MAKALAH GENETIKA PCR ( Polimerase Chain Reaction ) «apikde...

Transkripsi

1 1 of 6 19/12/ :43 APIKDEWEFPPUNDIP2011 Just another WordPress.com site MAKALAH GENETIKA PCR ( Polimerase Chain Reaction ) JUN 29 Posted by apikdewefppundip2011 MAKALAH GENETIKA PCR ( Polimerase Chain Reaction ) Oleh: ARIF NURROHMAN ( ) NURFADLINA WIDIARTI (mailto: @fp.undip.ac.id) ( ) PERI INDAH YANI LAOLI (mailto: @fp.undip.ac.id) ( ) SRI IRIANING ( ) JURUSAN S-1 PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN DAN PERTANIAN UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG

2 2 of 6 19/12/ : Kata Pengantar Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena nikmat dan kesempatan yang diberikannya sehingga makalah ini dapat terselesaikan sesuai dengan waktu yang telah ditentukan. Makalah ini berisi tugas mata kuliah Genetika Makalah ini terselesaikan tidak lepas dari bantuan banyak pihak. Ucapan terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Seno Johari selaku dosen pengampu mata kuliah Genetika yang telah membimbing dan mengarahkan jalannya pembuatan makalah ini. Penulis memohon maaf apabila terdapat banyak kesalahan dan kekurangan dalam penulisan makalah ini. Kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan dari semua pihak demi perbaikan makalah ini dimasa yang akan datang. Semarang, Juni 2012 Latar Belakang BAB I PENDAHULUAN Genetika adalah ilmu yang mempelajari sifat-sifat keturunan (hereditas) serta segala sluk beluknya selama ilmiah. Genetika disebut juga ilmu keturunan, ilmu ini mempelajari berbagai aspek yang menyangkut pearisan sifat, bagaimana sifat keturunan ilmu itu diturunkan dari generasi kegenerasi serta variasi-variasi yang mungkin timbul didalamnya atau yang menyertainya. Pewarisan sifat tersebut dapat terjadi melalui proses seksual. Genetika berusaha membawakan material pembawa informasi untuk diwariskan (bahan genetik), bagaimana informasi tersebut di ekspresikan ekspresi genetic dan bagaimana informasi tersebut dipindahkan dari individu satu ke individu lain. PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya. 2. Tujuan dan Manfaat Tujuan dan manfaat dari mempelajari materi ini yaitu dapat mengetahui kegunaan dari PCR, komponan-komponan PCR dan proses PCR. 2. Pengertian PCR (Polimerase Chain Reaction) BAB II PEMBAHASAN Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi (h p://id.wikipedia.org/wiki/replikasi)) DNA (h p://id.wikipedia.org/wiki/dna) secara enzimatik (h p://id.wikipedia.org/wiki/enzim) tanpa menggunakan organisme (h p://id.wikipedia.org/wiki/organisme). Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis (h p://id.wikipedia.org/wiki/kary_mullis) pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel (h p://id.wikipedia.org/wiki/hadiah_nobel) pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia (h p://id.wikipedia.org/wiki/biokimia) dan biologi molekular (h p://id.wikipedia.org /wiki/biologi_molekular) karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil. PCR (Polimerase Chain Reaction) atau reaksi berantai polimerase adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya Komponen Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah:

3 3 of 6 19/12/ :43 a. Primer Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan. b. dntp (deoxynucleoside triphosphate) dntp alias building blocks sebagai batu bata penyusun DNA yang baru. dntp terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu datp, dctp, dgtp dan dttp. c. Buffer Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. d. Ion Logam Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja. Ion logam monovalen, kalsium (K+) Prinsip Kerja Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus: Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat ( patokan ) bagi primer. Durasi tahap ini 1 2 menit. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1 2 menit. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polimerase yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit. Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara ksponensial Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat dipisahkan satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah primer yang masing-masing menempel pada untai tunggal DNA templat. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forward primer) dan primer mundur(reverse primer). Setelah menempel pada untai DNA templat, primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga ujung 5 DNA templat (ingat polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung 5 ke 3 atau berarti dari ujung 3 ke 5 untai templatnya). Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA templat awalnya berupa sepasang untai DNA. Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan menjadi templat pada putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2 n 2n. Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang merupakan urutan target yang memang dikehendaki untuk digandakan (diamplifikasi). Bisa kita bayangkan seandainya PCR dilakukan dalam 20 putaran saja, maka pada akhir reaksi akan diperoleh fragmen urutan target sebanyak = = ! Jumlah ini masih dengan asumsi bahwa DNA templat awalnya hanya satu untai

