LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI DASAR. Percobaan 5 Pewarnaan Gram

Transkripsi

1 LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI DASAR Percobaan 5 Pewarnaan Gram Disusun Oleh: Anisa Zega ( ) Arisya Apilia ( ) Ika Mustikawati ( ) Jagad Tahari Fadilluloh ( ) Kemal Ahmad Riva I ( ) Susanna Noviana N ( ) Kelompok 6 PROGRAM STUDI PENDIDIKAN TEKNOLOGI AGROINDUSTRI FAKULTAS PENDIDIKAN DAN TEKNOLOGI KEJURUAN UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA 2015

2 BAB I TEORI Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur. Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah. Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Rudi, 2010). Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram. Habitat endospora bakteri ini adalah tanah. Mikroba tersebut dalam bentuk spora yang kekurangan nutrisi. Organisme ini dapat menghasilkan antibiotik selama sporulation. Contohnya polymyxin, difficidin, subtilin, dan mycobacillin. Banyak dari mikroba Bacillus dapat menurunkan Polymers seperti protein, pati, dan pektin, sehingga bakteri ini merupakan penyumbang penting kepada siklus karbon dan nitrogen. Akan tetapi apabila terkontaminasi, dapat menyebabkan pembusukan. Berdasarkan pewarnaan sel

3 vegetatif didapatkan warna kemerahan dan warna endosporanya adalah hijau (Schaechter 2006). Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram ( ) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarnaan Diferensial (Gram) Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram ( ) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang

4 membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. a. Bakteri Gram Negatif Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. b. Bakteri Gram Positif Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010). Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, poripori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek.

5 BAB II TUJUAN PRAKTIKUM 1. Mahasiswa dapat membedakan bakteri positif dan negatif. 2. Mahasiswa dapat mengetahui morfologi pada bakteri. 3. Mahasiswa dapat melakukan teknik pewarnaan bakteri.

6 BAB III ALAT DAN BAHAN 3.1 Alat 1. Pipet tetes 2. Mikroskop 3. Lampu bunsen 4. Object glass 3.2 Bahan 1. Kapas 2. Tissue 3. Ethanol 95% 4. Larutan lugol 5. Aquades 6. Biakan bakteri 7. Biakan satranin 8. Biakan kristal violet

7 BAB IV PROSEDUR KERJA 4.1 Pewarnaan Positif 1. Membersihkan object glass dengan kapas 2. Menuliskan kode atau nama bakteri pada sudut object glass 3. Menggunakan biakan cair memindahkan setetes biakan dengan pipet tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. Biakan dikocok. 4. menggunakan biakan padat memindahkan bakteri dengan jarum inokulum, satu ulasan saja kemudian memberi aquades dan menyebarkan pada object glass hingga sel merata. 5. Mengeringkan ulasan sambil memfiksasi dengan api bunsen (melewatkan di atas api 2-3 kali) 6. Mentetesi dengan pewarna (dapat digunakan methylen blue, safranin, crystal violet) dan tunggu kurang lebih 30 detik. 7. Mencuci dengan aquades kemudian mengeringkan dengan tissue 8. Mengamati dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10). 4.2 Pewarnaan Negatif 1. Mengambil dua object glass, meneteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah satu object glass 2. Mengambil biakan lalu mengulaskan atau menteteskan dalam tetesan nigrosin tadi, dan mencampurkannya 3. Menempelkan sisi object glass yang lain kemudian menggesekkan ke samping kiri 4. Membiarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau memanaskan di atas api.

8 4.3 Pewarnaan Gram 1. Membuat preparat ulas yang difiksasi dari bakteri gram positif dan gram negatif. 2. Meneteskan kristal violet sebagai pewarna utama pada kedua preparat (semua ulasan terwarnai dan tunggu selama 1 menit) 3. Mencuci dengan aquades mengalir 4. Meneteskan mordat (lugol, iodine) lalu tunggu 1 menit) 5. Mencuci dengan akuades mengalir 6. Memberi larutan pemucat (ethanol 96%/ aseton) setetes demi setetes hingga etanol yang jatuh berwarna jernih. 7. Mencuci dengan akuades mengalir 8. Meneteskan counterstain dan tunggu selama 45 detik 9. Mencuci dengan akuades mengalir 10. Mengeringkan preparat dengan kertas tissue yang ditempelkan di sisi ulasan (jangan sampai merusak ulasan) lalu membiarkan mengering di udara.

