BAB III METODOLOGI PENELITIAN Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif dan pengukuran dilakukan dengan menggunakan alat KCKT. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biofarmasi dan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi USU. 3.1 Alat Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah timbangan, beaker gelas, neraca analitis (Baecho), pipet tetes, tabung sentrifugasi, rak tabung, gelas ukur, alat vortex (Health HVM-400), alat sentrifugasi (Health HC 1120T), termos es, spuit 1 ml, spuit 3 ml, politube, mikropipet, batang pengaduk, vial 2 ml, satu unit alat KCKT Agilent 1120 Compact LC, kolom ODS C18, wadah solven, injektor, syringe 50 µl, pompa vakum (Gast DOA-PG04-BN), sonifikator (Branson 1510), kertas membran filter whatman Cellulose Nitrate 0,45 µm, penyaring PTFE 0,2 µm. (Gambar alat dapat dilihat pada Lampiran 1 dan 2 halaman 21). 3.2 Bahan Bahan bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu: metanol p.a. (E. Merck), NaOH p.a. (E. Merck), plasma darah pasien TB, plasma kontrol (gambar dapat dilihat pada Lampiran 3 halaman 25), kalium dihidrogen fosfat p.a (E. Merck), Baku Pirazinamida ARS (ASEAN Reference Substance) (sertifikat analisis dapat dilihat pada Lampiran 14 halaman 41), Nikotinamid (Western
Drugs PVT. LTD.) (sertifikat analisis dapat dilihat pada Lampiran 15 halaman 42), aquabidest (PT. Ikapharmindo Putramas), Heparin sodium inject (PT. B. Braun Medical Indonesia). 3.3 Pengambilan Sampel Sampel yang diperiksa dalam penelitian ini adalah plasma darah pasien penderita Tuberkulosis (TB) yang sedang menjalani perawatan di klinik Dr. Zainuddin Amir, DSP (Ahli Penyakit Saluran Pernapasan) di Jl. Jemadi, Medan. Pasien yang diambil darahnya adalah pasien yang telah mengkonsumsi obat TB kurang dari 2 bulan atau sedang menjalani fase intensif. (Data pasien dapat dilihat pada Lampiran 13 halaman 40). Waktu pengambilan darah adalah 2 jam setelah meminum obat. 3.4 Rancangan Penelitian 3.4.1 Penyiapan Bahan 3.4.1.1 Pembuatan Plasma Darah Pasien TB Darah pasien diambil sebanyak 5 ml, kemudian dimasukkan ke dalam venoject yang telah terbasahi heparin. Venoject yang berisi darah disentrifugasi dengan kecepatan 4000 putaran permenit selama 5 menit. Diperoleh dua lapisan yaitu lapisan atas yang merupakan plasma dan lapisan bawah berupa endapan. Diambil lapisan atas (plasma).
3.4.1.2 Pembuatan Plasma Kontrol Darah diambil dari donatur (dewasa dan sehat) sebanyak 5 ml, kemudian dimasukkan ke dalam venoject yang telah terbasahi heparin. Venoject yang berisi darah disentrifugasi dengan kecepatan 4000 putaran permenit selama 5 menit. Diperoleh dua lapisan yaitu lapisan atas yang merupakan plasma dan lapisan bawah berupa endapan. Diambil lapisan atas (plasma). 3.4.1.3 Pembuatan Pereaksi 3.4.1.3.1 Aqua Bebas CO 2 Dibuat dengan mendidihkan air untuk injeksi segar selama tidak kurang dari 10 menit sambil mencegah hubungan dengan udara sesempurna mungkin, didinginkan, dan segera digunakan (Ditjen POM, 1972). 3.4.1.3.2 Natrium Hidroksida (NaOH) 0,2 N Dilarutkan 8,0 g NaOH dengan air bebas CO 2 sampai 1000,0 ml (Ditjen POM, 1979). 3.4.1.3.3 Kalium Dihidrogen Fosfat 0,2 M Dilarutkan 27,218 g kalium dihidrogen fosfat dalam air bebas CO 2 secukupnya hingga 1000,0 ml (Ditjen POM, 1979). 3.4.1.3.4 Buffer Fosfat ph 7,4 Dibuat dengan mencampur 50,0 ml kalium dihidrogenfosfat 0,2 M dengan 39,1 ml natrium hidroksida 0,2 N, dan diencerkan dengan air bebas karbondioksida P hingga 200,0 ml (Ditjen POM, 1979).