4 4 of 6 19/12/ :43 ganda. Padahal kenyataannya, hampir tidak mungkin DNA templat awal hanya berupa satu untai ganda. Jika DNA templat awal terdiri atas 20 untai ganda saja, maka jumlah tadi tinggal dikalikan 20 menjadi , suatu jumlah yang sangat cukup bila akan digunakan sebagai fragmen pelacak Perancangan Primer Tahapan PCR yang paling menentukan adalah penempelan primer. Sepasang primer oligonukleotida (primer maju dan primer mundur) yang akan dipolimerisasi masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya pada kedua ujung fragmen yang akan diamplifikasi. Untuk itu urutan basanya harus komplementer atau setidak-tidaknya memiliki homologi cukup tinggi dengan urutan basa kedua daerah ujung fragmen yang akan diamplifikasi itu. Padahal, kita belum mengetahui dengan pasti urutan basa sekuens target. Oleh karena itu, diperlukan cara tertentu untuk merancang urutan basa kedua primer yang akan digunakan. Dasar yang digunakan adalah urutan basa yang diduga mempunyai kemiripan dengan urutan basa sekuens target. Urutan ini adalah urutan serupa dari sejumlah spesies/strain organisme lainnya yang telah diketahui/dipublikasikan. Sebagai contoh, untuk merancang sepasang primer yang diharapkan dapat mengamplifikasi sebagian gen lipase pada isolat Bacillus termofilik tertentu dapat digunakan informasi urutan basa gen lipase dari strain-strain Pseudomonas fluorescens, P. mendocina, dan sebagainya, yang sebelumnya telah diketahui. Urutan-urutan basa fragmen tertentu dari berbagai strain tersebut kemudian dijajarkan dan dicari satu daerah atau lebih yang memperlihatkan homologi tinggi antara satu strain dan lainnya. Daerah ini dinamakan daerah lestari (conserved area). Sebagian/seluruh urutan basa pada daerah lestari inilah yang akan menjadi urutan basa primer. Sebenarnya, daerah lestari juga dapat ditentukan melalui penjajaran urutan asam amino pada tingkat protein. Urutan asam amino ini kemudian diturunkan ke urutan basa DNA. Dari satu urutan asam amino sangat mungkin akan diperoleh lebih dari satu urutan basa DNA karena setiap asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu triplet kodon. Dengan demikian, urutan basa primer yang disusun dapat merupakan kombinasi beberapa kemungkinan. Primer dengan urutan basa semacam ini dinamakan primer degenerate. Selain itu, primer yang disusun melalui penjajaran urutan basa DNA pun dapat merupakan primer degenerate karena urutan basa pada daerah lestari di tingkat DNA pun tidak selamanya memperlihatkan homologi sempurna (100%). Urutan basa pasangan primer yang telah disusun kemudian dianalisis menggunakan program komputer untuk mengetahui kemungkinan terjadinya primer-dimer akibat homologi sendiri(self-homology) atau homologi silang (cross-homology). Selain itu, juga perlu dilihat kemungkinan terjadinya salah tempel(mispriming), yaitu penempelan primer di luar sekuens target. Analisis juga dilakukan untuk mengetahui titik leleh (T m) masing-masing primer dan kandungan GC-nya. Sepasang primer yang baik harus mempunyai T myang relatif sama dengan kandungan GC yang cukup tinggi Aplikasi teknik PCR Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada tahun Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya: a. Isolasi Gen Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut junk DNA, DNA sampah yang fungsinya belum diketahui dengan baik. Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pankreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia. Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga. Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus mengorbankan sapi atau babi. Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama probe yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut. b. DNA Sequencing Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan. c. Forensik

5 5 of 6 19/12/ :43 Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud. Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua sesungguhnya dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu. d. Diagnosa Penyakit Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat. PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya. Gambar proses prinsip kerja PCR (Polimerase Chain Reaction) BAB III KESIMPULAN Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris (h p://id.wikipedia.org /wiki/bahasa_inggris) polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi (h p://id.wikipedia.org /wiki/replikasi)) DNA (h p://id.wikipedia.org/wiki/dna) secara enzimatik (h p://id.wikipedia.org/wiki/enzim) tanpa menggunakan organisme (h p://id.wikipedia.org/wiki/organisme). Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara dua puluh sampai tiga puluh kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap yaitu Tahap peleburan (melting) atau denaturasi, Tahap penempelan atau annealing dan Tahap pemanjangan atau elongasi. Lepas tahap ketika, siklus diulang kembali mulai tahap satu. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial. Brown, T.A (2002) DNA in Genomes, 2nd ed., DAFTAR PUSTAKA David, J. C, Jannet L.,Comparison of Vitek 32 and Microlog ML3 System for Identification of Select Biological Warfare Agents, Armed Force Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, DC, 2001de Nogueira L., Bi rich, V.P.C., Shepherd, G. J., Lopes A. V., and Marsaioli, A. J. 200 Marlina, Radu, S., Kqueen, C. Y., Napis, S., Zakaria, Z., Mutalib, S. A. and Nishibuchi, M. Occurrence of tdh and trh genes in Vibrio parahaemolyticus isolated from Corbicula moltkiana Prime in West Sumatera, Indonesia. Southeast Asian Journal of Tropical Medical Public Health Vol.38 No. 2 March Marlina, Zulqifli, Anamerta, L., Revadiana, I., Radu, S., Kqueen, C. Y. and Nishibuchi, M. Identification of Vibrio parahaemolyticus from clinical samples in West Sumatera Using Polymerase Chain Reaction Methods. Acta Pharmaceutica Indonesia 31 (2): 2007, Retnoningrum, D.S Penerapan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk diagnosis penyakit infeksi. Jurusan Farmasi FMIPA. Bandung: ITB.

6 6 of 6 19/12/ :43 Tentang apikdewefppundip2011 student of diponegoro university Lihat semua tulisan oleh apikdewefppundip2011» Posted on Juni 29, 2012, in Uncategorized. Bookmark the permalink. Tinggalkan Sebuah Komentar. Tinggalkan Sebuah Komentar Komentar (1) Blog pada WordPress.com. Tema: Mystique oleh digitalnature.