9 BAB V HASIL PENGAMATAN Kelompok Pewarnaan Positif Pewarnaan Negatif Pewarnaan Gram

10 6

11 BAB VI PEMBAHASAN 5.1 Pembahasan Menurut Susan Nama : Susanna Noviana N Tanggal Praktikum : 13 Oktober 2015 Nim : Tanggal Laporan : 20 Oktober 2015 Pewarnaan Bakteri Pada praktikum kali ini kami melakukan pewarnaan gram dan pengamatan morfologi bakteri. Biakan murni yang digunakan yaitu bakteri pada yogurt. Namun pada pratikum ini setelah dilakukan pengamatan ternyata yang terlihat pada mikroskop ternyaa bakteri Basillus. Hali ini terjadi mungkin karena sudah terjadi kontaminasi sehingga bakteri yang terdapat dalam pengamatan adalah Bacillus. Sehingga dalam pembahasan praktikum ini kami lebih banyak membahas bakteri Bacillus. Bacillus merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang, Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan gram menggunakan 4 macam zat pewarna yaitu meliputi Kristal Violet sebagai pewarna primer, Iodium sebagai pewarna sekunder, Alkohol sebagai larutan pemucat, Safranin sebagai pewarna pembanding. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat

12 warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. Umumnya bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak membiaskan cahaya hal tersebut menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna dapat mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Mengamati bakteri dalam kehidupan sangat sulit sehingga dikembangkan teknik pewarnaan sel bakteri agar sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu : 1. Fiksasi 2. Pelunturan warna 3. Substrat 4. Intensifikasi pewarnaan 5. Penggunaan zat pewarna penutup. Pada praktikum kali ini dilakukan teknik pewarnaan yaitu pewarnaan pada bakteri. Diawali dengan mengoleskan isolat bakteri (Bacillus SP) dengan tujuan agar isolat bakteri dapat merata dikaca preparat. Lalu dilakukan fiksasi untuk melekatkan mikroorganisme di kaca preparat. Sedangkan pemberian Iodium bertujuan untuk memperkuat warna pada bakteri. Alkohol 95% berfungsi sebagai pemucat atau peluntur warna pada bakteri. Dan tahap terakhir yaitu pemberian satranin yang berfungsi untuk memberi warna kembali pada bakteri yang telah kehilangan warna pada proses pemucatan dengan menggunakan alkohol. Pada bakteri di preparat menunjukkan warna ungu. Hal ini membuktikan bahwa bakteri di preparat merupakan bakteri gram positif dikarenakan pada bakteri ini mengandung banyak peptidogligan sehingga mudah berikatan dengan kristal ungu. Jika berwarna merah

13 muda menunjukan bakteri gram negatif dikarenakan pada bakteri tersebut mengandung banyak lipid sehingga mudah berikatan dengan safranin. Hasil uji bakteri agar miring atau Bacillus sp dapat mempertahankan warna primernya walaupun mengalami dekolorisasi(pencucian) ketika ditambahkan alkohol sehingga bakteri Bacillus sp merupakan kelompok bakteri gram positif. Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan perbedaan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci. 5.2 Pembahasan Menurut Arisya Nama : Arisya Apilia Tanggal Praktikum : 13 Oktober 2015 Nim : Tanggal Laporan : 20 Oktober 2015 Pewarnaan Bakteri Pewarnaan bakteri merupakan salah satu cara untuk mengetahui bentuk bakteri yang diamati. Pewarnaan bakteri dilakukan karena pada umumnya bakteri memiliki warna transparan, sehingga sulit untuk diamati. 1. Pewarnaan sederhana Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.

14 1.Pewarnaan Positif Pewarnaan positif atau pewarnaan asam merupakan metode pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Bakteri yang digunakan pada praktikum kali ini adalah bakteri yang terdapat pada yoghurt (Lactobacillus Bulgaricus dan Streptococcus thermopillus). Pewarnaan positif dilakukan dengan cara memindahkan bakteri pada objek glass menggunakan jarum ose, kemudian memfiksasi objek glass sebanyak 2-3 kali pada api bunsen, fiksasi tersebut bertujuan untuk membunuh bakteri, dan mengeringkan bakteri sehingga dapat menempel pada objek glass. Setelah itu bakteri di tetesi kristal violet (tunggu selama 30 detik), kemudian di cuci dengan aquades dan dikeringkan menggunakan tisu. Setelah kering objek glass diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10. Hasilnya bakteri yang mengalami proses pewarnaan positif berwarna violet (sesuai dengan pewarna yang di berikan) karena bakteri positif bersifat mempertahankan warna yang diberikan. Bakeri Lactobacillus Bulgaricus berbentuk batang dan Streptococcus thermopillus berbentuk bulat. 2.Pewarnaan Negatif Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Pewarnaan Negatif dilakukan dengan cara meneteskan nigrosin (tinta cina) pada objek glass, Bakteri yang digunakan pada praktikum kali ini adalah bakteri yang terdapat pada yoghurt (Lactobacillus Bulgaricus dan Streptococcus thermopillus). Setelah itu meteskan bakteri di atas nya, lalu mencampurkannya menggunakan tusuk gigi. Kemudian

