BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Pada beberapa tahun terakhir, identifikasi spesies hewan menjadi perhatian utama karena semakin meningkatnya kesadaran masyarakat terhadap bahan atau komposisi makanan dan sistem pelabelan makanan yang berisi kandungan dari produk tersebut (Soares dkk., 2013). Hal ini erat hubungannya dengan keamanan makanan, yaitu masalah autentifikasi dan pemalsuan produk makanan terutama pemalsuan dengan daging babi dan turunannya (Murugaiah dkk., 2009; Martin dkk., 2009; Koppel dkk., 2011). Ada beberapa alasan mengapa penggunaan daging babi tidak dibenarkan, yaitu alasan agama (agama Islam melarang umat muslim mengkonsumsi babi, antara lain dalam surah An-Nahl ayat 115), kesehatan (sebagian masyarakat alergi terhadap daging babi), etika (refleksi gaya hidup vegetarian) dan ekonomi (mencari keuntungan dengan jalan pemalsuan) (Kesmen dkk., 2007; Soares dkk., 2013). Koran TEMPO Interaktif Jakarta tanggal 16 April 2009 memberitakan bahwa Balai Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) menemukan lima merek dendeng/abon yang positif mengandung DNA babi setelah melakukan pengujian terhadap 15 produk dendeng dan 20 produk abon di pasaran. Abon babi tersebut dicampur dengan daging sapi dan diberi label abon sapi (Swamurni, 2009). Petugas Balai Besar Veteriner Wates Yogyakarta tanggal 16 Juni 2014 menyatakan telah terjadi pencampuran daging babi dalam olahan daging sapi di 1
Yogyakarta. Dari 109 sampel hasil olahan pangan asal hewan yang diuji, 18 positif mengandung babi. Sampel pengujian adalah bakso, abon, dendeng, nugget, sate, dan sosis. Sedangkan untuk bahan non-pangan, pihaknya menguji produk MBM atau meat and bone meal dan gelatin (Sajarwo dan Assifa, 2014). Identifikasi daging babi telah banyak dilakukan baik pada daging segar maupun produk olahan daging yang ada di pasaran, menggunakan metode identifikasi yang bersifat molekular yaitu metode Polymerase Chain Reaction (Kesmen, dkk., 2007; Che Man, dkk., 2012) dan real-time PCR (Dooley, dkk., 2004; Tjondro dan Sismindari, 2012; Syahruni, dkk., 2013). Metode Polymerase Chain Reaction dan real time PCR membutuhkan DNA sebagai target amplifikasi yang didapat dari hasil isolasi, di mana proses ini harus benar-benar harus diperhatikan karena kadar lemak atau protein yang tinggi dapat menghambat proses PCR (Alaraidh, 2008). Selain itu, proses pemanasan jadi salah satu hambatan dalam memperoleh DNA karena seringkali merusak DNA dan menyebabkan terjadinya fragmentasi (Meyer, dkk., 1994). Metode PCR dan real time PCR memiliki beberapa keunggulan dibanding metode lainnya, yaitu sensitif, sederhana, cepat dan hanya membutuhkan sampel DNA dalam jumlah yang sangat kecil (Che Man, dkk., 2007). Metode real time PCR lebih unggul dari PCR konvensional karena pengukurannya bersifat kuantitatif; dapat mengidentifikasi DNA dalam waktu dan tahapan proses yang singkat, produk amplifikasi dapat secara langsung dimonitor pada tiap siklus amplifikasi, data fluoresensi dapat diperoleh langsung dari alat tanpa perlu elektroforesis, dapat digunakan untuk analisis rutin dengan banyak sampel, serta 2
meminimalisir kontaminasi selama proses amplifikasi (Fraga, dkk., 2006; Nakyinsige, dkk., 2012). Salah satu makanan yang menjadi target utama pemalsuan daging adalah produk abon. Abon merupakan salah satu makanan khas Indonesia, berbahan dasar daging yang pada pengolahannya mengalami proses penggepukan dan 2 kali proses pemanasan, yaitu perebusan dan penggorengan. Di mana seringkali jadi target utama pemalsuan daging (Fachruddin, 2007). Proses pengolahan ini dapat menyebabkan fragmentasi DNA sehingga sulit diperoleh DNA atau jumlah yang diperoleh relatif kecil untuk dapat diamplifikasi pada PCR (Meyer, dkk., 1994). DNA hasil isolasi inilah yang selanjutnya jadi target penempelan primer. Identifikasi DNA babi menggunakan real time PCR membutuhkan suatu primer yang spesifik yang hanya dapat menempel pada target fragmen DNA babi pada urutan basa tertentu dan selanjutnya mengamplifikasi fragmen tersebut. Fatimah (2013) telah mendesain suatu primer yang dapat mengamplifikasi target fragmen mitokondria D-loop babi, yang telah diuji pada sampel bakso babi 100% dan ayam 100% menggunakan metode real time PCR dengan suhu penempelan primer optimum 59 o C. Untuk menjamin validitas suatu primer baru, maka primer mitokondria D- loop22 perlu divalidasi dengan melakukan uji spesifitas menggunakan jaringan segar dari 5 spesies hewan seperti babi, sapi, ayam, kambing dan kuda serta terhadap abon campuran babi:sapi untuk membuktikan bahwa primer mitokondria D-loop22 ini hanya dapat mengenali DNA babi sebagai target amplifikasi dan 3
