KUMPULAN LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI Disusun Oleh: Nama : Anatasia NIM : 125040200111140 Kelompok : Selasa 09.15-11.00 Asisten : Nimas Ayu UNIVERSITAS BRAWIJAYA FAKULTAS PERTANIAN PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI MALANG 2013
LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI ISOLASI DNA Disusun Oleh: Nama : Anatasia NIM : 125040200111140 Kelompok : Selasa 09.15-11.00 Asisten : Nimas Ayu UNIVERSITAS BRAWIJAYA FAKULTAS PERTANIAN PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI MALANG 2013
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang DNA dapat diisolasi dari berbagai sel atau jaringan baik hewan, tumbuhan maupun manusia.isolasi DNA merupakan teknik awal dalam pemanfaatan DNA untuk berbagai tujuan.sebenarnya telah ada metode standar dalam mengisolasi DNA, misalnya teknik atau metode yang dikemukakan oleh Sambrook (1989).Isolasi DNA dari sel maupun jaringan eukariotik, misalnya dari jaringan tumbuhan maupun hewan dilakukan melalui tahap penghancuran sel (lisis), penghilangan RNA dan protein serta pemurnian DNA. isolasi DNA ini membutuhkan alat-alat canggih dan bahan-bahan yang cukup mahal, misalnya EDTA ( Etilendiamin tetra asetat ) yang berfungsi sebagai merusak sel dengan cara mengikat ion Magnesium yang berfungsi mempertahankan integritas sel, SDS ( Sodium dodesil sulfat ) yang dapat melarutkan membrane sel, mendenaturasi protein, enzim proteinase K yang mendegradasi protein, RNAse mendegradasi RNA serta NaCl dan chloroform untuk memurnikan DNA. Modifikasi teknik isolasi DNA telah dilakukan pada beberapa laboratorium, misalnya pada takaran bahan-bahan yang digunakan atau penguraian/ penggantian jenis bahan yang digunakan sesuai denga sel/ jaringan sumber DNA.Teknik/ metode isolasi DNA yang sangat sederhana adalah metode Kitchen Preparation. Metode isolasi ini
memanfaatkan bahan-bahan yang biasanya digunakan ibu rumah tangga yaitu sabun cuci (cair, bubuk atau krim) untuk menggantikan bahan utama yang berfungsi untuk melisis sel, ekstrak buah nanas sebagai sumber enzim protease serta garam dapur. 1.2 Tujuan 1. Untuk mengetahui definisi isolasi DNA 2. Untuk mengetahui macam metode isolasi DNA 3. Untuk mengetahui tahap isolasi DNA 4. Untuk mengetahui manfaat isolasi DNA 1.3 Manfaat 1. Mengetahui definisi isolasi DNA 2. Mengetahui macam metode isolasi DNA 3. Mengetahui tahap isolasi DNA 4. Mengetahui manfaat isolasi DNA
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Definisi Isolasi DNA Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA yang bertujuan untuk mendapatkan DNA murni yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa. (Aditia, 2010) Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besarakan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.(jusuf, M, 2001) DNA isolation is a routine procedure to collect DNA for subsequent molecular or forensic analysis. (Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA untuk analisis molekuler atau forensik berikutnya)(doyle, 1987) 2.2 Macam Metode Isolasi DNA Isolasi DNA menggunakan metode isolasi Karsinah et al.(2002) yang telah dimodifikasi dengan langkah kerja sebagai berikut : 1. Tabung eppendorf diisi dengan 1 ml buffer ekstraksi CTAB (CTAB 3%, NaCl 1,4 M, EDTA 0,002M dan Tris-HCl 0,1M) dan 5 μl mercaptoethanol.