15 menempelkan objek glass yang lain diatasnya. Dan mengeringkan preparat tersebut di udara, tanpa dipanaskan di atas api bunsen.lalu mengamatinya pada mikroskop dengan perbesaran 100x10. Hasilnya adalah bakteri terlihat transparan (tembus pandang). Sedangkan lingkungannya berwarna hitam. Bakeri Lactobacillus Bulgaricus berbentuk batang dan Streptococcus thermopillus berbentuk bulat. 2. Pewarnaan Gram Pewarnaan gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram ( ) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Pewarnaan gram dilakukan dengan cara menyiapkan preparat yang telah di fiksasi, kemudian ditetesi dengan kristal violet (tunggu selama 1 menit), kristal violet berfungsi sebagai pewarna utama dalam pewarnaan gram. Mencucinya menggunakan aquades yang mengalir. Meneteskan mordat (iodine, lugol) dan tunggu selama 1 menit. Mordat berfungsi sebagai pengikat warna. Mencucinya menggunakan aquades yang mengalir. Meneteskan ethanol 95% setetes demi setetes hinga ethanol yang jatuh berwarna jernih. Ethanol disini berfungsi sebagai peluntur. Mencucinya menggunakan aquades yang mengalir. Meneteskan safranin

16 selama 45 detik. Safranin berfungsi sebagai pewarna sekunder. Mencucinya menggunakan aquades yang mengalir. Kemudian mengeringkan preparat menggunakan tisu, namun jangan sampai merusak ulasannya. Setelah itu mengamati preparat tersebut pada mikroskop dengan perbesaran 100x10. Berdasarkan hasil pengamatan dapat diketahui : a. Bakteri Gram Negatif Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. b. Bakteri Gram Positif Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu ketika diamati padamikroskop, Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna violet.

17 Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif. Sifat Bakteri gram (+) Bakteri gram (-) Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-4%) Kandungan lipid tinggi Kandungan peptidoglikan Ketahanan terhadap penisilin Penghambatan oleh pewarna basa (VK) Kebutuhan nutrisi Ketahanan terhadap perlakuan fisik (Manurung, 2010) Pepidoglikan tinggi Lebih sensitif Lebih dihambat Kebanyakan spesies relatif kompleks Lebih tahan Peptidoglikan rendah Lebih tahan Kurang dihambat Relatif sederhana Kurang tahan 5.3 Pembahasan Menurut Ika Nama : Ika Mustikawati Tanggal Praktikum : 13 Oktober 2015 Nim : Tanggal Laporan : 20 Oktober 2015 Pewarnaan Bakteri

18 Pewarnaan positif merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel (Entjang, 2003). Zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif kali ini adalah kristal violet. Pewarnaan positif ini termasuk pewarnaan sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai bakteri yang akan diamati tersebut. Pewarnaan negatif merupakan pewarnaan untuk mewarnai bakteri dan mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Metode ini digunakan untuk sel-sel dan struktur-struktur bakteri yang sukar untuk diwarnai secara langsung. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina dan berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel (Entjang, 2003). Karena cat nigrosin atau tinta cina susah didapat, dalam pengamatan pewarnaan negatif kali ini kita menggunakan tinta spidol biasa. Pewarnaan gram pertama kali dikemukakan oleh ilmuwan Denmark Hans Christian gram pada tahun 1884, sehingga bakteri dapat digolongkan menjadi dua kelompok yaitu gram negatif dan gram positif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada diantara dua lapis membran sel (lud, 2008). Bakteri adalah makhluk hidup yang sangat kecil, tipis sehingga tembus cahaya dan hanya dapat dilihat dengan mikroskop. Dengan mikroskop pun sulit untuk melihat bagianbagiannya dengan jelas maka dilakukanlan pewarnaan pada tubuh bakteri tersebut. Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003). Bakteri bersifat tidak berwarna bukan hanya karena kecil dan tipis melainkan karena warna selnya juga transparan sehingga jika dimedium berair akan sulit untuk dilihat apalagi jika bakteri itu hidup.

