II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Tanaman Nenas

Transkripsi

1 II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Tanaman Nenas Nenas merupakan anggota famili Bromeliaceae atau bromeliad. Famili ini terdiri atas 45 genus dan 2000 spesies (Nakasone dan Paull, 1999) yang semuanya berasal dari Amerika Selatan kecuali satu spesies Pitcairnia felicana berasal dari Afrika Barat (Collins, 1968). Tanaman nenas ditemukan oleh Columbus tahun 1493 (Petty et al. 2001), diduga masuk ke Indonesia pada abad ke-16 dibawa oleh orang Spanyol (Collins, 1968) dan masuk ke pulau Jawa tahun 1599 (Purseglove, 1972). Ananas comosus L. Merr. adalah nenas budidaya yang merupakan tanaman herba tahunan (perenial), sukulen, dan serofit, steril bila menyerbuk sendiri, monokotil, epifit atau terestrial (Purseglove, 1972; Wee dan Thongtham, 1997; Paull, 1997; Nakasone dan Paull, 1999; Petty et al. 2001). Tanaman nenas mempunyai tinggi cm, tinggi batang tanaman dewasa cm, diameter 6,5-7,5 cm dengan ruas pendek 1-10 mm (Nakasone dan Paull, 1999). Akar tanaman nenas ada 3 macam yaitu akar tanah, akar aksilar dan akar adventif (Collins, 1968). Akar tanah adalah akar yang berada di bawah permukaan tanah, akar aksilar adalah akar pada pangkal batang dan berada di atas permukaan tanah, sedangkan akar adventif adalah akar yang muncul di aksilar daun batang. Akar aksilar dan akar adventif berfungsi untuk menyerap air dan nutrisi. Akar baru terus terbentuk dan menyebar dan terhenti saat terjadi inisiasi pembungaan. Daun nenas berbentuk pedang dengan panjang 1 m atau lebih, lebar 5-8 cm, pinggiran berduri atau hampir rata, berujung lancip. Daun menempel secara spiral pada batang dengan jarak yang rapat sehingga membentuk roset. Daun nenas mengandung serat 2-3% yang dapat digunakan untuk tekstil (Purseglove, 1972). Secara alami inisiasi inflorescence dipercepat dengan adanya suhu rendah pada malam hari dan pengurangan jam penyinaran, namun inisiasi dapat diinduksi secara buatan dengan menggunakan gas etilen (Paull, 1997; Wee dan Thongtham, 1997). Fase generatif terbagi dalam 5 tahap yaitu (1) awal induksi, yaitu inflorescence tersembunyi membentuk roset daun, (2) red heart yaitu tahap antara munculnya inflorescence, (3) antesis, (4) tahap pertumbuhan buah, dan (5) tahap

2 pematangan buah (Coppens d Eeckenbrugge et al. 2001). Inflorescence kompak mengandung bunga hermaprodit. Antesis terjadi 2-4 minggu, dan setiap bunga mekar selama 1-2 hari (Ploetz et al. 1996). Buah nenas merupakan buah multiple partenokarpi atau sinkarp yang terbentuk dari penebalan poros bunga dan peleburan masing-masing bunga (Purseglove, 1972; Wee dan Thongtham, 1997). Perkembangan fruitlet telah lengkap bersamaan dengan munculnya mahkota buah, selanjutnya buah dan mahkota terus berkembang sampai buah matang. Buah matang sekitar 4 bulan sejak munculnya mahkota atau 6-7 bulan dari inisiasi bunga (Nakasone dan Paull, 1999). Bakal biji dan serbuk sari berfungsi normal tetapi tidak kompatibel menyerbuk sendiri (self incompatible) sehingga tidak menghasilkan biji atau biji yang terbentuk tidak normal (Nakasone dan Paull, 1999). Self incompatible ini disebabkan oleh terhambatnya pertumbuhan tabung serbuk sari pada 1/3 bagian atas dari tangkai putik (Brewbaker dan Gorrez, 1967 dalam Nakasone dan Paull, 1999). Kandungan nutrisi buah dipengaruhi oleh lingkungan. Nenas yang ditanam di dataran rendah ukurannya lebih besar, lebih manis dan lebih berair (Wee