3.4.1.4 Pembuatan Fase Gerak Fase gerak terdiri dari buffer fosfat ph 7,4 dan metanol dengan perbandingan 96,6:3,2. Fase gerak dibuat sebanyak 500 ml dengan mencampurkan buffer fosfat ph 7,4 sebanyak 484 ml dan metanol sebanyak 16 ml. Sebelum digunakan fase gerak disaring melalui penyaring membran filter whatman Cellulose Nitrate 0,45 µm. Kemudian diawaudarakan selama ± 20 menit menggunakan sonifikator. 3.4.1.5 Pembuatan Larutan Induk Baku 3.4.1.5.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Pirazinamida Ditimbang seksama sejumlah 10 mg Pirazinamida baku lalu dimasukkan ke dalam vial yang telah dikalibrasi ad 1 ml, dilarutkan dengan fase gerak (buffer fosfat ph 7,4:metanol dengan perbandingan 96,8:3,2) sehingga diperoleh konsentrasi 81,2281 mm (10.000 mcg/ml). 3.4.1.5.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Nikotinamid 3.4.1.5.2.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Pertama Ditimbang seksama sejumlah 10 mg Nikotinamid lalu dimasukkan ke dalam labu 10 ml, dilarutkan dengan fase gerak (buffer fosfat ph 7,4:metanol dengan perbandingan 96,8:3,2) hingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 8,1900 mm (1.000 mcg/ml). 3.4.1.5.2.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Kedua Dipipet larutan induk pertama sebanyak 1,5 ml ke dalam labu 10 ml, diencerkan dengan fase gerak (buffer fosfat ph 7,4:metanol dengan perbandingan 96,8:3,2) hingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1,2285 mm (150 mcg/ml).
3.4.2 Prosedur Analisis 3.4.2.1 Penyiapan Alat KCKT Alat dihubungkan dengan sumber listrik, kemudian alat dihidupkan dengan menekan tombol power. Diatur panjang gelombang menjadi 254 nm. Dipurging untuk menghilangkan gelembung pada selang, kemudian dialirkan fase gerak hingga laju alir 0,8 ml/menit. Biarkan hingga kondisi alat stabil. 3.4.2.2 Penentuan Garis Alas (Base Line) Setelah dialirkan fase gerak selama 30 menit, dilihat absorbansi apakah telah stabil, jika telah stabil absorbansi di nol kan dengan cara click to balance. 3.4.2.3 Penyuntikan Fase Gerak Untuk mengetahui kebersihan injektor, maka dilakukan penyuntikan fase gerak dengan cara: tekan single run, tulis nama sampel dan tekan OK. Injektor diputar ke posisi load dan disuntikkan fase gerak ke dalam injektor dengan menggunakan penyuntik mikroliter, injektor diputar ke posisi inject. (Hasil penyuntikan fase gerak dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 26). 3.4.2.4 Penyuntikan Plasma Kontrol Dipipet 300 µl plasma, dimasukkan ke dalam politube dan ditambahkan 600 µl metanol untuk mengendapkan protein lalu divortex. Disentrifugasi dengan kecepatan 4000 putaran permenit selama 5 menit. Dipisahkan supernatan dari endapan dan dikumpulkan. Disaring dengan penyaring PTFE diameter 0,2 µm, lalu diinjeksikan ke dalam sistem KCKT dengan volume penyuntikan 20 µl
dengan laju aliran (flow rate) 0.8 ml/menit, deteksi pada panjang gelombang 254 nm. Dilihat kromatogram yang terbentuk. (Kromatogram dapat dilihat pada Lampiran 7 halaman 29). 3.4.2.5 Analisis Kualitatif Analisis kualitatif pirazinamida dan nikotinamid dapat dilakukan dengan membandingkan waktu retensi yang sama dari kromatogram pada penyuntikan sampel dengan kromatogram pada penyuntikan larutan baku pembanding pirazinamida dan nikotinamid. (Kromatogram larutan baku pembanding dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 27 dan Lampiran 6 halaman 28). 3.4.2.6 Analisis Kuantitatif 3.4.2.6.1 Penentuan Linieritas Kurva Kalibrasi Baku Pembanding Pirazinamida Dipipet larutan induk baku Pirazinamida sebanyak 30 µl; 40 µl; 50 µl; 60 µl; 80 µl, masing-masing dimasukkan ke dalam vial yang telah dikalibrasi 1ml, dicukupkan dengan fase gerak sampai garis tanda sehingga diperoleh konsentrasi 2,4368 mm (300 mcg/ml); 3,2491 mm (400 mcg/ml); 4,0614 mm (500 mcg/ml); 4,8736 mm (600 mcg/ml); 6,4982 mm (800 mcg/ml). Dari masing-masing konsentrasi dipipet sebanyak 10 µl, dimasukkan ke dalam vial yang telah dikalibrasi 2 ml, ditambahkan 50 μl larutan nikotinamid konsentrasi 1,2285 mm (150 mcg/ml) kemudian ditambahkan plasma sampai garis tanda, divortex lalu didiamkan selama 5 menit. Dipipet 300 µl, dimasukkan ke dalam politube dan ditambahkan 600 µl metanol untuk mengendapkan protein lalu divortex. Disentrifugasi dengan kecepatan 4000 putaran per menit selama 5 menit.