19 Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Dwidjoseputo, 1987). Pada praktikum pewarnaan bakteri ini dilakukan pewarnaan positif, pewarnaan negatif dan pewarnaan gram. Alat dan bahan yang digunakan antara lain object glass yang berfungsi sebagai tempat biakan yang akan diamati. Pipet tetes yang berfungsi sebagai alat memindahkan biakan ke object glass. Lampu bunsen yang berfungsi untuk memfiksasi. Mikroskop untuk mengamati struktur dan bagian sel bakteri secara lebih detail. Aquades untuk mencuci alat dan kapas atau tisu untuk mengeringkannya. Biakan yang digunakan dan diamati adalah biakan cair yaitu yoghurt yang didalamnya sudah jelas terdapat bakteri Streptococcus thermophilus dan Lactobacillus bulgaricus. Dalam pewarnaan gram juga digunakan 4 zat kimia yang berbeda-beda, zat kimia tersebut adalah: 1. Zat warna primer yaitu kristal violet berfungsi sebagai zat warna primer dan memberikan warna pada seluruh bagian sel berarna biru ungu. 2. Iiodin, zat ini berperan sebagai mordan yaitu zat kimia yang membentuk komplek yang tidak larut dengan mengikat zat warna primer (H.M S ubandi, 2010). Hasilnya adalah kompleks kristal violet iodin yang berfungsi mengintensifkan warna zat warna primer sehingga seluruh sel akan tampak ungu gelap. Warnanya akan sangat sulit untuk dipisahkan/dihilangkan. 3. Zat decoulourizing, yaitu etil alkohol dengan konsentrasi 95%. Zat itu berperan ganda sebagai pelarut lipida dan sebagai zat dehidrasi protein efektif

20 (H.M Subandi, 2010). Perannya bergantung pada konsentrasi lipida dari dinding sel mikroorgansime. Pada sel gram positif konsentrasi lipid yang sedikit akan dengan mudah larut dalam alkohol dan menyebabkan pembentukan pori-pori dinding sel yang kecil. Pori-pori itu kemudian ditutup dengan alkohol yang mempunyai daya dehidrasi. Sebagai akibatnya zat warna primer yang terikat kuat menjadi sulit dihilangkan dan sel tetap berwarna biru. Pada sel bakteri gram negatif dibagian luar lapisan dinding sel terdapat konsentrasi lipid yang tinggi menyebabkan hilangnya kompleks kristal violet-iodin. Konsentrasi lipida yang tinggi larut oleh alkohol yang menciptakan pori-pori yang besar pada dinding sel. Hal itu akan menyebakan lepasnya zat kristal violet iodin yang tidak terikat dan menyebabkan sel bakteri tersebut kehilangan warnanya atau tidak berwarna. 4. Lawan warna (counterstain) yaitu safranin. Zat ini merupakan zat kimia terkhir untuk mewarnai sel yang kehilangan warnanya oleh alkohol. Karena hanya pada gram negatif yang luntur warnanya maka hanya gram negatif yang akan menyerap/menerima zat warna safranin ini. Sedangkan gram positif akan tetap berwarna seperti zat warna primer tadi. Berdasarkan hasil pengamatan diatas pada pewarnaan positif terlihat banyak bakteri yang berwarna ungu. Karena menggunakan mikroskop yang tidak terlalu mendetail maka bentuk morfologis bakterinya tidak terlalu jelas terlihat. Terlihat ada yang berbentuk tidak beraturan dan juga ada yang berbentuk coccus (bulat). Pada pewarnaan negatif dalam mikroskop terilhat bakterinya adalah yang berwarna putih (transparan). Terlihat juga ada yang berbentuk coccus (bulat) dan bacill (batang). Karena bakteri yang diamati dalam yoghurt ini adalah Streptococcus thermophilus dan Lactobacillus bulgaricus yang termasuk kedalam bakteri gram positif maka pada pewarnaan garam ini seharusnya bakteri ini berwarna zat warna primer yaitu warna ungu. Namun terlihat di mikroskop bakteri yang diamati itu ada yang berwarna merah mudanya.