dan Thongtham, 1997). Rasio gula:asam sangat bervariasi tergantung pada kultivar, kondisi pertumbuhan tanaman dan umur panen (Nakasone dan Paull, 1999). Wee dan Thongtham (1997) menyatakan rasio gula:asam = 16:1 adalah ideal untuk proses pengalengan Kultivar Nenas Kultivar yang dibudidayakan mungkin merupakan tanaman diploid, triploid atau tetraploid dengan 2n = 50, 75 atau 100 kromosom. Tanaman nenas diploid dan tetraploid merupakan tanaman fertil tetapi self incompatible, sedangkan nenas triploid adalah steril (IBPGR, 1986). Kultivar komersial Cabezona adalah tanaman triploid alami dengan 75 kromosom (Collins, 1933 dalam Collins, 1968). Persilangan antara 2 kultivar diploid dapat menghasilkan beberapa tanaman triploid, tetraploid dengan persentase sangat kecil dibandingkan tanaman diploid. Tanaman triploid berasal dari sel telur yang tidak tereduksi (gamet diploid) dibuahi sel serbuk sari haploid. Tanaman tetraploid berasal dari pembuahan antara 2 gamet diploid. Tanaman diploid dan tetraploid dapat 10

3 menghasilkan 90% serbuk sari fertil sedangkan tanaman triploid menghasilkan 90-95% serbuk sari steril (Collins, 1968). Kultivar-kultivar nenas berbeda dalam ukuran tanaman dan buah, warna dan rasa daging buah, pinggiran daun berduri atau rata. Kultivar tersebar pada berbagai negara sehingga sering mempunyai nama berbeda-beda (Coppens d Eeckenbrugge et al. 2001). Tanaman nenas dikelompokkan dalam 5 kelompok fenotipe berdasarkan karakter buah dan daun (Tabel 1). Pengelompokan berdasarkan karakter fenotipe tidak persis sama dengan pengelompokan berdasarkan variasi isozim (Aradhaya et al. 1994). Tabel 1 Karakter fenotipe 5 kultivar nenas (Leal dan Soule, 1977 dalam Nakasone dan Paull, 1999). Karater Spanish Queen Abacaxi Cayenne Maipure Daun berduri berduri berduri tidak berduri tidak berduri Buah Bobot (kg) Bentuk Warna daging Warna kulit Struktur mata Core Rasa 0,9-1,8 Globose Kuning muda putih Orange-merah Besar & dalam Besar Asam, berserat 0,5-1,1 Conical Kuning tua Kuning Dalam Kecil Lebih manis, agak asam, serat rendah 1,4 Conical Kuning muda putih Kuning - Kecil Manis Cenderung berair 2,3 Silinder Kuning muda kuning Orange Dangkal Sedang Manis, cukup asam, serat rendah, berair 0,8-25 Silinder Putih kuning tua Kuning orange merah - Kecil-sedang Lebih manis dari Cayenne, berserat, sangat berair Pengalengan Cukup cukup Cukup Sangat baik Cukup Masalah Resisten thd layu Lebih resisten Resisten Peka layu Tidak diketahui penyakit dari Cayenne Klon Red Spanish Singapore Spanish Green Selangor Castilla PR-67 Cabezona Queen MacGregor Natal Ripley Alexandria Abacaxi Abakka Sugar Loaf Papelon Venezolara Amarelle Smooth Cayenne Cayenne Lisse Guatemalan Typhone St Michael Esmeralda Maipure Perolera Lebrija Monte Lirio Abacaxi Rondon Penjelasan singkat dari lima kelompok fenotipe nenas sebagai berikut: (1) Kultivar Cayenne banyak ditanam untuk produksi komersial selama hampir 150 tahun. Kultivar Smooth Cayenne awalnya satu genotipe tunggal karena diperbanyak secara aseksual dan terjadi mutasi somatik maka muncul sejumlah klon-klon yang berbeda dalam kultivar tersebut (Broertjes dan Van Harten, 1988). Menurut Collins dan Kerns (1938) dalam Broertjes dan Van Harten (1988) ada 30 tipe mutan dari kultivar Cayenne. Kultivar Cayenne menghasilkan sedikit sucker (0-3) dan sensitif terhadap hama dan penyakit (Coppens d Eeckenbrugge 11

