I. PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Nenas merupakan buah tropika ketiga setelah pisang dan mangga yang diperdagangkan secara global (Petty et al. 2002) dalam bentuk nenas segar dan produk olahan. Hampir seluruh bagian tanaman nenas dapat dimanfaatkan, limbah dari buah untuk pakan ternak dan produksi asam organik (seperti asam sitrat, asam askorbat, asam malat), serat daun untuk bahan tekstil, dan bromelin untuk industri makanan, kosmetik, obat-obatan (Wee dan Thongtham, 1997; Nakasone dan Paull, 1999). Pada tahun 2000 Indonesia adalah produsen nenas terbesar ke-9 namun peran Indonesia dalam mengisi ekspor buah nenas dunia masih rendah yaitu 0,003% untuk nenas segar dan 12,34% nenas kaleng (Poerwanto, 2003). Produksi nenas Indonesia pada tahun 2000 hanya 2% dari produksi dunia, padahal pada tahun 1995 produksi nenas Indonesia mencapai 6% dari produksi dunia (Anonim, 2001). Produksi nenas dapat ditingkatkan dengan beberapa cara diantaranya: membuka kebun-kebun baru, meremajakan kebunkebun yang tua, memperkenalkan kultivar baru dan menyediakan bibit unggul. Usaha tersebut harus didukung dengan teknik perbanyakan yang cepat dan bibit yang dihasilkan seragam, yaitu teknik perbanyakan in vitro. Teknik perbanyakan in vitro tanaman nenas perlu dikembangkan karena teknik perbanyakan tradisional dan modifikasinya tidak efisien. Teknik perbanyakan tradisional dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman seperti crown (mahkota buah ), slip, shoot (tunas samping) dan sucker (anakan) memerlukan waktu lama, jumlah bibit yang dihasilkan sedikit dan tidak seragam. Tanaman nenas kultivar Smooth Cayenne menghasilkan 2 propagul/tanaman per tahun sehingga perlu waktu 30 tahun untuk menghasilkan bahan tanaman yang cukup untuk satu hektar yang dimulai dari satu tanaman (Purseglove, 1972). Untuk meningkatkan jumlah bibit dapat dilakukan dengan memodifikasi teknik tradisional yaitu (1) metode pemotongan mata tunas pada ketiak daun dari crown, slip, dan sucker, (2) metode pemotongan memanjang dari slip dan sucker (teknik kuarter), dan (3) metode pemotongan batang (Selamat, 1996). Bibit yang dihasilkan dengan metode tersebut sebanyak 15-256 bibit/sucker/tahun (Selamat, 1996). Teknik perbanyakan in vitro diperlukan terutama untuk perusahaan besar
yang perlu bibit ratusan ribu bahkan jutaan bibit per tahun. Selain itu, perbanyakan in vitro untuk perbanyakan bahan tanaman yang terbatas jumlahnya (misal klon introduksi), klon unggul hasil seleksi atau hibrid hasil persilangan. Keberhasilan dalam perbanyakan secara in vitro ditentukan oleh banyak faktor, diantaranya kultivar tanaman, komposisi media, metode kultur, jenis dan konsentrasi zat pengatur tumbuh (ZPT) serta umur kultur. Klon nenas yang berbeda menghasilkan multiplikasi berbeda (DeWald et al. 1988). Metode regenerasi yang berbeda juga menghasilkan multiplikasi berbeda. Kiss et al. (1995) dengan metode etiolasi dapat menghasilkan 80 000 plantlet/tanaman per tahun, sedangkan Teng (1997) dengan metode kultur nodul dapat menghasilkan 80 000-100 000 plantlet/tanaman per tahun. Teknik perbanyakan in vitro pada beberapa jenis tanaman terbukti efisien, namun pada tanaman nenas belum digunakan secara komersial karena kemungkinan terjadi variasi somaklonal (Bartholomew dan Criley, 1988). Variasi yang muncul selama proses kultur in vitro disebut variasi somaklonal (Larkin dan Scowcorft, 1981). Penyebab munculnya variasi somaklonal ada dua yaitu variasi genetik yang memang sudah ada dalam eksplan dan variasi induksi atau variasi epigenetik yang muncul selama fase kultur in vitro. Variasi genetik bersifat stabil baik melalui perbanyakan seksual dan aseksual, sedangkan variasi epigenetik tidak stabil dan berpotensi dapat balik (reversible) (Evans et al. 1984; Kaeppler et al. 2000). Epigenetik adalah variasi dalam ekspresi gen yang secara potensial dapat balik tetapi sekuen DNA tidak mengalami perubahan (Kaeppler et al. 2000). Oono (1985 dalam Kaeppler et al. 2000) melaporkan, padi kerdil hasil perbanyakan in vitro tetap terbawa melalui perbanyakan generatif. Padi kerdil kembali menjadi tanaman normal setelah diperlakukan dengan 5-deoxyazacytidine yaitu senyawa anti metilasi DNA. Sifat kerdil yang muncul pada padi tersebut merupakan variasi epigenetik. Variasi somaklonal yang terjadi pada teknik perbanyakan in vitro nenas dan tanaman lainnya dipengaruhi oleh banyak faktor dan mekanisme penyebabnya masih menjadi perdebatan. Menurut Kaeppler et al (2000), penyebab terjadinya variasi somaklonal adalah perubahan kromosom (penggandaan kromosom, delesi, inverse, translokasi), perubahan sekuen DNA, metilasi dan aktifasi elemen 2
