LAMPIRAN Lampiran 1. Diagram Alir Penelitian Peremajaan Bacillus Isolasi Bakteri Oportunistik Produksi Antimikrob Penghitungan Sel Bakteri Oportunistik Pengambilan Supernatan Bebas Sel Pemurnian Bakteri Oportunistik Uji Tantang Bakteri Patogen Oportunistik Pembentuka n Biofilm Pengendalian Sel Biofilm Penghitungan Sel Biofilm
48 Lampiran 2. Komposisi Media Cair Sea Water Complete (SWC) dan Larutan NaCl 0,9 % a. Komposisi Media cair Sea Water Complete (SWC) dalam 1 Liter 1) Air Laut = 750 ml 2) Akuades = 250 ml 3) Gliserol = 1,5 ml 4) Ekstrak Khamir = 0,5 gram 5) Agar = 20 gram 6) Pepton = 2,5 gram b. Larutan NaCl 0,9 % 1) NaCl garam = 9 gram 2) Akuades = 1 liter 48
49 Lampiran 3. Alur Kerja Pengambilan dan Penghitungan Sampel Bakteri Patogen Oportunistik 1. Sedimen Sedimen dimasukkan ke dalam botol sampel kaca steril diencerkan Pengenceran diinokulasikan sebanyak 0,1 ml ke media Plate Count Agar (PCA) diinkubasi pada suhu 33 C selama 24 jam dihitung jumlah sel 49
50 2. Air Air dimasukkan ke dalam botol sampel kaca steril diencerkan Pengenceran diinokulasikan sebanyak 0,1 ml ke media Plate Count Agar (PCA) diinkubasi pada suhu 33 C selama 24 jam dihitung jumlah sel 3. Biofilm Bakteri Cotton bud diusap pada permukaan benda padat dimasukkan ke dalam tabung reaksi diusapkan pada media differensial dan selektif EMB, SSA, dan MSA diinkubasi pada suhu 33 C selama 24 jam dihitung jumlah sel 50
51 Lampiran 4. Pembentukan dan Penghitungan Sel Biofilm Lempeng stainless steel 1 cm 2 dicuci dengan deterjen pada bak sonikator dibilas dengan akuades disterilkan selama 15 menit, 1 atm, 121 C Lempeng stainless steel 1 cm 2 steril Biofilm terbentuk pada lempeng dimasukkan 6 buah ke dalam Erlenmeyer 250 ml berisi 100 ml SWC cair dengan konsentrasi bakteri uji 10 8 CFU/ml digoyang pada kecepatan 120 rpm (water bath shaker) pada suhu 28 C diinkubasi selama 1, 3, dan 6 hari lempeng diangkat, dibilas dengan larutan NaCl 0,9% dimasukkan ke dalam 9 ml larutan NaCl 0,9% yang sudah ditambah dengan 1 gram manikmanik kaca divortek untuk melepas biofilm diambil 0,1 ml larutan kemudian diencerkan pada larutan 0,9% NaCl, dihitung pada media PCA 51
52 Lampiran 5. Kurva Pertumbuhan Bacillus sp. Bacillus sp. diambil 2 koloni Bacillus sp. berumur 24 jam diinokulasikan dalam Erlenmeyer 100 ml berisi 100 ml media SWC cair digoyang dengan Water Bath Shaker dengan kecepatan 120 rpm, suhu 28 C dipanen sebanyak 10 ml setiap 3 jam 10 ml biakan diukur absorbansi sel dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 620 nm dicatat data 52
53 Lampiran 6. Uji Tantang Sel Bacillus sp. Terhadap Bakteri Uji Bakteri Uji Diinokulasikan hingga 10 7 CFU/ml ke dalam 10 ml larutan NaCl 0,9% disebar dengan cotton bud steril di atas permukaan SWC padat hingga merata diletakkan kertas cakram yang telah direndam kultur Bacillus sp. umur 24 jam dengan kepadatan sel 10 7 CFU/ml diukur diameter zona bening 53
54 Lampiran 7. Uji Penghambatan Senyawa Antimikroba Ekstrak Kasar Bacillus sp. Terhadap Bakteri Uji Bakteri Uji dalam SWC cair dipanen setiap 3 jam sebanyak 10 ml disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit suhu 4 C Supernatan ekstrak kasar Pellet diambil sebanyak 10 µl supernatan diteteskan pada 3 kertas cakram steril (diameter 6 mm) diletakkan di atas perrmukaan media SWC padat yang telah disebar 1 ml kultur cair bakteri uji kepadatan 10 7 CFU/ml diinkubasi pada suhu 33 C selama 24 jam diukur zona bening 54
55 Lampiran 8. Pengontrolan Sel Biofilm Patogen Oportunistik dengan Senyawa Antimikroba Bacillus sp. Lempeng stainless steel inkubasi 6 hari dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambahkan 10 ml senyawa antimikroba ekstrak kasar Bacillus sp. diinkubasi selama 24 jam pada suhu 33 C diangkat lempeng kemudian dibilas sebanyak 3 kali dengan akuades steril dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 10 ml NaCl 0,9 % dan 1 gram manik-manik kaca divortek untuk melepas biofilm 0,1 ml kultur diencerkan diinokulasikan 0,1 ml pada media Plate Count Agar dilakukan penghitungan 55
56 Lampiran 9. Foto Tambak Udang Intensif 1. Tambak Handoyo di Kecamatan Pantai Cermin 2. Tambak Rim di Kecamatan Batubara 3. Tambak Rindam di Kecamatan Batubara 56
57 Lampiran 10. Foto Alat Neraca Water Bath Shaker Oven Autoklaf Inkubator Bakteri Mikro pipet dan tip 57
58 Lampiran 11. Gambar Penelitian a. Isolasi Bakteri Pada Media Differensial dan Selektif a b c d Cotton bud yang diusapkan pada permukaan padat di tambak dan diusap pada (a) media MSA; (b) media SSA; isolasi bakteri pada (c) media MSA (d) media SSA. 58
59 b. Uji Biokimia a b d c (a) Uji hidrogen sulfida dan fermentasi gula; (b) uji sitrat; (c) uji gidrolisa gelatin; (d) hidrolisa pati pada Escherechia coli. 59