LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PEWARNAAN GRAM NAMA : DESTIANA PURNAMA NPM : 260110140097 HARI,TANGGAL PRAKTIKUM : RABU, 23 SEPTEMBER 2015 ASISTEN : 1. BETHARY K 2. HIMMATUL ULYA LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN JATINANGOR 2015
PEWARNAAN GRAM I. Tujuan 1. Mengamati dua kelompok bakteri yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram. 2. Memahami setiap langkah dan reaksi reaksi kimia yang terjad dalam prosedur tersebut. II. Prinsip 1. Teknik Pewarnaan Diferensial Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba (Pelczar dan Chan, 2007). 2. Pewarnaan Gram Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar gram-positif dan gram-negatif berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel bakteri (Karmana, Oman, 2008). 3. Zat Warna Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, salah satu di antaranya berwarna (Volk & Wheeler, 1993). III. Teori Dasar Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah pewarna sederhana dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini
dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994). Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul (Waluyo, 2010). Pewarnaan gram (GS) adalah teknik pewarnaan utama yang digunakan untuk pemeriksaan mikroskopis bakteri. Bakteri yang tidak diketahui dapat diklasifikasikan menjadi Gram-positif atau Gram negatif oleh GS, di mana kehilangan warna adalah perangkap utama, karena beberapa bakteri gram positif mengalami kehilangan warna lebih cepat, dan salah diidentifikasi sebagai gram negatif (Chandra and Mani, 2011). Perbedaan warna pada bakteri gram positif dan gram negatif menunjukkan bahwa adanya perbedaan struktur dinding sel antara kedua jenis bakteri tersebut. Bakteri gram positif memiliki struktur dinding sel dengan kandungan peptidoglikan yang tebal sedangkan bakteri gram negatif memiliki struktur dinding sel dengan kandungan lipid yang tinggi (Fitri dan Yasmin, 2011). Bakteri memiliki dinding sel terdiri dari peptidoglikan. Dinding sel ini memberikan kekakuan kesel, dan perlindungan dari lisis osmotik dalam solusi encer. Bakteri gram positif memiliki dinding sel mesh tebal, bakteri gram negatif memiliki dinding sel tipis dan membran luar bilayer fosfolipid (Davies et al. 1983). IV. Alat dan Bahan 4.1 Alat 4.1.1 Bak Pewarna 4.1.2 Botol Semprot 4.1.3 Gelas Kimia 4.1.4 Kaca Objek 4.1.5 Kapas
4.1.6 Kertas Saring 4.1.7 Mikroskop Cahaya 4.1.8 Ose 4.1.9 Pipet 4.1.10 Pembakar Spiritus 4.2 Bahan 4.2.1 Air Fuchsin 4.2.2 Alkohol 70% 4.2.3 Alkohol 95% 4.2.4 Aquadest 4.2.5 Lugol 4.2.6 Minyak Emersi 4.2.7 Suspensi Campuran Bakteri 4.2.8 Zat Warna Karbol Gentian Violet (CGV) 4.3 Gambar Alat Bak Pewarna Botol Semprot Gelas Kimia Kaca Objek Kapas Kertas Perkamen Mikroskop Cahaya Ose Pipet Tetes Pembakar Spirtus
V. Prosedur Pertama sediakan kaca objek steril yang terlebih dahulu direndam dengan alkohol 70 % pada gelas kimia kemudian lap kaca objek dengan kapas sampai kering. Dinyalakan pembakar spirtus dengan korek api, ambil kawat ose dan lakukan fiksasi, setelah itu ambil tabung reaksi yang berisi suspensi bakteri lalu dibuka dan ambil suspensi dengan ose, proses ini dilakukan di dekat api. Selanjutnya oleskan suspensi pada kaca objek selebar mungkin, beri tanda olesan dengan spidol permanen pada bawah kaca, kemudian lewatkan kaca objek pada api