transposon. Besarnya variasi tergantung pada klon atau kultivar tanaman, macam dan konsentrasi zat pengatur tumbuh, kecepatan multiplikasi, umur kultur, sumber eksplan, penggunaan agen mutagenik dan tekanan seleksi (seperti kadar garam, herbisida, produk sampingan dari mikroorganisme), jumlah kromosom dan tipe regenerasi (Skirvin, 1978; Skirvin et al. 1994). Kultivar berbeda dalam satu spesies tanaman pisang menunjukkan tingkat variasi yang berbeda. Variasi pada kultur pisang rata-rata 3% tetapi pada kultivar Cavendish mencapai 20% (Hwang dan Ko, 1986). Penggunaan zat pengatur tumbuh (ZPT) konsentrasi tinggi, umur kultur dan frekuensi subkultur yang berlebihan dapat menginduksi variasi (Skirvin et al. 1994). Eksplan yang mempunyai mata tunas kemungkinan terjadinya variasi lebih kecil dibandingkan eksplan yang tidak mempunyai meristem calon tunas (Skirvin et al. 1994). Regenerasi melalui perbanyakan tunas aksilar dapat mengurangi munculnya variasi somaklonal dibandingkan regenerasi melalui tunas adventif dan embriogenesis (Karp, 1989). Variasi somaklonal yang masih bisa diterima adalah tidak lebih dari 3-5% (Cote et al. 1993). Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian untuk mendapatkan metode perbanyakan in vitro nenas yang efisien dengan variasi somakonal yang rendah melalui pengaturan ZPT, regenerasi langsung dan frekuensi subkultur. Variasi somaklonal perlu dievaluasi sedini mungkin. Evaluasi bisa dilakukan pada plantlet dalam botol, saat aklimatisasi di rumah kaca atau di lapangan pada fase vegetatif dan generatif. Dalam melakukan evaluasi variasi somaklonal perlu digunakan kombinasi beberapa penanda misalnya karakter morfologi, biokimia (isozim), sitologi, dan molekuler. Masing-masing penanda mempunyai kelemahan dan kelebihan sehingga dengan mengkombinasikan beberapa penanda dapat diperoleh hasil evaluasi yang dapat dipercaya. Identifikasi dengan menggunakan karakter morfologi mudah dilakukan dan biayanya murah, namun sering dipengaruhi oleh lingkungan dan tahap perkembangan tanaman. Jika pengaruh lingkungan sangat besar terhadap induksi keragaman maka penilaian keragaman berdasarkan data karakter morfologi tidak mencerminkan tingkat keragaman genetik yang sebenarnya (Yee et al. 1999). Isozim yang merupakan produk langsung dari gen individu (Newbury dan 3
Ford-lloyd, 1993), tidak dipengaruhi lingkungan dan mampu membedakan antar tanaman yang secara morfologi dan sitologi tidak dapat dibedakan. Penanda RAPD adalah hasil amplifikasi sebagian DNA dari genom dengan menggunakan satu buah primer oligonukleotida yang terdiri atas 10 nukleotida (William et al. 1990). Analisis isozim mempunyai beberapa kelemahan dibandingkan penanda RAPD yaitu jumlah isozim yang bisa dianalisis terbatas, polimorfik yang dihasilkan lebih rendah dan perubahan sekuen DNA atau nukleotida yang tidak merubah sekuen asam amino polipeptida tidak dapat dideteksi dengan isozim (Roose, 1988). RAPD mempunyai beberapa kelebihan diantaranya perbedaan primer pada satu nukleotida tunggal akan menghasilkan profil yang berbeda. Jadi teknik ini dapat mendeteksi perubahan basa tunggal dalam DNA genom jika cukup banyak primer yang digunakan (Deng et al. 1995). 