bukan target lainnya, uji batas deteksi menggunakan seri pengenceran abon babi dan uji keterulangan terhadap abon babi dan abon campuran babi:sapi. 1. Rumusan masalah a. Apakah primer mitokondria D-loop22 dapat secara spesifik mengidentifikasi DNA babi pada jaringan segar 5 spesies hewan (babi, sapi, ayam, kambing dan kuda) dan abon campuran babi:sapi? b. Berapakah batas deteksi primer mitokondria D-loop22 dalam mengidentifikasi DNA babi pada abon babi 100% dan abon campuran babi:sapi dengan metode real time PCR? 2. Keaslian penelitian Identifikasi DNA babi pada daging segar dan produk makanan olahan berbahan dasar daging telah sering dilaporkan. Salah satu target identifikasi spesies yang telah digunakan adalah fragmen mitokondria D-loop yang dapat mengidentifikasi DNA babi pada daerah yang spesifik. Fajardo, dkk., (2008) melaporkan diferensiasi spesies babi European wild boar dan domestic swine dengan primer spesies spesifik mitokondria D- loop (MITDLOOP - FW : 5 -TACCATGCCGCGTGAAACCA-3 dan MIT DLOOP - REV : 5 - TGACGGCCATNGCTGAGTC-3 ) dengan amplikon 270 pb. Che Man, dkk., (2012) telah melakukan identifikasi daging segar dari beberapa spesies hewan (babi, sapi, ayam, kambing, rusa dan domba) menggunakan metode PCR dengan target primer fragmen mitokondria D- loop pada urutan basa 910 1083, menggunakan primer Sus-loopFWD ; 5-4
CACACCCTATAACGCCTTGC-3 dan Sus-loopRVS ; 5 -GATTGGCGTA AAAATCTAGGG-3, dengan ukuran amplikon 174 pb (GenBank, ClustalW). Hasilnya, spesifitas primer sebesar 0,1% (v/v) campuran binari DNA babi dan sapi. Hasil sensitivitas (batas deteksi) 0,001 ng/μl. Karabasanavar, dkk., (2014) telah mengidentifikasi babi di antara 24 spesies hewan lain (mamalia, burung, tikus dan ikan) pada daging mentah, daging yang telah direbus (suhu 60, 80 dan 100 o C) maupun yang dipanaskan pada autoklaf (121 o C), menggunakan metode PCR dengan target primer fragmen mitokondria D-loop pada sekuen berbeda, menggunakan primer forward VPHPF 5 -AATTTTTGGGGATGCTTAGACT-3 dan reverse VPH-PR 5 -TATTTTGGGAGGTTATTGTGTTGTA-3 ) dengan amplikon 712 pb (GenBank, Megalign-Lasergene). Hasilnya, spesifitas primer 0,1% dan sensitivitas sebesar 10 pg. Fatimah (2013) mendesain primer dengan target amplifikasi DNA mitokondria D-loop (sumber : Basic Local Alignment Search Tool software) pada basa urutan 22-43 (PD-loop forward: 5 -TCGTATGCAAACCAAAAC GCC-3 ) dan 197-177 (PD-loop reverse : 5 -ATGCATGGGGACTAGCAG TTA-3 ), amplikon 176 pasang basa (pb). Primer ini telah digunakan untuk mengamplifikasi DNA babi pada bakso babi dan ayam 100% dengan metode real time PCR dengan suhu penempelan primer optimum 59 o C. Pada penelitian ini akan dilakukan uji lanjutan terhadap primer mitokondria D-loop22 (Fatimah, 2013), yaitu optimasi primer dan validasi metode analisis DNA babi dengan primer mitokondria D-loop22 5
menggunakan metode real time PCR yang meliputi uji spesifitas primer terhadap 5 spesies hewan (babi, sapi, ayam, kambing dan kuda) dan abon campuran babi:sapi, uji sensitivitas terhadap abon babi 100% dan abon campuran babi:sapi pada beberapa konsentrasi (batas deteksi terendah yang masih dapat diamplifikasi) dan uji repitabilitas terhadap abon campuran babi:sapi. 3. Urgensi penelitian Diharapkan penelitian ini dapat menghasilkan metode yang sensitif dan selektif untuk digunakan dalam mengidentifikasi kontaminasi daging babi pada produk daging olahan. Metode yang diperoleh tersebut selanjutnya dapat digunakan untuk membantu LP-POM dalam menentukan status kehalalan produk pangan yang beredar di pasaran guna menghindari pemalsuan daging dan sebagai dasar dalam memberikan sertifikasi Halal. B. Tujuan Penelitian 1. Menentukan spesifitas primer mitokondria D-loop22 dalam mengidentifikasi DNA babi pada jaringan segar 5 spesies hewan (babi, sapi, ayam, kambing dan kuda) dan pada abon campuran babi:sapi dengan metode real time PCR. 2. Menentukan batas deteksi primer mitokondria D-loop22 dalam mengidentifikasi DNA babi pada abon babi 100% dan abon campuran babi:sapi dengan metode real time PCR. 6