4 et al. 2001). (2) Kultivar Queen lebih banyak diperdagangkan sebagai buah segar, mempunyai ukuran tanaman dan buah lebih kecil dan daun lebih pendek dibandingkan dengan kultivar Cayenne. Daun kultivar Queen berduri, rasa dan aroma buah lebih disukai. Kultivar Queen menghasilkan 3-12 sucker (Apriyani, 2005) (3). Kultivar Spanish berukuran kecil sampai sedang, daun berduri, sering terjadi multiple mahkota dan menghasilkan banyak sucker. Buah tidak cocok untuk produk kalengan karena mata terlalu dalam dan warna daging buah pucat. (4). Kultivar Abacaxi banyak ditanam di Amerika Latin dan daerah Karibia. Kultivar ini disebut juga Pernambuco (Petty et al. 2002). Buah tidak cocok untuk produk kalengan atau buah segar, banyak dipasarkan dalam bentuk juice dengan rasa yang sesuai untuk konsumen Amerika Latin dan Karibia. (5). Kultivar Maipure banyak dibudidayakan di Amerika Tengah dan Selatan sebagai buah segar untuk pasar lokal. Nama lain dari kultivar ini adalah Perolera (Petty et al. 2002), sering menghasilkan mahkota buah berukuran kecil pada bagian dasar mahkota dan menghasilkan banyak slip sampai 6. Mutan Perolera menghasilkan buah berwarna merah (Coppens d Eeckenbrugge et al. 2001) Perbanyakan Nenas Tanaman nenas umumnya diperbanyak secara vegetatif dengan menggunakan tunas vegetatif dari berbagai bagian batang tanaman dan mahkota buah. Berbagai bahan perbanyakan menurut Collins (1968) dan Rangan (1984), (Gambar 3) antara lain: 1. Crown (mahkota buah) adalah bagian tanaman yang ada di atas buah 2. Slip (tunas tangkai buah) adalah tunas yang muncul di bawah dasar buah 3. Hapas adalah tunas yang muncul pada daerah antara ujung batang dan dasar buah tangkai buah 4. Shoot (tunas ketiak daun atau tunas samping) adalah tunas yang muncul dari aksilar daun 5. Sucker (anakan) adalah tunas yang muncul dari bagian batang di bawah permukaan tanah. Wee dan Thongtham (1997) membagi bahan tanam nenas menjadi tiga yaitu mahkota buah, tunas batang (slip, hapas, shoot) dan tunas ketiak daun (sucker). 12

5 Dari ketiga bagian tersebut yang paling sering digunakan sebagai bahan perbanyakan adalah tunas batang sedangkan mahkota jarang digunakan karena ukurannya tidak seragam. Gambar Bagian vegetatif tanaman nenas yang dipergunakan sebagai bahan perbanyakan tanaman 1. Crown, 2. Slip, 3. Shoot, 4. Sucker Jumlah anakan dan tunas samping berkorelasi negatif dengan kepadatan populasi tanaman (Petty et al. 2002), selain itu juga tergantung pada kultivar nenas. Kultivar Smooth Cayenne menghasilkan tunas batang sedikit yaitu kurang dari tiga sehingga untuk perbanyakan lebih sering digunakan tunas ketiak daun (Nakasone dan Paull, 1999). Kultivar Queen banyak menghasilkan anakan dan tunas samping (8-12) (Sari, 2002). Shoot diambil dari tanaman induk 1 bulan setelah panen, slip diambil 2-3 bulan setelah panen, sedangkan mahkota diambil bersamaan dengan saat panen. Tunas samping terus berkembang sampai buah dipanen sehingga ukurannya lebih besar dibanding slip (Nakasone dan Paull, 1999). Perbanyakan bibit dengan mengandalkan produksi dari tanaman secara alami hasilnya sedikit dan memerlukan waktu yang lama serta ukurannya bervariasi. Oleh karena itu, perlu dicari teknik perbanyakan yang dapat meningkatkan kecepatan dan jumlah bibit yang dihasilkan. Beberapa teknik perbanyakan telah dilakukan diantaranya: (1) menyemprotkan bahan kimia (seperti morphactin, klorflurenol, flurenol, diklorflurenol) ke tanaman untuk menginduksi pembentukan plantlet (Nickell, 1988), (2) memodifikasi metode perbanyakan tradisional yaitu metode pemotongan mata tunas, metode pemotongan memanjang dan metode pemotongan batang (Purseglove, 1972; 13