21 Karena demikian sensitifnya perubahan kimiawi yang terjadi, maka terdapat titik kritis yang perlu diperhatikan agar diperoleh hasil yang akuran dalam pewarnaan bakteri ini. Titik kritis tersebut adalah pada saat pelunturan warna dengan alkohol. Jika menggunakan alkohol terlalu banyak dapat menyebabkan sel gram-positif kehilangan warna primernya yang seharusnya dapat dipertahankan. Sehingga saat diwarnai dengan zat ke-2 (safranin), sel gram-positif tersebut justru dapat menerima warna ke-2 itu. 5.4 Pembahasan Menurut Anisa Nama : Anisa Zega Tanggal Praktikum : 13 Oktober 2015 Nim : Tanggal Laporan : 20 Oktober 2015 Pewarnaan Bakteri Bakteri adalah mikroorganisme yang sangat sederhana yang tidak bernukleus dan sifatnya berbeda dengan organisme yang mempunyai inti sel. selain itu bakteri merupakan organisme yang sangat kecil (yang berukuran mikroscopis) akibatnya pada mikroskop tidak tampak jelas dan sukar untuk melihat morfologinya maka dari itu dilakukan pewarnaan bakteri yang biasa disebut pengenceran baketri. pada umumnya larutan-larutan zat warna yang digunakan adalah larutan encer yang lebih dari satu persen. Pada percobaan kali ini kami lebih spesifik membahas bakteri yang berbentuk basil, basil (bacillus) adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder dan variasinya terdiri dari : diplobacillus, sterptobacillus. Perwarnaan gram Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi

22 menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. (Manurung, 2010). Pertama kali teknik pewarnaan ini ditemukan oleh ahli bakteriologi Denmark Christian Gram pada tahun Menurut Denmark Christian Gram perbedaan dari kedua grup bakteri tersebut disebabkan oleh perbedaan dalam lapisan-lapisan dinding selnya. Organisme yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap atau ungu), disebut Gram positif. Sedangkan organisme yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai pewarna tandingan (safranin) sehingga sel-sel tampak merah muda disebut Gram negatif. Dalam pewarnaan Gram diperlukan empat jenis larutan yaitu larutan zat warna basa, mordant, pencuci zat warna, dan satu zat warna lainnya (counterstain) yang berbeda dari zat warna yang pertama. Mordant adalah suatu zat yang dapat menaikkan pengikatan antara sel dengan zat warna. Beberapa contoh mordant misalnya asam, basa, garam metal dan yodium. Dengan adanya mordant zat warna akan lebih sukar dicuci. Pencuci zat warna digunakan untuk menghilangkan zat warna dari sel bakteri. Beberapa sel bakteri lebih mudah melepaskan zat warna dari pada sel-sel lainnya. Dalam pewarnaan Gram dan pewarnaan diferensial lainnya, perbedaan dari bakteri disebabkan oleh perbedaan dalam kecepatan melepaskan zat warna oleh sel. Zat warna kedua yang digunakan setelah sel dicuci dengan larutan pencuci disebut counterstain yang berbeda warnanya dari zat warna pertama. Selsel yang tidak dapat segera melepaskan zat warna setelah pencucian akan tetap berwarna seperti zat warna pertama, sedangkan sel-sel yang dapat segera melepaskan zat warna setelah pencucian akan mengikat zat warna kedua. Dalam pewarnaan Gram, mula-mula sel bakteri diwarnai dengan zat warna basa yaitu kristal violet, diikuti perlakuan menggunakan suatu mordant yaitu larutan yodium. Sel kemudian dicuci dengan alkohol untuk menghilangkan kristal violet. Setelah dicuci dengan air, kemudian diwarnai dengan counterstain yaitu safranin.

23 Sel-sel yang tidak dapat melepaskan warna dan akan tetap berwarna seperti warna kristal violet yaitu biru-ungu disebut bakteri Gram positif, sedang sel-sel yang dapat melepaskan kristal violet dan mengikat safranin sehingga berwarna merah-merah muda disebut bakteri Gram negatif. Pewarnaan yang telah dilakukan Penwarnaan diferensial mengunakan dua warna yang kontras untuk membedakan antara jenis organisme yang berbeda. Pada percobaan pewarnaan bakteri ini menggunakan empat bahan yaitu crystal violet, yodium, alkohol dan safranin. 1.Crystal Violet Berwarna ungu. Merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna mikroorganisme target. Crystal Violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam, dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (Ungu). 2. Yodium Merupakan pewarna Mordant, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target. Pemberian yodium pada pewarnaan gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. 3. Alkohol Solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan : - Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu - Bakteri menjadi tidak berwarna 4. Safranin

24 Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, memberikan warna pada mikroorganisme non target. Perlakuan Penambahan violet pada bakteri, Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri. Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan pewarna Mordant, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pewarnaan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Lugol yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat. Proses fiksasi juga bertujuan supaya bakteri benar-benar melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri berupa tetesan sampel tidak akan terhapus