sebanyak tiga kali cepat. Kedua letakkan kaca objek pada bak pewarna, teteskan pewarna karbol gentian violet pada olesan bakteri dan dibiarkan selama satu menit lalu bilas kaca objek menggunakan air suling dengan cara menyemprotkannya ke kaca objek secara perlahan. Selanjutnya teteskan lugol selama dua menit, buang lugol yang berlebih kemudian bilas dengan air suling secara perlahan. Kemudian kaca objek dtetesin dengan alkohol 95% 30 detik lalu bilas dengan air suling secara perlahan. Setelah itu, kaca objek ditetesi dengan pewarna tandlingan air fuksin selama 30 detik, kemudian bilas dengan air suling secra perlahan dan dikeringkan dengan kertas saring dengan cara menotolkan kertas saring perlahan pada kaca objek tanpa menghilangkan olesan bakteri. Olesan bakteri ditetesi sedikit minyak emersi pada kaca objek lalu amati bakteri pada mikroskop dengan perbesaran dari yang terendah 10x sampai yang terbesar 100x kemudian hasil pengamatan didokumentasikan. VI. Hasil Data Pengamatan No. Perlakuan Hasil 1. Kaca objek dibersihkan dan dikeringkan dengan kapas 2. Ose difiksasi dengan membakar ose diatas pembakar spirtus 3. Ose dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi suspensi bakteri dan ose dioleskan ke atas kaca objek agar bakteri menempel pada kaca objek Kaca objek sudah bersih dan kering Ose sudah difiksasi Bakteri sudah menempel di kaca objek
4. Kaca objek dikeringkan dengan dilewati diatas pembakar spirtus 5. CGV diteteskan pada kaca objek dimana bakteri berlokasi dan diamkan selama 1 menit 6. Kaca objek dibilas perlahan dengan air suling 7. Lugol diteteskan pada kaca objek dimana bakteri berlokasi dan didiamkan selama 2 menit 8. Kaca objek dibilas perlahan dengan air suling Kaca objek ditetesi alkohol 95 % 9. Kaca objek sudah kering Kaca objek berwarna biru tua Kaca objek bersih dan tidak ada CGV yang tersisa Kaca objek berwarna kuning Kaca objek bersih dan tidak ada lugol yang tersisa Kaca objek sudah ditetesi alkohol 90% 10. Kaca objek dibilas perlahan dengan air suling Kaca objek ditetesi fuchsin dan 11. didiamkan selama 30 detik 12. Kaca objek dibilas perlahan dengan air suling Kaca objek dikeringkan dengan 13. menggunakan kertas saring dan ditetesi minyak emersi 14. Kaca objek diletakkan dibawah mikroskop dan dilihat pada perbesaran 10, 40 dan 100 Kaca objek bersih dan tidak ada alkohol yang tersisa Kaca objek berwarna merah muda Kaca objek bersih dan tidak ada fuchsin yang tersisa Kaca objek sudah kering dan sudah ditetesi minyak emersi, siap untuk dilihat di bawah mikroskop Bakteri terlihat berwarna merah/biru
Gambar Mikroskop No. Foto 1. Keterangan Perbesaran : 40 x Bentuk : Bacilli Warna : Merah Pewarna : CGV, Lugol, Fuchsin Bakteri : E. coli 2. Bacilli Perbesaran : 10 x Bentuk : Coccus Warna : Biru Pewarna : CGV, Lugol, Fuchsin Bakteri : Staphylococcus aureus Coccus VII. Pembahasan Bakteri berasal dari bahasa Latin bacterium; jamak: bacteria adalah kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti sel. Organisme ini termasuk ke dalam domain prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik). Hal ini menyebabkan organisme ini sangat sulit untuk dideteksi, terutama sebelum ditemukannya mikroskop. Barulah setelah abad ke-19 (setelah ditemukannya mikroskop), ilmu tentang mikroorganisme terutama bakteri (bakteriologi) mulai berkembang. Dalam praktikum kali ini praktikan melakukan pewarnaan gram atau metode gram pada bakteri. Pewarnaan Gram atau Metode Gram adalah suatu metode
untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni grampositif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853 1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Bakteri dibagi menjadi dua yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri garam positif memiliki dinding sel relatif tebal, terdiri dari berlapis-lapis polymer peptidoglycan (disebut juga murein). Tebalnya dinding sel menahan lolosnya komplek crystal violet-iodine ketika dicuci dengan alkohol atau aseton. Sedangkan bakteri gram negatif memiliki dinding sel berupa lapisan tipis peptidoglycan, yang diselubungi oleh lapisan tipis outer membrane yang terdiri dari lipopolysaccharide (LPS). Daerah antara peptidoglycan dan lapisan LPS disebut periplasmic space (hanya ditemui pada Gram negatif) adalah zona berisi cairan atau gel yang mengandung berbagai enzymes dan nutrient-carrier proteins. Kompleks Crystal violet-iodine mudah lolos melalui LPS dan lapisan tipis peptidoglycan ketika sel diperlakukan dengan pelarut. Ketika sel diberi perlakuan pewarna tandingan Safranin O, pewarna tersebut dapat diserap oleh dinding sel bakteri Gram negatif. Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu: Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
Tidak resisten terhadap gangguan fisik. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat Peka terhadap streptomisin Toksin yang dibentuk Endotoksin Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu: Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. Lebih resisten terhadap gangguan fisik. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut Tidak peka terhadap streptomisin Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin Perbedaan dari bakteri gram negatif dan gram positif yaitu, bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel kegunaannya yaitu, untuk melihat atau mengamati bentuk-bentuk sel bakteri dan memberikan sifat reaksi pewarnaan bakteri yang dapat diketahui dengan melihat apakah termasuk negatif-gram (berwarna merah) atau positif-gram (berwarna biru). Kaca objek di bersihkan terlebih dahulu menggunakan alkohol 70 % bertujuan agar kaca objek steril. Dalam pengerjaan pewarnaan gram ini harus dilakukan dekat dengan pembakar spirtus agar tidak terjadi kontaminasi mikroba lain. Kemudian dilakukan fiksasi, Fiksasi adalah proses pengawetan dan pelekatan atau penempelan struktur sel mikroorganisme pada suatu posisi. Selain itu fiksasi juga berfungsi untuk menonaktifkan enzim lytic sehingga bakteri tidak mengalami lisis dan berubah bentuk pada saat diamati. Fiksasi dilakukan setelah olesan pada kaca preparat sudah kering. Jika olesan belum kering akan menyebabkan sel-sel mikroorganisme yang bersangkutan menjadi tidak beraturan bentuknya. Tujuan dari fiksasi adalah pelekatan bakteri supaya pada saat pencucian, bakteri tersebut tidak ikut hilang tercuci. Fiksasi yang digunakan pada percobaan kali ini adalah fiksasi panas, yaitu dengan cara melewatkan kaca preparat di atas api. Fiksasi dilakukan sampai kaca preparat terasa hangat apabila ditempelkan pada punggung tangan. Fiksasi yang dilakukan tidak boleh terlalu panas dan lama, karena bakteri yang ada pada preparat bisa hangus terpanggang dan terjadi perubahan bentuk dan penyusutan sel.