6 Selamat, 1996) dan (3) perbanyakan in vitro (Wakasa, 1979; Zepeda dan Sagawa, 1981; Kiss et al. 1995; Teng, 1997; Prahardini et al. 1995; Imelda dan Erlyandari, 2000) Perbanyakan In Vitro Teknik perbanyakan in vitro adalah cara perbanyakan dengan menggunakan media buatan di bawah kondisi aseptik (Rice et al. 1992). Teknik perbanyakan in vitro disebut juga perbanyakan mikro atau kultur jaringan tanaman. Menurut Ahloowalia et al. (2004) kultur jaringan tanaman adalah menumbuhkan dan memperbanyak sel, jaringan dan organ dalam media padat atau cair di bawah kondisi aseptik dan terkendali. Teknik perbanyakan in vitro mempunyai beberapa kelebihan dibandingkan perbanyakan konvensional yaitu: (1) membutuhkan bahan tanam atau eksplan sedikit, (2) menghasilkan tanaman bebas patogen dalam waktu cepat dan ruangan relatif sempit, (3) menghasilkan tanaman secara klonal tanpa dipengaruhi musim atau lingkungan dan (4) kecepatan produksi dapat diatur sesuai permintaan pasar (Fiorino dan Loreti, 1987). Teknik perbanyakan in vitro umumnya dilakukan melalui lima tahapan (Werbrouck dan Debergh, 1994): Tahap 0 : Persiapan dan perlakuan tanaman (sumber eksplan) Tahap 1 : Inisiasi eskplan Tahap 2 : Multiplikasi tunas Tahap 3 : Pemanjangan, induksi akar dan perkembangan akar Tahap 4 : Aklimatisasi dan penanaman di lapangan Tahap 0 dilakukan untuk mendapatkan bahan tanam (eksplan) yang sehat dan kondisi fisiologisnya bagus. Pada tahap ini, tanaman sebagai sumber eksplan perlu dirawat dengan baik dan kadang-kadang perlu perlakuan khusus seperti pemangkasan, penyemprotan zat pengatur tumbuh sehingga kondisi fisiologinya lebih baik. Pada tahap inisiasi, kegiatan yang dilakukan adalah memilih bagian tanaman yang akan dijadikan eksplan, mencari prosedur sterilisasi yang efektif namun tidak mematikan eksplan, dan memilih komposisi media yang tepat. Tahap multiplikasi merupakan tahap yang penting dalam perbanyakan in vitro. Multiplikasi dilakukan dengan menambahkan zat pengatur tumbuh auksin dan 14

7 sitokinin dalam media dan atau mensubkultur plantlet pada media yang sama atau media yang berbeda. Pada beberapa kasus, penggunaan sitokinin cukup optimal untuk multiplikasi tunas (Werbrouck dan Debergh, 1994). Tahap pengakaran kadang-kadang bisa dilewati karena pada akhir tahap multiplikasi beberapa plantlet dapat menghasilkan akar sehingga bisa segera diaklimatisasi. Apabila sitokinin yang digunakan pada tahap 2 relatif tinggi, kadang-kadang tunas yang dihasilkan pendek dan sulit berakar. Agar dihasilkan tunas yang panjang dan berakar, plantlet ditransfer ke media yang berbeda. Pada tahap aklimatisasi yang perlu diperhatikan adalah pemilihan media dan kondisi lingkungan rumah kaca. Pada dasarnya ada 3 macam teknik perbanyakan mikro yaitu: (1) perbanyakan meristem adventif (organogenesis), (2) embriogenesis somatik dan (3) perbanyakan tunas aksilar (tunas yang sudah ada di meristem) (Fiorino dan Loreti, 1987; Rice et al. 1992). Pada permulaan kultur, metode perbanyakan tunas aksilar kurang efisien dibanding organogenesis atau embriogenesis, namun setelah beberapa kali subkultur maka kecepatan multiplikasi dari tunas aksilar akan meningkat pesat (Fiorino dan Loreti, 1987). Metode lain yang merupakan modifikasi dari perbanyakan meristem adventif adalah teknik kultur kalus nodular. Nodular adalah kumpulan sel yang menunjukkan