TEKNIK REKAYASA GENETIKA 1. Jelaskan pengertian mengenai DNA sekuensing! Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik penentuan urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens DNA, yang merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup. Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui. Teknik ini digunakan dalam riset dasar biologi maupun berbagai bidang terapan seperti kedokteran, bioteknologi, forensik, dan antropologi. Prinsip Dasar DNA Sequencing DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing. Gambar 1. Proses Cycle Sequencing Jadi yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah: Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua (sepasang) seperti PCR ddntps (dideoxy-nucleotide Triphosphate) adalah modifikasi dari dntps dengan menghilangkan gugus 3 -OH pada ribosa.
Gambar 2. Struktur molekul dntp dan ddntp Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan dari template dengan menambahkan dntp-dntp sesuai dengan urutan pada DNA cetakannya. Nah, jika yang menempel adalah ddntp, maka otomatis proses polimerisasi akan terhenti karena ddntp tidak memiliki gugus 3 -OH yang seharusnya bereaksi dengan gugus 5 -fosfat dntp berikutnya membentuk ikatan phosfodiester. Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa. Dua metode yang sering digunakan dalam sequencing DNA adalah sebagai berikut : 1) Metode Sanger Metode yang pertama kali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1975, yaitu dengan melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah yang masingmasing berisi semua pereaksi yang dibutuhkan. Khusus untuk ddntp, yang ditambahkan hanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan adalah ddatp, G jika ddgtp, C jika ddctp dan T jika ddttp. Setelah reaksi cycle sequencing selesai, keempat hasil reaksi tersebut dilarikan pada gel electrophoresis sehingga fragmen-fragmen yang dihasilkan dapat terpisah. Urutan basa DNA dapat ditentukan dengan mengurutkan fragmen yang muncul dimulai dari yang paling bawah (paling pendek). Fragmen DNA dapat divisualisasi karena primer yang digunakan dilabel dengan radioaktif atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan primer yang dilabel melainkan dntp. Gambar 3. Prinsip Sanger Method dengan primer labelling
Dye Primers dengan Label Berbeda Agar proses pemisahan fragmen pada gel electrophoresis bisa digabung dalam 1 lajur saja, digunakanlah pelabel fluorescent dengan 4 warna berbeda untuk setiap reaksi cycle sequencing. Gambar 4. Prinsip Sanger Method dengan primer fluorescent labelling yang berbeda-beda Dye-Terminators Sequencing Cara yang lebih simple akhirnya ditemukan juga. Para ilmuwan cerdas menemukan cara untuk melabel ddntp dengan 4 label fluorescent yang berbeda-beda untuk ddatp, ddctp, ddgtp dan ddttp. Dengan demikian, reaksi cycle sequencing dapat dilakukan dalam 1 tabung reaksi dan dirun pada satu lajur gel electrophoresis saja. Sangat simple dan cepat. Gambar 5. Prinsip Sanger Method dengan dye dideoxy terminator Dengan ditemukannya mesin Automated Capillary Sequencer, proses pemisahan fragmen dan pembacaan urutan basa DNA dapat dilakukan dengan lebih simple, cepat dan terotomatisasi. Jumlah kapiler pada mesin ini bervariasi, mulai dari
1, 4, 16, 48 hingga 96 kapiler dalam satu mesin, semakin banyak jumlah kapiler, semakin banyak pula jumlah sampel DNA yang bisa ditentukan urutan basanya. Hasil pembacaan mesin sequencer disebut electropherogram, yaitu peak-peak berwarna yang menunjukkan urutan basa DNA-nya. Gambar 6. Contoh Electropherogram Teknik DNA Sequencing yang berbasis fragment analysis saat ini tidak hanya digunakan untuk menentukan urutan basa-basa DNA semata, tapi bisa dikembangkan untuk berbagai aplikasi, seperti penentuan SNP (Single Nucleotide Polymorphism), analisa keragaman genetik seperti DNA Microsatellite dan AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), community analysis seperti trflp (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) dan segudang aplikasi lainnya. Banyaknya aplikasi DNA Sequencing kapiler ini menunjukkan bahwa metode ini meskipun kini tergolong lambat setelah ditemukannya high-throughput sequencing akan tetap jadi primadona dan andalan para life-scientist di seluruh dunia. Dan tak heran pula jika Frederick Sanger menerima hadiah Nobel bidang kimia untuk kedua kalinya di tahun 1980 atas penemuannya ini. 2) Metode Maxam Gilbert Metode degradasi kimia (chemical degradation method), yang biasanya dikenal dengan metode Maxam-Gilbert, karena metode ini dikembangkan oleh Maxam dan Gilbert pada tahun 1977. Sekuen molekul DNA untai ganda ditentukan dengan perlakuan menggunakan bahan kimia yang memotong molekul pada posisi nukleotida tertentu. Fragmen DNA yang akan disekuens dilabel salah satu ujungnya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 3. Molekul DNA terlebih dahulu dipotongpotong secara parsial menggunakan piperidin. Ikatan antara fosfat dan gula dipotong dengan piperidin (modifikasi waktu pemotongan dan konsentrasi piperidin akan menghasilkan potongan dengan berbagai ukuran). Basa dimodifikasi secara spesifik.
Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan menghasilkan fragmenfragmen DNA yang bermacam-macam ukurannya. Selanjutnya, basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G, hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C. Metode degradasi kimia juga memiliki kelemahan lain karena menggunakan bahan kimia yang beracun dan berbahaya bagi kesehatan peneliti yang menggunakan metode tersebut. Banyak perbedaan pada kedua metode tersebut, yaitu pada metode terminasi rantai menggunakan sekuens DNA tunggal identik, disintesis secara enzimatik pada rantai polinukleotida yang komplementer, terminasi rantai ini menggunakan nukleotida yang spesifik, pemisahan molekul DNA tunggal biasanya menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid. Metode ini juga menggunakan primer yang ditempelkan pada posisi yang sama pada setiap molekul dan menggunakan DNA polimerase serta keempat deoksi ribosa trifosfat (dntps datp, dctp, dgtp dan dttp) sebagai substrat. Dideoksinukleotida (ddntp) juga digunakan dalam metode ini, dimana ddntp dalam jumlah yang lebih sedikit daripada dntp. Berbeda dengan metode terminasi rantai, metode degradasi kimia tidak popular digunakan. Metode degradasi kimia ini menggunakan bahan kimia, sekuens untai ganda yang digunakan dalam metode ini, salah satu fragmen DNA yang akan digunakan dilabeli dengan menggunakan radioaktif, tidak memerlukan primer dan DNA polymerase dalam sekuens DNA.
2. Jelaskan pengertian hibridisasi! Gambar 7. Prinsip Kerja Metode Maxam - Gilbert Hibridisasi merupakan proses identifikasi gen gen hasil analisis RFLP dengan menggunakan restriksi enzim yang sesuai dan diidentifikasikan dengan fragmen gen target yang spesifik yang telah diberi label baik radioaktif maupun non radioaktif. Hibridisasi juga dapat diartikan sebagai pembentukan ikatan dupleks stabil antara dua rangkaian nukleotida yang saling komplementer melalui perpasangan basa N. Hibridisasi dapat menunjukkan suatu keseragaman sekuens. 3. Jelaskan prinsip kerja southern blot! Southern blot adalah metode yang digunakan untuk memeriksa keberadaan urutan DNA dalam sampel DNA. Metode ini dinamai sesuai nama penemunya yaitu ahli biologi Inggris Edwin Southern.Teknik ini mentransfer DNA ke kertas NC dengan menggunakan prosedur aliran pelarut. Fragmen DNA yang spesifik dideteksi dengan menggunakan pelacak. Pelacak biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik radionukletida. Prosedur untuk teknik Southern blot adalah seperti yang dijelaskan di bawah ini : 1. restriksi endonuklease digunakan untuk memotong untai DNA berat molekul besar menjadi fragmen yang lebih kecil. kemudian dielektroforesis pada gel agarosa untuk memisahkan berdasarkan ukuran. 2. Jika fragmen DNA lebih besar dari 15 kb, maka sebelum blotting, gel dapat diberi perlakuan asam, seperti HCl encer, yang depurinates fragmen DNA, melanggar DNA menjadi potongan-potongan yang lebih kecil, sehingga memungkinkan transfer lebih efisien dari gel ke membran. 3. Jika cara transfer alkali yang digunakan, gel DNA ditempatkan ke dalam larutan alkali ( mengandung NaOH ) untuk denaturasi DNA beruntai ganda. Denaturasi dalam alkali