25 apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api. Meneteskan 1 tetes alkohol 95% di atas gelas benda yang kemudian didiamkan selama 30 detik, lalu membilas gelas benda tersebut dengan aquades hingga warnanya hilang. Pemberian Etanol pada pewarnaan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian Etanol 95% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pengamatan yang dilakukan dengan menggunakan mikroskop tampak mikoorganisme dari sampel yoguart dengan pengenceran 10-5 berbentuk basil dengan jenis gram negatif. Dimana bakteri gram negatif adalah bakteri yang kehilangan kompleks ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol, namun kemudian terwarnai dengan pewara tandingan, yaitu safranin, sehingga sel-sel tampak berwarna merah muda pada akhir pewarnaan. Pengamatan kedua yaitu pada sampel yoguart juga dengan pengenceran 10-5 didapat bakteri basil dengan jenis gram positif. Bakteri gram positif adalah bakteri yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai akhir prosedur dan sel bakteri berwarna biru gelap atau ungu.

26 5.5 Pembahasan Menurut Jagad Nama : Jagad Tahari F Tanggal Praktikum : 13 Oktober 2015 Nim : Tanggal Laporan : 20 Oktober 2015 Pewarnaan Bakteri Mikroorganisme yang hidup dan ada di alam ini tentu mempunyai morfologi, struktur dan sifat yang khas tersendiri, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak mempunyai warna di struktur badannya dan bahkan kontras dengan air. Salah satu cara untuk dapat meneliti dan mengamati bentuk sel bakteri ini adalah dengan metode pewarnaan atau pengecatan, sehingga dengan begitu sel bakteri dapat dilihat dan diamati dengan mudah. Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Allasan inillah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur seperti spora, flagel dan bahan inklusi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. ( Entjang, 2003) Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat diihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian penelitian mikrobiologi. ( Rizki, 2008 ) Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya. Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pada umumnya antara lain dengan menggunakan kristal violet, metylen blue, fuchsin dan safranin. ( lay, 1994 )

27 Pewarnaan pada sel bakteri menggunakan satu zat warna seperti kristal violet, metylen blue, fuchsin dan safranin ini disebut pewarnaan sederhana. Dengan metode pewarnaan sederhana ini kita dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel sel bakteri. Berbagai macam bentuk bakteri seperti bakteri bentuk kokus, basil dan spirilum atau masih banyak lagi dapat terlihat dengan metode pewarnaan sederhana ini. Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya terdiri dari suatu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. ( Dwidjoseputro, 1998 ) Selain dengan cara metode pewarnaan sederhana, pengamatan bakteri juga dapat dilakukan dengan menggunakan metode pewarnaan gram dan pewarnaan negatif Pewarnaan Gram Pewarnaan bakteri dengan metode ini dilakukan dengan dua cara. Yaitu dengan pewarnaan negatif dan positif. Pewarnaan gram negatif adalah pewarnaan pada sel bakteri untuk mengetahui apakah bakteri yang di uji mempertahankan warna metyl ungu nya atau tidak. Bakteri yang tidak mempertahankan warna metyl ungu ini atau disebut bakteru gram negatif ini akan berubah menjadi berwarna merah muda setelah dicuci dengan alkohol atau etanol. Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida ( lipid ) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin alan berwarna merah. ( Fitria, 2009 ) Sedangkan pewarnaan gram posotif adalah pewarnaan pada sel bakteri dengan tujuan untuk mengetahui apakah sel bakteri yang diuji mempunyai sifat

28 mempertahankan warna metyl ungu nya atau tidak. Bakteri gram positif akan tetap berwarna ungu gelap walaupun sudah dicuci dengan alkohol atau etanol. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori pori dinding sel menyempit akibat dekolorasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. ( Fitria, 2009 ) Pewarnaan negatif Pewarnaan negatif adalah bukan pewarnaan pada sel bakteri, melainkan pewarnaan pada latar belakang bakteri. Pewarnaan dengan metode ini adalah latar belakang atau lingkungan bakteri akan menjadi gelap saat diamati dan bakteri tetap transparan tidak berwarna. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel bakteri. Pewarnaan negatif ini biasanya menggunakan nigrosin tau tinta cina. Namun tinta cina ini sudah sukar didapatkan. Jadi, pada praktikum kali ini kami menggunakan tinta untuk spidol papan tulis. 5.6 Pembahasan Menurut Kemal Nama : Kemal Ahmad Riva i Tanggal Praktikum : 13 Oktober 2015 Nim : Tanggal Laporan : 20 Oktober 2015 Pewarnaan Bakteri -Tinjauan Teori Pewarnaan Gram ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli histologik Christian Gram (1884). Dengan pewarnaan Gram, bakteri-bakteri dapat dibagi atas 2 golongan yaitu Gram positif dan Gram negatif. Gram positif warnanya violet (ungu) karena mengikat zat warna utama kristal violet. Sedangkan Gram negatif berwarna merah jambu karena melepaskan zat warna utama dan menangkap zat warna penutup fuchsin. Prinsip atau pokok-pokok pewarnaan Gram meliputi 4 tingkatan yaitu :

