimpanan media 11. Biomedical Freezer Thermo Freezer Tempat -86 o C penyimpanan isolat 12. Biomedical Freezer -30 o C 13. Disposable cotton bud Sanyo Puritan cair Tempat penyimpanan sampel DNA Mengulas suspensi antibiotik dan bakteri pada media 14. Vortex mixer VM-300 K Menghomogenkan suatu suspensi 15. Alat sentrifugasi Thermo Heraeus Mengsentrifugasi Centrifuge suatu suspensi 16. Inkubator Forma Scientific Menginkubasi biakan murni mikoba Washing Facility 17. Sarung tangan nitril Hand Seal Melindungi tangan dari kontaminan 18. Tabung vial Eppendorf; 1,5 ml Menyimpan sampel DNA 19. Tabung cryotube NUNC; 1,8 ml Menyimpan media STGG/mikroba murni dalam bentuk cair 20. Multiblok heater Thermo Scientific Memanaskan sampel 25

3 21. Disposable ose NUNC Menginokulasi bakteri 22. Mesin thermal cycler/ PCR Applied BioSystems Spektrofotometer Nano Drop ND Apparatus elektroforesis Bio-Rad Mengamplifikasi sekuens DNA tertentu Mengukur kuantifikasi DNA Memisahkan molekul DNA berdasarkan ukurannya 25. Power Pac Basic Bio-Rad Sumber arus listrik untuk running elektroforesis 26. Gel-Doc 1000 Bio-Rad Visualisasi hasil elektroforesis gel 27. Jarum ose Menginokulasi isolat mikroba 28. Pembakar bunsen Menciptakan suasana aseptis 29. Tabung reaksi Duran Menyimpan suspensi cair 30. Water bath Barnstead Menjaga suhu media tetap hangat Ruang PCR Lab. Konversi Energi (Lab 1) Ruang PCR 31. Alumunium foil Klin-Pak Menutup erlenmeyer 32. Tissue Multi Membersihkan meja kerja 33. PCR Cabinet Scie-Plas Memasukkan sampel DNA yang akan diamplifikasi 34. Lilin Sumber panas 35. Jar (toples kaca) Menyimpan media berisi biakan kultur bakteri anaerob 36. Rak tabung reaksi Menyimpan tabung reaksi 37. Biological Safety Cabinet Nuaire Tempat bekerja secara aseptis 26

4 Lampiran 2. (lanjutan) No. Nama Bahan Spesifikasi Kegunaan 1. Isolat murni Streptococcus pneumoniae tidak peka terhadap Eritromisin 1,5 ml Isolat bakteri yang tidak peka terhadap Eritromisin 2. Darah domba 5% Sebagai media tumbuh S. pneumoniae 3. Gentamisin 50 mg/ml Untuk menghindari kontaminasi bakteri lain terutama Staphylococcus 4. ddh 2 O 500 ml Sebagai pelarut 5. Etanol 70% Desinfektan 6. Mueller-Hinton Broth 1 ml Larutan nutrisi bakteri untuk uji sensitivitas antibiotik 7. Mueller-Hinton Agar 500 g Media uji sensitivitas antibiotik 8. Gel agarosa 1% Media untuk elektroforesis gel 9. Go-Taq Green Master Mix 2x Buffer untuk reaksi PCR 10. McFarland Standard No. 0,5 Blangko untuk mengukur turbiditas suspensi pada uji sensitivitas antibiotik 11. Glukosa (Glucose anhydrous Molecular Biology Grade) g/mol Sumber karbohidrat pada media 12. Gliserol 87% Sumber lemak pada media 13. Tryptone Soya Broth 500 g Bahan untuk pembuatan media STGG 14. Tryptone Soya Agar 500 g Bahan untuk pembuatan media agar darah 15. Bubuk Skim-Milk Bahan untuk pembuatan media agar darah dan STGG 16. Forward and reverse 50 µm Primer untuk gen mef(a) primer mef(a) 17. Forward and reverse 50 µm Primer untuk gen erm(b) primer erm(b) 18. DNA ladder 100 bp DNA Marker pada PCR 19. DNA template S. 20 ng/µl DNA template yang pneumoniae digunakan untuk amplifikasi 20. TE Buffer 1x Buffer ekstraksi DNA 21. Eritromisin disk 15 µg Antibiotik jenis makrolida 22. TBE Buffer 1x Buffer elektroforesis gel 23. SYBR Safe 400 µl Pemberi warna yang menyisip pada fragmen basa pada proses elektroforesis gel 27

5 Lampiran 3. Komposisi Media Agar Darah Domba 5% + Gentamisin. Bahan Darah domba 50 ml Tryptone Soya-Agar 40 g Gentamisin 50 µl ddh 2 O 1000 ml Komposisi 28

6 Lampiran 4. Komposisi Media STGG Bahan Skim milk Tryptone Soya-Broth Glukosa Gliserol ddh 2 O 2 g 3 g 0,5 g 10 ml 100 ml Komposisi 29

7 Lampiran 5. Komposisi Media Agar Mueller-Hinton + Darah Domba 5% Bahan Mueller Hinton Agar Darah domba ddh 2 O 38 g 50 ml 1000 ml Komposisi 30

8 Lampiran 6. Komposisi Go Taq Green 2x datp dttp dgtp dctp MgCl2 Pewarna kuning Pewarna biru Taq Polymerase Buffer Bahan Konsentrasi / Kegunaan 400 μm 400 μm 400 μm 400 μm 3mM Pewarna dengan kecepatan migrasi lebih cepat dari fragmen DNA berukuran < 50 bp Pewarna dengan kecepatan migrasi yang sama dengan DNA berukuran 3-5 kb DNA Enzim yang mengkatalisis reaksi polimerisasi Meningkatkan densitas sampel (Promega, 2012) 31

9 Lampiran 7. PCR Mix dan Kondisi untuk Duplex PCR PCR Mix Volume (µl) Konsentrasi Akhir Go Taq Green Mastermix (2x) 12,5 1x erm(b) f-primer (50 µm) 0,5 1 µm erm(b) r-primer (50 µm) 0,5 1 µm mef(a) f-primer (50 µm) 0,5 1 µm mef(a) r-primer (50 µm) 0,5 1 µm DNA 2 20 ng/µl* ddh O 2 8,5 Total 25 µl 94 o C o C o C Ko dan Song (2004) 35 Siklus 32

10 Lampiran 8. PCR Mix dan Kondisi Singleplex PCR mef(a) PCR Mix Volume (µl) Konsentrasi Akhir Go Taq Green Mastermix (2x) 10 1x mef(a) f-primer (50 µm) 0,5 1 µm mef(a) r-primer (50 µm) 0,5 1 µm DNA 2 20 ng/µl* ddh O 2 12 Total 25 µl 93 o C o C o C o C 35 Siklus Sutcliffe et.al (1996), dengan sedikit modifikasi. 33

11 Lampiran 9. PCR Mix dan Kondisi untuk Singleplex PCR erm(b) PCR Mix Volume (µl) Konsentrasi Akhir Go Taq Green Mastermix (2x) 10 1x erm(b) f-primer (50 µm) 0,5 1 µm erm(b) r-primer (50 µm) 0,5 1 µm DNA 2 20 ng/µl* ddh O 2 12 Total 25 µl 94 o C o C o C 35 Siklus Ko dan Song (2004) 34