pola diferensiasi jaringan dan sel internal yang konsisten (Teng, 1997). Nodular umumnya mempunyai kapasitas yang tinggi untuk regenerasi menjadi tanaman atau organ melalui organogenesis. Nodular juga dapat berproliferasi membentuk kalus nodular yang lebih banyak, dapat dipertahankan dalam waktu yang lama dan proses regenerasi dapat disinkronisasi sesuai kebutuhan. Nodular dapat diinduksi dari kalus atau secara langsung dari eksplan. Nodular nenas mempunyai karakter yang sama dengan kalus yaitu dapat berproliferasi membentuk nodular baru dan regenerasi menjadi tunas. Nodular baru terbentuk dari bagian nodular yang tua dan 70% dari nodular yang baru dapat membentuk tunas. Kultur nodular mempunyai potensi untuk menghasilkan plantlet yang tinggi. Kalus nodular seberat 0,4 g dapat menghasilkan lebih dari 50 tanaman dalam waktu 1 bulan sehingga dalam setahun diperkirakan dapat dihasilkan 8-10 x 10 4 plantlet dari nodular yang diinduksi dari satu tanaman. Sementara itu Kiss et al. (1995) dengan teknik etiolasi yaitu menggunakan 15

8 potongan buku yang mengalami etiolasi didapatkan plantlet/eksplan buku dan diperkirakan dalam setahun dihasilkan 8 x 10 4 plantlet dari satu tanaman. Perbanyakan nenas Bogor pada media MS + 1 mg/l BAP menghasilkan 9 tunas pada umur 2 bulan dan bila konsentrasi BAP ditingkatkan menjadi 2 mg/l jumlah tunas menjadi 2 (Imelda dan Erlyandari, 2000). Prahardini et al. (1995) dengan menambahkan IAA, BA dan GA 3 pada media MS mendapatkan 9 tunas in vitro nenas Queen klon Blitar pada umur 5 bulan Zat Pengatur Tumbuh Manipulasi sel, jaringan dan organ tanaman dalam kultur in vitro untuk tujuan perbanyakan dan modifikasi tanaman sangat bergantung pada penggunaan zat pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh sitokinin sering digunakan dalam perbanyakan in vitro untuk mendapatkan multiplikasi yang tinggi. Aktifitas berbagai hormon tanaman bergantung pada interaksinya dengan hormon tanaman lainnya. Sitokinin bersinergis dengan auksin dalam menstimulasi pembelahan sel secara kontinue dalam kultur jaringan pith tembakau, tetapi bersifat antagonis dengan auksin dalam mengontrol inisiasi tunas dan akar dalam kultur jaringan dan dalam proses dominansi apikal (Binns, 1994). Berdasarkan struktur kimia ada 2 kelompok sitokinin yaitu turunan adenin (BAP, kinetin, zeatin) dan turunan fenilurea (TDZ). TDZ dan BAP mempunyai respon fisiologi yang sama yaitu berperan dalam regulasi pembelahan sel, diferensiasi dan pertumbuhan jaringan dan organ serta biosintesis klorofil (Murthy et al. 1996). Efektifitas antara BAP dan TDZ dalam menginduksi multiplikasi tunas berbeda-beda bergantung pada jenis tanamannya. Pada tanaman anggrek Phalaenopsis konsentrasi optimal untuk menginduksi tunas adventif adalah 5-10 µm TDZ dan bila menggunakan BAP 40 µm (Chen dan Piluek, 1995). Pada tanaman ubi kayu perlakuan 10 mg/l BAP menghasilkan jumlah tunas per eksplan lebih banyak dibandingkan perlakuan 10 mg/l TDZ tetapi persentase eksplan membentuk tunas pada perlakuan TDZ lebih tinggi dibandingkan perlakuan BAP (Konan et al. 1997) Pengaruh penggunaan TDZ dalam perbanyakan in vitro diantaranya adalah meningkatkan biosintesis atau akumulasi sitokinin dan auksin endogen, 16