2. Daun Bawang merah disterilisasi dengan alkohol dan ditimbang 0,5 gram. 3. 0,5 gram daun bawang merah digerus dalam mortar dengan bantuan nitrogen cair dan ditambah PVP 10 mg, kemudian dimasukkan kedalam eppendorf yang sudah berisi 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 5 μl mercaptoethanol. Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen. 4. Ekstrak daun diinkubasi dalam suhu 65ºC selama 30 menit sambil dibolak-balik tiap 10 menit. Kemudian ditambahkan 700 μl Chloroform : Isoamylalcohol/CHISAM (24:1). Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen. 5. Ekstrak daun kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm. Supernatan dimasukkan tabung baru dan ditambahkan 700 μl CHISAM. 6. Larutan supernatan dan CHISAM disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm. Fase atas dimasukkan tabung baru ditambah isopropanol dingin. Larutan tersebut dibolak-balik perlahan hingga tampak benang-benang putih dalam larutan. Larutan diinkubasi dalam freezer selama 30 menit. 7. Setelah diinkubasi, larutan disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm setelah itu supernatan dibuang dengan hati-hati agar endapan DNA pellet tidak ikut terbuang. 8. Endapan DNA pellet dicuci dengan buffer pencuci dengan cara menambahkan 200 μl buffer pencuci ke dalam tube, kemudian cairan di
buang. Pencucian ini dilakukan 2 kali. Setelah itu endapan DNA pellet dikering anginkan. 9. Endapan DNA kemudian diresuspensi dengan 500 μl buffer TE lalu ditambah 1 μl RNAse. 10. Larutan DNA yang sudah ditambah RNAse diinkubasi selama 30 menit pada Suhu 37ºC. 11. Setelah larutan DNA diinkubasi, ditambahkan 1 ml ethanol absolute dingin dan dibolak-balik perlahan. 12. Larutan DNA lalu diinkubasi pada freezer selama 30 menit. 13. Setelah inkubasi selesai kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 6000 rpm. Pelet kemudian dikering anginkan. 14. Pelet diresuspensi dengan 100 μl buffer TE dan disimpan dalam lemari es. (Puspita, 2010) 2.3 Tahap Isolasi DNA a. Perusakan dinding sel Penggunaan nitrogen cair b. Lisis membran sel Penggunaan detergen kationik (CTAB) c. Pemurnian Beberapa kontaminan seperti senyawa sekunder (fenol) polisakarida, RNA,dan protein d. Presipitasi Penggumpalan DNA menggunakan isopropanol dingin (Puspita, 2010) 2.4 Manfaat Isolasi DNA Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.
Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR (Puspita, 2010).
BAB III METODOLOGI 3.1 Alat dan Bahan (beserta fungsi) Alat 1. Sarung latex : untuk melindungi tangan saat praktikum 2. Timbangan : untuk menimbang bahan 3. Mangkuk : wadah tempat meletakan bahan 4. Mortar : wadah menghaluskan bahan 5. Pestle : alat untuk menghaluskan bahan 6. Tube 1,5ml : wadah/tabung unutk pengamatan 7. Pipet Pasteur : untuk mengambil bahan cair 8. Mikropipet : untuk mengambil bahan cair 9. Vortex : untuk menghomogenkan campuran 10. Inkubator(freezer) : untuk menginkubasi bahan pengamatan 11. Sentrifuge : untuk menghomogenkan larutan Bahan 1. Daun sawi hijau, daun belimbing, dan dun bayam : sebagai bahan praktikum 2. Nitrogen cair : membantu proses penggerusan 3. PVP : memisahkan fase organic & fenol 4. CTAB : melisis membran sel
5. CHISAM (chloroform isoamil alcohol) : untuk mengurangi kontaminasi protein 6. Betha-Mertacaptoethanol : menghilangkan kontaminan polisakarida 7. Isopropanol dingin: untuk presipitasi 8. Buffer pencuci : untuk mencuci DNA 9. TE buffer : sebagai penyangga 10. Enzim RNAse : mengurangi kontaminan RNA 3.2 Langkah Kerja +buffer ekstrasi CTAB 1ml Timbang daun 0,1gr +N 2 cair & PVP 0,1-198 0 C β-mercoptoetanol5µl inkubasi 65 0 C, 30 500µl chisam Klorofor : isoamialkohol 24 : 1 Sentrifuge 6-8x10 3 RPm 10 Ambil super natan Sentrifuge 6-8x10 3 RPm 10 +chisam 0,5 Ambil super natan
+Isopropanol 1x volume (diputar pelan-pelan) Inkubasi frezer 15 Sentrifuge (13000 rpm) Buffer pencuci 2x(500 µl) Resuspensi TE buffer 200 µl RNAse 1 µl Inkubasi 65 0 C 10 + etanol dingin Simpan di frezer
3.3 Analisa Perlakuan Pertama tama, yang merupakan langkah awal praktikum adalah menimbang daun 0,1 gr, kemudian gerus tambahkan nitrogen cair dan PVP untuk memudahkan penggerusan. Kemudian tambahkan buffer CTAB 1 ml, fungsinya untuk melisis membran sel. Setelah itu tambahkan 500 µl CHISAM untuk mengurangi kontaminan protein. Tambahkan Bethamercaptoetanol 5 µl, fungsinya untuk menghilangkan kontaminasi polisakarida. Inkubasi 65 0 C selama 10. Kemudian sentrifuge 13.000 rpm selama 5 menit. Ambil supernatan, tambah 0,5 ml CHISAM. Kemudian sentrifuge 13.000 rpm, 5 menit. Ambil supernatannya tambahkan isopropanol dingin 1*volume, inkubasi freezer 10 menit. Sentrifuse 10000 rpm, 5 menit. Ambil pellet dan buang supernatan. Tambah 500 µl buffer pencuci 2x (500 ml) kering anginkan dan balik ditas tissue. Resuspensi 50-100 µl buffer TE. Kemudian tambah 1 µl RNAse, inkubasi 65 o C, 10 menit. Tambahkan etanol dingin. Simpan dalam frezeer.