1.2. Perumusan Masalah Teknik perbanyakan tanaman nenas secara alami dan modifikasinya tidak efisien, oleh karena itu perlu dilakukan teknik perbanyakan in vitro. Teknik in vitro yang efisien harus mampu menghasilkan kecepatan multiplikasi yang tinggi sehingga dapat dihasilkan bibit dalam jumlah banyak dan cepat. Multiplikasi tinggi dapat dicapai dengan menggunakan ZPT sitokinin dan auksin konsentrasi tinggi, subkultur berulang dan regenerasi langsung atau tidak langsung. Namun kecepatan multiplikasi yang tinggi dapat menginduksi munculnya variasi somaklonal (Gambar 1). Penyebab terjadinya variasi somaklonal adalah perubahan kromosom (penggandaan kromosom, delesi, inversi, translokasi), perubahan sekuen DNA, metilasi dan aktifasi elemen transposon (Kaeppler et al 2000). Stabilitas klonal adalah faktor yang sangat penting dalam perbanyakan mikro secara komersial. Pada beberapa kasus variasi somaklonal yang terdeteksi saat in vitro, ketika di lapangan menjadi normal (berdasarkan karakter morfologi). Evaluasi variasi somaklonal hasil perbanyakan in vitro tanaman nenas telah dilakukan pada plantlet dalam botol dan aklimatisasi di lapangan umur 6 minggu (Mhatre et al. 2002; Smith et al. 2002) tetapi evaluasi variasi somaklonal pada fase generatif dan karakter buah belum ada laporannya. Oleh karena itu perlu 4
5
dilakukan evaluasi variasi somaklonal tanaman nenas hasil kultur in vitro sampai fase generatif dan kualitas buah dengan menggunakan kombinasi beberapa penanda (morfologi, isozim dan RAPD) agar diperoleh hasil yang dapat dipercaya (Gambar 1). Perlu dicari metode perbanyakan yang dapat meningkatkan kecepatan multiplikasi setinggi mungkin dengan resiko munculnya variasi somaklonal serendah mungkin. Untuk itu dalam penelitian ini dilakukan studi perbanyakan in vitro tanaman nenas melalui pendekatan penggunaan ZPT (BAP, TDZ, IAA, NAA, GA 3 ), metode regenerasi (organogenesis, teknik etiolasi) dan frekuensi sub kultur pada dua kultivar nenas (kultivar Queen dan Smooth Cayenne). Pada awalnya, penelitian dirancang untuk membandingkan respon kultivar Queen dan Smooth Cayenne terhadap BAP dan TDZ dengan pendekatan konsentrasi yang sama dan teknik regenerasi yang sama melalui organogenesis. Namun dalam pelaksanaannya, kultivar Queen dan Smooth Cayenne menunjukkan respon yang sangat berbeda dalam media media induksi (MS0) sehingga dilakukan penelitian yang terpisah untuk kedua kultivar (Gambar 2). BAP dan TDZ pada kultivar Queen menunjukkan efek yang sangat berbeda sehingga memerlukan pendekatan metode perbanyakan yang berbeda, oleh karena itu dilakukan penelitian 1 dan 2 yang saling terpisah. Perbanyakan in vitro nenas kultivar Smooth Cayenne kurang efisien melalui organogenesis langsung menggunakan TDZ dan BAP sehingga dilakukan percobaan dengan teknik etiolasi (Gambar 2) Permasalahan di atas dipelajari dengan melakukan 3 penelitian yang terpisah yaitu: 1 Pengaruh TDZ, IAA dan NAA terhadap multiplikasi dan keseragaman keragaan tanaman nenas kultivar Queen di lapangan 2 Pengaruh BAP dan frekuensi subkultur terhadap multiplikasi, kualitas buah dan kestabilan genetik tanaman nenas kultivar Queen. 3 Pengaruh TDZ dan BAP serta teknik etiolasi dalam perbanyakan in vitro tanaman nenas kultivar Smooth Cayenne. 6
7
1.3. Tujuan Penelitian Tujuan umum penelitian adalah mendapatkan sistem perbanyakan in vitro tanaman nenas melalui organogenesis dengan variasi somaklonal sekecil mungkin. Tujuan spesifik adalah: 1 Mempelajari dan menganalisis pengaruh TDZ, IAA dan NAA terhadap multiplikasi, pengakaran dan keseragaman keragaan tanaman nenas kultivar Queen di lapangan 2 Mempelajari dan menganalisis pengaruh BAP terhadap multiplikasi, pengakaran, dan kualitas buah serta kestabilan genetik tanaman nenas kultivar Queen. 3 Mempelajari dan menganalisis pengaruh BAP dan TDZ serta teknik etiolasi terhadap multiplikasi dan pengakaran tanaman nenas kultivar Smooth Cayenne. 1.4. Manfaat penelitian 1 Mendapatkan konsentrasi optimum dari TDZ dan BAP untuk menginduksi multiplikasi tunas yang tinggi dengan variasi somaklonal yang rendah, sehingga diperoleh tanaman regeneran dalam jumlah banyak, seragam, dan stabil. 2 Mendapatkan metode standar dalam perbanyakan in vitro tanaman nenas kultivar Queen dan Smooth Cayenne sehingga dapat membantu perusahaan nenas dalam penyediaan bibit bermutu. 3 Mendapatkan metode untuk mendeteksi variasi somaklonal pada waktu sedini mungkin terhadap tanaman nenas hasil perbanyakan in vitro 8