9 menginduksi embrio somatik tanpa dikombinasi dengan zat pengatur tumbuh lainnya (Murthy et al. 1995), merangsang proliferasi tunas dan regenerasi organ adventif tanaman berkayu (Huetteman dan Preece, 1993), meningkatkan kecepatan proliferasi protocorm-like body (PLB), menginduksi pembentukan PLB (Ernst, 1994). Selain itu TDZ dapat menginduksi absisi daun kapas melalui peningkatan etilen endogen (Suttle, 1985). Penggunaan sitokinin dengan konsentrasi tinggi akan berpengaruh negatif yaitu menghambat perpanjangan tunas dan inisiasi akar Cymbidium sinense Willd (Chang dan Chang, 2000), menghasilkan tunas hiperhidrik pada tanaman ubi kayu (Konan et al. 1997), menyebabkan vitrifikasi yaitu suatu kondisi fisiologi in vitro yang menyebabkan disorganisasi seluler (Ziv, 1991). Pengaruh negatif lainnya adalah menyebabkan munculnya kalus pada bagian dasar eksplan (Lakshmanan et al. 1997), pembengkakan akar dan pertumbuhan akar terhenti (Fratini dan Ruiz, 2002, produksi etilen meningkat (Kevers dan Gasper, 1985) Kestabilan Genetik dalam Perbanyakan In Vitro Stabilitas klonal merupakan faktor yang sangat penting dalam perbanyakan mikro secara komersial (George dan Sherrington, 1984). Stabilitas genetik eksplan dalam kultur in vitro tergantung pada derajat struktur, organisasi dan pengaruh lingkungan aseptik yang menyertai ekspresi potensi variabilitas (Rice et al. 1992). Stabilitas genetik eksplan seringkali tidak dapat dipertahankan selama atau setelah melalui proses in vitro sehingga muncul variasi yang disebut variasi somaklonal. Penyebab munculnya variasi somaklonal ada dua kemungkinan yaitu variasi genetik (genetic variation) yang memang sudah ada dalam eksplan dan variasi induksi (induce variation) atau variasi epigenetik yang muncul selama fase kultur jaringan. Variasi genetik bersifat stabil baik melalui perbanyakan seksual dan aseksual, sedangkan variasi epigenetik tidak stabil walaupun melalui perbanyakan aseksual (Evans et al. 1984). Variasi genetik yang ada dalam eksplan (pre-existing variation) dapat berasal dari eksplan multiseluler dan tanaman kimera. Eksplan biji atau kecambah terdiri atas beberapa tipe sel dapat mengalami ketidakstabilan genetik secara spontan selama kondisi in vitro. Variasi 17

10 induksi dapat disebabkan oleh zat pengatur tumbuh, tipe regenerasi, kultivar atau klon tanaman, jumlah kromosom (level ploidi), sumber eksplan, umur kultur dan frekuensi subkultur, kecepatan proliferasi, agen mutagenik serta lingkungan kultur (kondisi kultur) ( Cote et al. 1993; Skirvin et al. 1994). Variasi somaklonal dapat terjadi pada gen tunggal atau multi gen yang disebabkan adanya perubahan basabasa DNA, gen, kromosom atau genom (Orton, 1984)). Eksplan yang berasal dari bagian tanaman yang mempunyai mata tunas seperti mata tunas aksilar, apeks dan meristem, kemungkinan terjadinya variasi lebih kecil dibandingkan eksplan yang tidak mempunyai meristem calon tunas seperti daun, akar, dan protoplas (Skirvin et al. 1994). Variasi yang muncul pada meristem tunas atau mata tunas aksilar dapat ditekan karena derajat stabilitasnya tinggi dan lebih plastis (Rice et al. 1992). Penggunaan sitokinin dan zat pengatur tumbuh lainnya dalam konsentrasi tinggi meningkatkan frekuensi tanaman regeneran tumbuh abnormal. Pada strawberi penggunaan adenin sulfat tanpa sitokinin dapat meningkatkan kemantapan dan mengurangi munculnya off-type. Off-type mungkin disebabkan oleh kecepatan multiplikasi yang tinggi pada media yang mengandung BAP (Rice et al. 1992). Brand dan Kiyomoto (1997) menyarankan dalam kultur jaringan Rhododendron sebaiknya digunakan sitokinin konsentrasi rendah agar diperoleh tunas yang vigor dan variasi minimum. Tipe regenerasi melalui