4.1 Hasil DNA BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN HASIL Sawi hijau belimbing bayam 4.2 Pembahasan Zubaidah (2004) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi
pada setiap jenis maupun bagian tanaman dapat menimbulkan masalah berbeda, antara lain karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA dan juga mempengaruhi enzimenzim seperti polimerase, ligase, endonuklease restriksi, atau enzim untuk kegiatan molekuler lain yang dapat menyebabkan DNA tidak dapat digunakan untuk aplikasi penelitian. Proses ekstraksi DNA dari sel adalah langkah pertama dalam prosedur pemisahan DNA dari substansi lain yang tidak dionginkan dengansangat hati-hati sehingga tidak menyebabkan kerusakan DNA. Dan menurut (Subandiyah 2006) ekstraksi DNA menggunakan nitrogen cair untuk melisis dinding sel dapat mengeluarkan semua isi sel yang kemudian ditampung dalam larutan penyangga yang berisi Tris HCl dan EDTA. Dinding sel juga dapat dipecahkan dengan penggerusan menggunakan bufer ekstraksi diikuti dengan penghangatan pada suhu 65 C. Detergen seperti sodium dodecil sulfat (SDS), sarkosil, dan CTAB dapat digunakan untuk proses lisis.
BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan Proses panjang yang dilakukan adalah untuk memisahkan DNA murni dari segala macam seperti protein dan senyawa lainnya. Dan pada pratikum kali ini hanya terlihat sedikit DNA murni nya pada percobaan kami, hasil ini dipengaruhi oleh berbagai hal seperti bahan-bahan yang kurang steril, bahannya hanya mengandung sedikit DNA murni,atau dalam proses pengerjaan yang kurang teliti namun dari pratikum kali ini dapat dimengerti bagaimana cara untuk mendapatkan DNA murni. 5.2 Saran 5.2.1 Kritik dan saran untuk praktikum tahun depan sebaiknya praktikum bioteknologi pertanian lebih di perhatikan lagi, di buatkan jadwaljadwal yang sekiranya cukup untuk melakukan praktikum untuk semua materi, tidak praktikum cuman 2 kali, tapi langsung UAP. Untuk asisten Terimakasih untuk bimbingannya, mohon maaf apabila kami kurang mengikuti arahan dengan baik semoga dapat bermanfaat terimakasih.
DAFTAR PUSTAKA Aditia.2010.IsolasiDNA.http://sharkestaditia.blogspot.co m /2010/03/isolasiDNA.html Diakses 01 Desember 2012 Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 19: 11-15. Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang. Jusuf M. 2001. Genetika 1 Struktur dan ekspresi Gen. Bogor : Sagung Seto. Puspita, 2010. Tahapan Isolasi DNA. http://puspitt.multiply.com /journal/item/14/isolasi-dna? &show_interstitia l=1 &u=%2fjournal%2fitem. Diakses tanggal 01 Desemb- er 2012 Subandiyah, S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi Patogen Tumbuhan. Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Pelatihan dan Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR. Malang. hlm. 43-50 Zubaidah, 2004.Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan DNA Baru pada Bakteri Radioresisten Deinococcus radiodurans.prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknik Nuklir, Bandung, Juni 2004.