Supernatan yang diperoleh diambil dengan menggunakan spuit kemudian disaring dengan penyaring PTFE diameter 0,2 µm, lalu diinjeksikan ke dalam sistem KCKT dengan volume penyuntikan 20 µl dengan laju aliran (flow rate) 0.8 ml/menit, deteksi pada panjang gelombang 254 nm. Kurva kalibrasi dibuat dengan menggunakan rasio luas puncak antara bahan obat dengan baku dalam yang terukur oleh detektor versus konsentrasi bahan obat untuk memperoleh garis regresi linier. (Kromatogram dapat dilihat pada Lampiran 9 halaman 31 dan data perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 10 halaman 36). 3.4.2.6.2 Pemeriksaan Kadar Pirazinamida Dalam Plasma Darah Pasien TB Kedalam plasma darah pasien ditambahkan 50 µm nikotinamid 16,3 mm (2.000 mcg/ml). Didiamkan selama 5 menit. Dipipet 300 µl, dimasukkan ke dalam politube dan ditambahkan 600 µl metanol untuk mengendapkan protein lalu divortex. Disentrifugasi dengan kecepatan 4000 putaran per menit selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh diambil dengan menggunakan spuit kemudian disaring dengan penyaring PTFE diameter 0,2 µm, lalu diinjeksikan ke dalam sistem KCKT dengan volume penyuntikan 20 µl dengan laju aliran (flow rate) 0.8 ml/menit, deteksi pada panjang gelombang 254 nm. Dilihat kromatogram yang terbentuk dan waktu retensinya. Dihitung kadar obat dalam plasma dengan menghitung luas puncaknya. (Kromatogram dapat dilihat pada Lampiran 8 halaman 30 dan data perhitungan kadar dapat dilihat pada Lampiran 11 halaman 38).
3.4.3 Penentuan Batas Deteksi dan Batas Kuantifikasi Batas deteksi (Limit of detection/lod) didefenisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi. Batas kuantifikasi (Limit of quantification/loq) didefenisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. LOD = 3,3x SD slope LOQ = 10xSD slope Standar deviasi (SD) dapat ditentukan berdasarkan pada standar deviasi blanko, pada standar deviasi residual dari garis regresi (Rohman, 2007). Standar deviasi residual (S y ) = 2 (y yi) (Harmita, 2004). n 2 (Data perhitungan batas deteksi dan batas kuantifikasi dapat dilihat pada Lampiran 12 halaman 39).
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis Pirazinamida dalam plasma secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase balik telah dilakukan oleh Revankar, S.N.,et al.,(1994) menggunakan fase gerak buffer fosfat ph 7,4 dan metanol (96,8:3,2 v/v) pada panjang gelombang 268 nm dan baku dalam nikotinamid. Menurut Gandjar dan Rohman (2007), panjang gelombang yang dipilih biasanya 254 nm karena kebanyakan senyawa obat menyerap di 254 nm. Menurut Munson (1991), detektor ini tanggap terhadap banyak obat dan kepekaannya memadai bagi penetapan sediaan obat dan kebanyakan cairan biologi. Berdasarkan hal tersebut maka pemeriksaan kadar pirazinamida dalam plasma darah pasien TB dilakukan secara KCKT dengan menggunakan kolom ODS C18, fase gerak buffer posfat ph 7,4:metanol (96,8:3,2 v/v) dan panjang gelombang 254 nm dengan baku dalam nikotinamid. Untuk mengetahui waktu retensi dari pirazinamida dan nikotinamid terlebih dahulu dilakukan penyuntikan larutan baku. Dari hasil penyuntikan diperoleh waktu retensi larutan baku pirazinamida yaitu 21,663 menit dan waktu tambat larutan baku nikotinamid yaitu 25,740 menit. Kedua kromatogram hasil analisis KCKT ini dapat dilihat pada Gambar 7 dan 8.