perbanyakan tunas aksilar dapat mengurangi kemungkinan munculnya variasi somaklonal dibandingkan tipe regenerasi melalui tunas adventif dan embriogenesis (Karp, 1989). Variasi yang muncul dari mata tunas aksilar mungkin disebabkan oleh variasi yang sudah ada (pre-existing) atau induksi selama pembentukan kalus. Pada setiap tahap dalam perbanyakan in vitro sebaiknya dihindari kemungkinan terbentuknya kalus karena kalus sering berasosiasi dengan variasi somaklonal, dan hubungan antara keduanya sangat kuat. Munculnya kalus akan merangsang munculnya enzim penginduksi stress dan produk sampingan khusus (McClintock,1984 dalam Skirvin et al. 1994) Beberapa kultivar dalam satu spesies tanaman menunjukkan tingkat variasi yang berbeda. Terdapat kultivar yang menunjukkan variasi yang berlebihan, sedangkan yang lainnya stabil. Hwang dan Ko (1986) menyatakan variasi pada 18

11 kultur pisang rata-rata 3% tetapi pada kultivar Cavendish mencapai 20%. Variasi yang muncul pada kultur in vitro pisang berupa ukuran tanaman, kelainan bentuk, ukuran dan tebal daun. Kelainan yang paling sering muncul pada pisang Cavendish adalah kekerdilan bisa mencapai 70% disusul bentuk dan ukuran buah (Marie, 1992 dalam Cote et al. 1993). Kelainan yang masih dapat ditoleransi pada tanaman pisang 3-5% (Cote et al. 1993), sedangkan pada nenas 5% (Smith dan Drew, 1990). Subkultur dilakukan untuk meningkatkan kecepatan multiplikasi, sedangkan umur kultur adalah berapa lama suatu plantlet berada dalam in vitro. Umur kultur dan frekuensi subkultur yang berlebihan dapat menginduksi variasi (Skirvin et al. 1994). Fiorino dan Loreti (1987) menyatakan jumlah mata tunas baru yang terbentuk dari 1 eksplan meningkat sampai subkultur ketiga atau keempat kemudian stabil. Secara teori subkultur dapat dilakukan terus menerus tetapi dengan bertambahnya umur kultur maka subkultur menjadi kurang responsif dan muncul ketidakstabilan genetik. Oleh karena itu untuk mempertahankan tanaman true to type jumlah subkultur harus dibatasi. Pada pisang subkultur maksimal 10 kali (Cote et al. 1993). Mekanisme molekuler penyebab perubahan fenotipe adalah patahnya kromosom, perubahan basa tunggal, perubahan jumlah sekuen berulang dan perubahan dalam pola metilasi DNA (Scowcroft dan Larkin, 1988). Amplifikasi sekuen DNA berulang lebih tinggi dalam kultur sel Nicotiana glauca (Durante et al. 1983), meningkatnya metilasi DNA dan menurunnya kandungan DNA pada tanaman regeneran Pisum sativum L. (Cecchini et al. 1991). Perubahan kromosom yang umum dijumpai pada variasi somaklonal adalah poliploidi, aneuploid dan putusnya daerah heterokromatin (Al Zahim et al. 1999) Deteksi Variasi Somaklonal Untuk mengevaluasi variasi somaklonal dengan baik diperlukan beberapa pendekatan yaitu melalui pengamatan karakter morfologi, sitologi dan molekuler, karena penggunaan marker molekuler saja tidak efisien. Penilaian keragaman genetik suatu spesies tanaman secara konvensional berdasarkan perbedaan karakter morfologi dan agronomi. Ekspresi suatu karakter sering sangat 19