lingkungan dapat meningkatkan pengikatan DNA dari membran bermuatan negatif ke bermuatan positif, memisahkannya ke dalam untai DNA tunggal untuk kemudian hibridisasi ke probe dan menghancurkan setiap RNA residu yang mungkin masih ada dalam DNA. 4. Selembar nitroselulosa ( atau nilon ) membran ditempatkan di atas ( atau di bawah, tergantung pada arah transfer ) gel. Tekanan diterapkan secara merata ke gel (baik menggunakan hisap, atau dengan menempatkan tumpukan kertas yang berat di atas membran dan gel ), untuk memastikan baik dan bahkan kontak antara gel dan membran. Transfer kapiler penyangga dari daerah potensi air yang tinggi ke wilayah potensi air rendah (biasanya menyaring jaringan kertas dan kertas ) digunakan untuk memindahkan DNA dari gel ke membran, interaksi pertukaran ion yang mengikat DNA pada membran bertanggung jawab atas DNA dan muatan positif dari membran. 5. membran tersebut kemudian dipanggang dalam vakum atau oven biasa pada 80 C selama 2 jam atau terkena radiasi ultraviolet ( membran nilon ) untuk secara permanen untuk melampirkan DNA yang ditransfer ke membran. 6. membran tersebut kemudian terkena hibridisasi probe- fragmen DNA tunggal dengan urutan tertentu yang kehadirannya di DNA target akan ditentukan. Probe DNA di label sehingga dapat dideteksi, biasanya dengan memasukkan radioaktivitas atau penandaan molekul dengan pewarna fluorescent atau kromogenik. 7. Setelah hibridisasi, kelebihan probe dicuci dari membran dan pola hibridisasi divisualisasikan pada film X - ray oleh autoradiografi dalam kasus radioaktif atau probe neon, atau dengan pengembangan warna pada membran jika di deteksi kromogenik. Gambar 8. Prinsip Kerja Southern Blot Hibridisasi probe pada sebuah fragmen DNA tertentu pada filter membran menunjukkan bahwa inifragmen mengandung urutan DNA yang melengkapi probe. Langkah transfer DNA dari gel elektroforesis untuk izin membran mudah mengikat berlabel hibridisasi probe untuk DNA ukuran - difraksinasi. Southern blot dilakukan dengan pembatasan DNA genomik enzim - dicerna dapat digunakan untuk menentukan jumlah urutan ( misalnya, gen salinan ) dalam genom. Sebuah probe yang hybridizes hanya untuk segmen DNA tunggal yang belum dipotong oleh enzim pembatasan akan menghasilkan pita tunggal pada blot Southern, sedangkan beberapa band kemungkinan akan diamati ketika probe hybridizes beberapa urutan yang sangat mirip (misalnya, orang-
orang yang mungkin hasil duplikasi urutan ). Modifikasi kondisi hibridisasi ( yaitu, meningkatkan suhu hibridisasi atau menurunkan konsentrasi garam ) dapat digunakan untuk meningkatkan spesifisitas dan mengurangi hibridisasi probe ke urutan yang kurang dari 100 % sama. 4. Jelaskan prinsip kerja northern blot! Teknik Northern Blot digunakan untuk mempelajari ekspresi gen dengan deteksi RNA ( atau mrna yang terisolasi) dalam sampel. Dengan Northern Blot adalah memungkinkan untuk mengamati kontrol selular atas struktur dan fungsi dengan menentukan tingkat ekspresi gen tertentu selama diferensiasi, morfogenesis, serta kondisi tidak normal atau sakit. Teknik ini dikembangkan pada tahun 1977 oleh James Alwine, David Kemp dan George Stark di Stanford University. Nothern Blot mengambil nama dari kesamaannya dengan teknik blotting pertama, Southern blot. Perbedaan utama kedua teknik adalah bahwa pada Northern Blot yang dianalisa adalah RNA, bukan DNA