Kristal violet yaitu zat warna yang memberikan atau menunjukkan sifat pewarnaan negatif dengan memberikan warna ungu pada bakteri yang peka terhadap zat warna basa. Fungsi larutan Lugol,yaitu: 1. Meningkatkan aktifitas peningkatan zat warna oleh bakteri. 2. Untuk memperjelas zat warna. 3. Mempersulit kelarutan zat warna. Penambahan etanol 95% ini berfungsi untuk memucatkan warna ungu kristal pada kaca preparat yang sudah menempel pada olesan bakteri tersebut. Selain digunakan etanol sebagai pemucat, dapat juga digunakan zat lain yang dapat melarutkan kompleks ungu-iodium, contohnya aceton. Namun, aceton merupakan pemucat yang bekerja paling cepat sehingga dikhawatirkan akan terjadi pemucatan yang berlebihan. Pemucatan ini akan mengakibatkan bakteri gram negatif kehilangan warnanya dan kembali menjadi tak berwarna, namun bakteri gram positif tetap berwarna ungu/ biru. Air fuchsin berfungsi untuk memberi warna kembali kepada bakteri sehingga akan terlihat mana bakteri gram positif atau gram negatif. Pemberiaan minyak emersi bertujuan karena cahaya yang datang dibiaskan melalui 2 medium yang berbeda, yaitu udara dan kaca. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu bahan yang mampu membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang mendekati garis normal. Bahan yang mampu membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang mendekati garis normal adalah minyak imersi. Selain itu, minyak imersi juga mempunyai indeks bias yang mendekati atau identik dengan kaca. Kemudian amati menggunakan mikroskop cahaya maka didapat dua bakteri yaitu bakteri gram negatif Eschericia colli dan bakteri gram positif Staphylococcus aureus. E. colli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2 micrometer dan diamater 0.5 micrometer. Volume sel E. colli berkisar 0.6-0.7 micrometer kubik. Bakteri ini termasuk umumnya hidup pada rentang 20-40 derajat C, optimum pada 37 derajat. salah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich ini dapat ditemukan dalam usus besar manusia. Kebanyakan E.colli tidak berbahaya, tetapi beberapa, seperti E.colli tipe O157:H7, dapat mengakibatkan keracunan makanan yang serius pada manusia yaitu diare berdarah karena eksotoksin yang dihasilkan
bernama verotoksin. Toksin ini bekerja dengan cara menghilangkan satu basa adenin dari unit 28S rrna, sehingga menghentikan sintesis protein. Sumber bakteri ini contohnya adalah daging yang belum masak, seperti daging hamburger yang belum matang. E.colli yang tidak berbahaya dapat menguntungkan manusia dengan memproduksi vitamin K 2, atau dengan mencegah bakteri lain di dalam usus. E.colli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan. E.colli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya. Morfologi dari S. Aureus yaitu sel berbentuk bola, berdiameter 0,5 sampai 1,5 µm, terdapat tunggal dan berpasangan dan secara khas membelah diri pada lebih dari satu bidang, sehingga membentuk koloni yang tidak teratur. Merupakan gram positif dengan dinding sel mengandung dua komponen utama peptidoglikan serta asam tekoat. Tumbuh lebih cepat dalam keadaan aerobic dengan suhu optimum 350 C 400 C, berasosiasi dengan kulit, kelenjar kulit dan selaput lender hewan berdarah panas. Bakteri positif memiliki sifat mampu bereaksi dengan zat warna yang bersifat asam, sedangkan bakteri negatif dapat bereaksi dengan zat warna yang bersifat basa. Karena pada zat warna basa memberikan muatan positif dan zat warna asam memberikan muatan negatif. VIII. Simpulan Dari hasil pewarnaan gram didapat hasil yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif yaitu Staphylococcus aureus membentuk warna ungu kebiruan dan bakteri gram negatif Eschericia colli membentuk warna merah atau merah muda.
Daftar Pustaka Chandra, T. J and P. Subha Mani. 2011. Journal of Medical & Allied Sciences. A study of 2 rapid tests to differentiate Gram positive and Gram negative aerobic bacteria. 1 ( 2 ) : 84-85. Davies, J. A., et al. 1983. Chemical Mechanism of the Gram Stain and Synthesis of a New Electron-opaque Marker for Electron Microscopy Which Replaces the Iodine Mordant of the Stain. J Bacteriol. 156(2):837-845. Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta. Fitri,L. dan Yasmin, Y. 2011.Jurnal Ilmiah Pendidikan Biologi, Biologi Edukasi. Isolasi Dan Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri Kitinolitik. Volume 3, Nomor 2, hal 20-25. Karman, Oman. 2008. Biologi untuk Kelas X Sekolah Menengah Atas. Bandung: Grafindo Media Pratama. Pelczar, M. J., dan Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. New York : Mc Graw Hill Book. Waluyo,lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM. Malang. Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Erlangga.