29 1. Pewarnaan dengan zat warna utama (kristal gentian violet yang warnanya violet). 2. Merekatkan (mengintensifkan) dengan suatu larutan mordant, yaitu larutan lugol. 3. Menambahkan zat decolorisasi (bahan peluntur) misalnya alkohol atau alkohol-asam. 4. Pemberian zat penutup (counter stain), misalnya : larutan fuchsin, safranin, dll. (Hadioetomo,1993) Pewarnaan garam adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuan Denmark Hans Cristian Gram ( ) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri klebsiella pneumoniae. Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Iud, 2008). -Prosedur kerja Pewarnaan Positiv

30 Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Setelah di fiksasi bersihkan object glass dengan kapas tulislah kode atau nama bakteri pada sudut object glass, bila menggunakan biakan cair pindahkan setetes biakan dengan pipet tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. biakan dikocok terlebih dahulu. Jika digunakan biakan padat, biakan dipindahkan dengan jarum inokulum, satu ulasan saja kemudian diberi akuades dan disebarkan supaya sel merata. Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen (lewatkan di atas api 2-3 kali) Setelah kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna (dapat digunakan Methylen blue, Safranin, Crystal Violet) dan tunggu kurang lebih 30 detik. Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas tissue. Amati dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10). Pewarnaan Negatif Pewarnaan ini bertujuan untuk mengetahui morfologi bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan teknik sederhana. Sesuai namanya, yang diwarnai pada teknik ini adalah latar belakang suspensi preparat menggunakan tinta cina, karna tinta cinanya tidak ada maka memakai tinta spiol sehingga mikroorganisme terlihat transparan diantara medan yang gelap. Tujuannya adalah melihat morfologi bakteri. Ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah satu object glass. Biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi, lalu dicampurkan. Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri. Biarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di atas api. Amati dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10). Pewarnaan Gram Pewarnaan digunakan untuk mengetahui morfologi dan identifikasi jenis bakteri. Pewarna yang digunakan dua atau lebih. Pertama tama buat preparat ulas yang telah difiksasi dari bakteri gram positif dan gram negatif. Teteskan kristal violet sebagai pewarna utama pada kedua preparat

31 (semua ulasan terwarnai dan tunggu selama 1 menit). Cuci dengan akuades mengalir. Teteskan mordat (lugol, iodine) lalu tunggu 1 menit). Cuci dengan akuades mengalir. Beri larutan pemucat (ethanol 95%) setetes demi setetes hingga etanol yang jatuh berwarna jernih. Cuci dengan akuades mengalir. Teteskan counterstain dan tunggu selama 45 detik. Cuci dengan akuades mengalir. Keringkan preparat dengan kertas tissue yang ditempelkan di sisi ulasan (jangan sampai merusak ulasan) lalu biarkan mengering di udara. Amati dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10). -Hasil pengamatan Penambahan violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri. Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian

32 alkohol memungkinkan hilang dari sel. Lugol yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat. Selanjutnya, 1 tetes etanol 95% diteteskan di atas objek glass tersebut kemudian setelah itu, kaca objek dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan aquades warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan etanol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan etanol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu. Pemberian pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.

33 Setiap akhir pemberian pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca objek dengan menggunakan air. Pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing pewarnaan, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif, dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

34 BAB VII KESIMPULAN 7.1 Kesimpulan Menurut Susan Setelah melakukan praktikum ini kita dapat mengetahui dan memahami prosedur pewarnaan gram dan pengelompokan bakteri. Basillus merupakan bakteri gram positif, dikarenakan pada bakteri ini mengandung banyak peptidogligan sehingga mudah berikatan dengan kristal ungu. Sehingga pada saat sampai pewarnaan terakhir bakteri berwarna biru atau ungu. 7.2 Kesimpulan Menurut Arisya Pewarnaan bakteri merupakan suatu metode untuk mengetahui bentuk dan struktur bakteri. Pewarnaan Sederhana terbagi menjadi dua yakni pewarnaan positif dan pewarnaan negatif. Dalam pewarnaan sederhana dapat diketahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarnaan gram bertujuan untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel bakteri. Bakteri gram positif tetap mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan gram karena memiliki pepidoglikan yang tebal. Sedangkan bakteri gram negatif tidak mempertahannkan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan gram sehingga ketika ditetesi safranin menjadi berwarna merah.