Prosedur blotting dimulai dengan ekstraksi RNA total dari sampel jaringan homogen. mrna kemudian dapat diisolasi menggunakan oligo kromatografi selulosa ( dt ). Sampel RNA kemudian dipisahkan oleh gel elektroforesis. Sebuah membran nilon dengan muatan positif yang paling efektif untuk digunakan dalam Northern Blot karena asam nukleat bermuatan negatif memiliki afinitas yang tinggi bagi mereka. penyangga yang digunakan untuk mentransfer blotting biasanya mengandung formamida karena menurunkan anil pada suhu interaksi probe- RNA untuk mencegah degradasi RNA oleh suhu tinggi. Setelah RNA telah ditransfer ke membran itu bergerak melalui ikatan kovalen ke membran dengan bantuan sinar UV atau panas. Setelah probe telah diberi label, maka hibridisasi RNA pada membran. Membran dicuci untuk memastikan bahwa probe telah terikat. Sinyal hybrid kemudian dideteksi oleh film X - ray dan dapat diukur dengan densitometri. Gambar 9. Prinsip Kerja Nortern Blot
5. Jelaskan Prinsip Kerja Western Blot Western Blotting atau immunoblotting adalah istilah yang dipaki untuk proses transfer dan imunodeteksi protein pada gel yang bertujuan untuk : (1) mengetahui keberadaan dan berat molekul protein sampel dalam suatu campuran, (2) membandingkan reaksi silang antar protein, (3) mempelajari modifikasi protein selama sintesis. Dengan cara ini protein dalam hitungan nanogram dapat terdeteksi. Imunodeteksi tidak dilakukan langsung pada gel karena sifat gel yang rapuh untuk dapat melalui proses inkubasi yang lama dab penccucian yang berulang kali. Untuk mengatasi hal ini, maka protein terlebih dahulu ditransfer dari gel ke membran nitroselulosa (NC) atau membran poliviniliden diflourida (PVDF). Membran ini digunakan sebagai tempat melekatnya protein yang diuji karena :1) mudah manipulasinya, 2) mengurangi lama inkubasi dan pencucian,3) hasil protein yang ditransfer (hasil nblot) dapat dipakai lagi untuk imunodeteksi protein yang lain ( sesudah inkubasi dengan detergen untuk menghilangkan probing reagent),4) blot dapat disimpan sampai 1 bulan,dan 5) blot sesuai untuk berbagai prosedur deteksi. Prosedur western blot terdiri dari enam tahapan, yaitu : 1) Preparasi sampel ( bertindak sebagai antigen) 2) Pemisahan protein pada gel elektroforesis 3) Transfer protein dari gel elektroforesis ke membran PVDF atau NC 4) Memblokade lokasi ikatan nonspesifik pada membran 5) Penambahan antibodi primer dam sekunder 6) Deteksi atau visualisasi pengikatan antibodi -antigen Gambar 10. Prinsip kerja Western Blot
Perbedaan dan Persamaan Teknik Soutern, Western, dan Nortern Blotting adalah sebagai berikut : Perbedaan Soutern Blotting Western Blotting Nortern Blotting Molekul yang dideteksi DNA Protein RNA Gel Elektroforesis Gel Agarose Gel Polyacrylamide Formaldehyde Gel Agarose Gel Pretreatment Metode Blotting Depurinasi, Denaturasi dan netralisasi - - Transfer Capillary Transfer Electrik Transfer Capillary Probes DNA Radioactive atau nonradioactive antibodiprimer cdna, crna Radioactive atau nonradioactive Sistem Deteksi Autoradiography Chemiluminescent Colorimetric Chemiluminescent Colorimetric Autoradiography Chemiluminescent Colorimetric Persamaan Soutern Blotting Western Blotting Nortern Blotting Metode yang Hibridisasi Hibridisasi Hibridisasi digunakan