Gambar 7. Kromatogram hasil penyuntikan Pirazinamida baku Gambar 8. Kromatogram hasil penyuntikan Nikotinamid baku Sampel darah diambil dari seorang pasien TB yang sedang menjalani tahap intensif selama ± 1 bulan. Dosis yang diminum oleh pasien adalah 1200 mg. Pengambilan darah dilakukan 2 jam setelah pasien mengkonsumsi obat. Pirazinamida dapat dengan baik diserap dari saluran cerna dan secara luas didistribusikan pada jaringan tubuh. Waktu paruhnya adalah 8-11 jam (Chambers, H.F.,2004). Resorpsinya cepat dan hampir sempurna; kadar maksimal dalam plasma sudah dicapai dalam 1-2 jam (Tjay dan Rahardja, 2002).
Untuk suatu obat yang diberikan dalam dosis oral berulang waktu yang diperlukan untuk mencapai keadaan tunak bergantung pada waktu paruh eliminasi obat. Dari segi klinik, waktu yang diperlukan untuk mencapai 99% dari konsentrasi tunak dalam plasma adalah 6,6 waktu paruh eliminasi (Shargel, 2005). Dari hasil penyuntikan sampel diperoleh waktu retensi pirazinamida yaitu 20,660 menit dan nikotinamid yaitu 24,313 menit. Waktu retensi ini berdekatan dengan waktu retensi pirazinamida baku dan nikotinamid baku. Kromatogram hasil analisis sampel secara KCKT dapat dilihat pada Gambar 9. Pirazinamida di dalam tubuh dihidrolisis oleh enzim pirazinamidase yang berasal dari basil TB menjadi asam pirazinoat yang aktif sebagai tuberkulostatik (Tjay dan Rahardja, 2002; Istiantoro, 2009). Pada temperatur kamar, pirazinamida dalam plasma pasien TB berada dalam kondisi stabil. Hal ini dapat dilihat pada kromatogram sampel tidak ditemukan adanya puncak lain (lihat Gambar 9).
Gambar 9. Kromatogram Hasil Penyuntikan Sampel dengan Baku Dalam Nikotinamid Penentuan linieritas kurva kalibrasi ditentukan berdasarkan luas puncak karena puncak yang dihasilkan asimetris. Pengukuran luas puncak biasanya lebih dipilih pada puncak yang asimetris. Biasanya ketepatan metode menggunakan nilai luas puncak sedikit dipengaruhi oleh perubahan dalam instrumen dan parameter kromatografi (Snyder dan Kirkland, 1979). Menurut Kromidas (2005), hampir semua peraturan menyatakan dengan tegas bahwa perhitungan dapat dilakukan menggunakan metode luas puncak seperti tinggi puncak. Kurva kalibrasi pirazinamida baku dibuat dengan konsentrasi 2,4368 mm (300 mcg/ml); 3,2491 mm (400 mcg/ml); 4,0614 mm (500 mcg/ml); 4,8736 mm
(600 mcg/ml) dan 6,4982 mm (800 mcg/ml). Dari kurva kalibrasi diperoleh hubungan yang linier antara luas puncak dan konsentrasi dengan koefisien korelasi (r)= 0,9725 dan persamaan regresi y = 0,5326x 1,1920 dengan data penyuntikan larutan baku pirazinamida. Kurva kalibrasi dapat dilihat pada Gambar 10. Kurva Kalibrasi Pirazinamida Rasio Luas Puncak Pirazinamida/Nikotinamid vs Konsentrasi Rasio luas puncak pirazinamida/nikotinamid 2,4 2,2 1,8 2 1,6 1,4 1,2 0,8 1 0,6 0,4 0,2 0 0 2 4 6 8 y = 0,5326x - 1,1920 r= 0,9725 Konsentrasi (mm) Gambar 10. Kurva Kalibrasi Pirazinamida Baku Rasio Luas Puncak Pirazinamida/Nikotinamid versus Konsentrasi Pada penyuntikan kalibrasi diperoleh waktu retensi antara 19,547-19,980 menit. Kadar sampel dapat dihitung menggunakan persamaan regresi y = 0,5326x 1,1920 yaitu dengan mensubsitusikan y dengan harga rasio luas puncak. Hasil perhitungan diketahui harga x (kadar pirazinamida) adalah 2,4537 mm.
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Pemeriksaan kadar pirazinamida dalam dalam plasma darah pasien TB dapat dilakukan dengan cara kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) menggunakan kolom ODS C18 dengan fase gerak campuran buffer fosfat ph 7,4:metanol (98,9:3,2), dengan laju alir 0,8ml/menit pada panjang gelombang 254 nm dan menggunakan baku dalam nikotinamid. Kadar yang diperoleh adalah 2,4537 mm. Pirazinamida dalam plasma darah pasien TB berada dalam keadaan stabil pada temperatur kamar. 5.2 Saran Disarankan kepada peneliti selanjutnya agar melakukan validasi metode sehingga diperoleh hasil yang lebih baik.