12 dipengaruhi faktor lingkungan. Jika pengaruh lingkungan sangat besar terhadap induksi keragaman dibandingkan keragaman genetik maka penilaian keragaman berdasarkan data morfologi tidak mencerminkan tingkat keragaman genetik diantara aksesi (Yee et al. 1999). Banyak teknik molekuler telah dikembangkan untuk menilai keragaman genetik diantaranya analisis isozim dan RAPD. Isozim adalah enzim yang merupakan produk langsung dari gen, terdiri atas berbagai molekul aktif dengan struktur kimia berbeda tetapi mengkatalisis reaksi kimia yang sama (Adam, 1983). Perbedaan suatu sistem enzim dapat dilihat melalui pola pita dengan metode elektroforesis gel sesudah diwarnai. Perbedaan pola pita tersebut berkaitan langsung dengan perbedaan bobot dan muatan listrik asam amino penyusun enzim yang dianalisis. Susunan asam amino yang membentuk macam-macam protein ini disandikan oleh susunan basa nukleotida dalam DNA yang khas untuk setiap jenis enzim (Ghesquiere, 1984). Isozim mempunyai kelebihan dibandingkan pengamatan karakter morfologi yaitu tidak dipengaruhi lingkungan, bersifat kodominan, membutuhkan sampel sedikit. Kelemahan isozim adalah yang dapat dideteksi terbatas, tidak dapat mendeteksi perubahan sekuen DNA, dan tidak merubah sekuen asam amino polipeptida (Roose, 1988). Random amplified polymorphic DNA (RAPD) adalah amplifikasi fragmen (potongan) DNA melalui PCR menggunakan primer pendek (Williams et al. 1990). Polimorfisme antar genotipe dapat terdeteksi jika ada mutasi titik atau inversi pada tempat melekatnya primer dan adanya penyisipan atau delesi dalam satu fragmen amplifikasi (Debener, 2002). Kelebihan RAPD adalah tidak dipengaruhi lingkungan, membutuhkan sedikit DNA dengan kemurnian tidak tinggi, prosedur sederhana, tanpa radioaktif, dapat mendeteksi perubahan basa tunggal dalam DNA genom jika cukup banyak primer yang digunakan (Deng et al. 1995). Sementara kelemahan RAPD adalah bersifat dominan sehingga ada beberapa informasi yang hilang, jumlah polimorfik dan reproduksibilitasnya lebih rendah (Williams et al. 1990; Koch dan Jung, 1997). Roose (1988) tidak dapat menggunakan isozim untuk membedakan antar kultivar citrus sedangkan Deng et al. (1995) dengan menggunakan RAPD dapat membedakan mutan dari tanaman normal dalam satu genotipe lemon. Deng et al. 20

13 (1995) juga menguji reproduksibilitas RAPD dengan menggunakan DNA yang berasal dari 3 bahan yaitu kalus embrionik, tanaman di rumah kaca dan di lapangan, ternyata dari ketiganya didapatkan pola RAPD yang sama. RAPD dapat digunakan untuk membedakan tanaman Phalaenopsis varian dan tanaman normal hasil perbanyakan in vitro. Isozim AAT juga dapat digunakan untuk membedakan tanaman varian dan tanaman mutan sedangkan PGM menghasilkan pola pita yang sama (Chen et al. 1998). Analisis RAPD dengan 5 primer terhadap 120 tanaman regeneran dari tunas adventif in vitro dari eksplan daun genotipe tunggal bit gula didapatkan 0,05% varian, sedangkan terhadap 30 regeneran sekunder terdeteksi 0,01% varian (Munthali et al. 1996). Shoyama et al. (1997) menyimpulkan bahwa embriogenesis somatik dapat digunakan untuk perbanyakan klonal tanaman ginseng berdasarkan analisis terhadap plantlet yang berasal dari embriogenesis somatik yang diinduksi dari jaringan kalus kuncup bunga ginseng tidak menunjukkan variasi setelah dianalisis dengan menggunakan 21 primer RAPD. Mhatre et al. (2002) menganalisis 10 tanaman nenas berduri (normal) dan 10 tanaman tidak berduri dari 900 tanaman regeneran berumur 4-6 minggu dengan 58 primer RAPD. Primer RAPD OPA 02, 03, 04, 06, dan 08 memproduksi pita polimorfik pada fenotipe berduri sebaliknya OPA 01, 03, 04, 07, 08, dan 09 polimorfik pada fenotipe tidak berduri. Tanaman berduri menghasilkan 1 pita sedangkan tanaman tidak berduri menghasilkan 2 pita dengan primer OPA 04. Jadi tanaman berduri dan tidak berduri menunjukkan perbedaan secara genetik. 21