35 7.3 Kesimpulan Menurut Ika Dalam praktikum kali ini kita dapat melakukan teknik pewarnaan positif, pewarnaan negatif dan pewarnaan gram untuk mengidentifikasi bakteri yang kita amati. 1. Dengan dilakukan pewarnaan bakteri ini kita dapat mengetahui dengan jelas bentuk bakteri yang kita amati. 2. Pewarnaan positif adalah teknik pewarnaan bakteri yang paling sederhana karena hanya menggunakan satu zat warna dan bertujuan untuk melihat bentuk sel bakteri. 3. Pewarnaan negarif adalah teknik pewarnaan bakteri dan mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap bisa dengan negrosin atau jika tidak ada bisa juga dengan tinta. Tujuannya untuk melihat bentuk dan ukuran bakteri yang transparan. 4. Pada pewarnaan gram (diferensial) akan mengetahui apakah termasuk gram positif atau negatif. Apabila gram positif bakteri akan berwarna biru/ungu dan apabila gram negatif akan berwarna merah. 5. Kita harus disiplin pada langkah kerja dan aturan serta petunjuk agar menghindarkan kesalahan yang terjadi seperti praktikum sekarang. 7.4 Kesimpulan Menurut Anisa 1. Bakteri dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). 2. Zat warna yang digunakan pada pewarnaan gram meliputi crystal violet, yodium, alkohol dan safranin. Teknik pewarnaan tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. 3. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah, sedangkan yang positif berwarna ungu. Bakteri yang didapat berdasarkan hasil praktikum, yaitu laktobasilus dan sterptokokus dengan jenis gram negatif dan monococcus dengan jenis gram positif. 7.5 Kesimpulan Menurut Jagad

36 Dari percobaan pewarnaan yang dillakukan dapat disimpulkan bahwa bakteri dapat diamati dan diteliti setelah selnya diwarnai atau lingkungannya diwarnai. Fiksasi dan pelunturan warna dan substrat adalah beberapa faktor yang mempengaruhi proses pewarnaan bakteri ini. Perbedaan hasil dari gram negatid dan positif adalah pada warna sel bakterinya. Pewarnaan dengan motede negatif adalah lingkungannya yang menjadi gelap dan bakteri tetap transparan atau tembus pandang. 7.6 Kesimpulan Menurut Kemal Dapat disimpulkan bahwa teknik pewarnaan bakteri dapat dibedakan melalui teknik pewarnaannya, ada teknik positif, negative, dan gram. Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram meliputi crystal violet, etanol, aquades, tinta dan safranin. Teknik pewarnaan tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah, sedangkan yang positif berwarna ungu. Bakteri yang didapat berdasarkan hasil praktikum, yaitu dengan jenis gram negatif dan dengan jenis gram positif.

37

38 BAB VIII DAFTAR PUSTAKA 8.1 Daftar Pustaka Susan Daftar Pustaka Arisya Hadioetomo, R. S Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia. Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia Melia, dan T.M. Sudiro Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1. Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri. 8.3 Daftar Pustaka Ika Subandi H.M Mikrobiologi. PT REMAJA ROSDAKARYA: Bandung Dwidjoseputro, D., Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan: Malang Entjang I, Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan. PT. Citra Aditya Bakti: Jakarta

39 8.4 Daftar Pustaka Anisa Awetz, Melnick, Adelberg Mikrobiologi KedokteranEdisi 23. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Dwidjoseputro, D., Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan:Malang Entjang I, 2003, Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan. Jakarta: PT. Citra Aditya Bakti. Schlegel, Hans Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyakarta: Gajah Mada University Press. 8.5 Daftar Pustaka Jagad Dwijdoseputro Dasar Dasar Mikrobiologi. Jakarta : PT Gramedia Fitria, Bayu Pewarnaan Gram ( gram positif dan Gram Negatif ). Fajriana, Rizki Mikrobilogi Umum Pewarnaan Gram. Lay, Bibiana. W Mikrobilogi Dasar di Laboratorium. Jakarta : Rajawali 8.6 Daftar Pustaka Kemal Madigan, M.T, 2003, Brock Biology of Microorganism, Pearson Education : inc. United Pelczar, M. J., Chan, E.C.S, 2007, Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga : Jakarta

40 BAB IX DOKUMENTASI

41

42