HASIL DAN PEMBAHASAN

19 HASIL DAN PEMBAHASAN Vektor Kloning Protein rgh Isolasi Plasmid cdna GH. Plasmid pgem-t Easy yang mengandung cdna; El-mGH, Og-mGH dan Cc-mGH berhasil diisolasi dari bakteri konstruksi E. coli DH5α dengan menggunakan kit FlexiPrep. Hal ini ditunjukkan dengan terbentuknya pita DNA dengan ukuran sekitar 3953 bp untuk pgem-t Easy yang mengandung cdna; El-GH, 3858 bp untuk Og-GH, dan 3648 bp untuk Cc-GH. Pita ini menunjukkan jumlah ukuran vektor pgem-t Easy yang berukuran 3015 bp ditambah dengan cdna GH masing-masing ikan; kerapu kertang, ikan gurame dan ikan mas (Gambar 3). kb 5,0-3,0-2,0 - Cc-cDNA GH Og-cDNA GH El-cDNA GH M 1 2 1 2 1 2 Gambar 3. Hasil isolasi plasmid pgem-t Easy yang mengandung Cc-cDNA GH, Og-cDNA GH, dan El-cDNA GH. M: marka panjang fragmen DNA (2-lod ladder, BioLabs Inc., New England); angka di sebelah kiri: ukuran fragmen DNA marka; angka 1-2 adalah nomor klon bakteri hasil isolasi plasmid cdna GH. Analisis Fragmen GH Mature. Sekuens cdna yang mengkodekan hormon pertumbuhan (GH) ikan kerapu kertang berdasarkan data Genbank EU280321 berukuran sekitar 938 bp yang menyandikan 205 asam amino dan dilengkapi dengan signal peptida (Lampiran 1). Untuk ikan mas sekuens cdna yang mengkode hormon pertumbuhannya berukuran sekitar 1164 bp yang menyandikan 211 asam amino berdasarkan data Genbank M27000 (Lampiran 2), namun yang tersambung dalam plasmid pgem-t Easy hanya bagian CDSnya yang berukuran sekitar 633 bp. Dan cdna yang mengkode hormon pertumbuhan ikan gurame belum terdapat di data Genbank, namun berdasarkan penelitian Nugroho et al. (2008) sekuens cdna yang mengkode hormon pertumbuhan ikan gurame berukuran sekitar 843 bp yang menyandikan 205 asam amino. pgem-t Easy/ cdna GH Prediksi asam amino gen GH menggunakan program GENETYX version 7 pada ikan kerapu kertang (Lampiran 3), ikan mas (Lampiran 4), dan ikan gurame (Lampiran 5), sehingga dapat ditentukan gen target atau disebut juga dengan GH

20 mature (mgh) yang digunakan dalam pembuatan protein rekombinan GH. Untuk ikan kerapu kertang (El-mGH) berukuran sekitar 576 bp, ikan mas (Cc-mGH) berukuran sekitar 579 bp, dan ikan gurame (Og-mGH) berukuran sekitar 576 bp yang masing-masing diambil dari daerah yang ditranslasikan atau CDS dengan menghilangkan signal peptidanya. Signal peptida biasanya terdiri dari 16 hingga 50 asam amino yang diprediksi dengan memasukkan sekuens yang ditranslasi ke dalam program SignalP 3.0 Server pada website http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp sehingga diketahui kemungkinan besar signal peptida CDS GH ikan kerapu kertang terdapat pada posisi 17 dan 18 (Lampiran 6), ikan mas terdapat pada posisi 22 dan 23 (Lampiran 7), pada ikan gurame terdapat pada posisi 17 dan 18 (Lampiran 8). Amplifikasi PCR. Amplifikasi PCR cdna GH masing-masing ikan; ikan gurame, ikan mas, dan ikan kerapu kertang dengan menggunakan primer spesifik menghasilkan pita DNA yang masing-masing berukuran sekitar 576 bp, 579 bp, dan 576 bp setelah dimigrasikan pada gel elektroforesis (Gambar 4) Og-mGH Cc-mGH El-mGH kb M 1 2 3 1 2 3 1 2 3 0,8-0,5 - mgh 0,3 - Gambar 4. Produk PCR fragmen GH mature; Og-mGH, Cc-mGH, dan El-mGH. Kloning ke Vektor pgem-t Easy dan Transformasi ke E. coli DH5α. Fragmen mgh ikan gurame (Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH), dan ikan kerapu kertang (El-mGH) yang telah diamplifikasi dengan PCR kemudian disambungkan (ligasi) ke vektor kloning pgem-t Easy untuk diperbanyak secara in vivo di dalam bakteri konstruksi E. coli DH5α. Plasmid yang dihasilkan disebut sebagai pt-mgh. Keberhasilan dalam penyambungan (ligasi) sekuens GH mature ikan kerapu gurame (Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH), dan ikan kerapu kertang (El-mGH) ke vektor kloning pgem-t Easy dapat diketahui dengan cara mengidentifikasi masuknya plasmid tersebut pada bakter konstruksi E. coli DH5α (transforman). Koloni bakteri yang mengandung vektor yang tersisipi mgh akan tumbuh berwarna putih, sedang koloni bakteri yang mengandung vektor yang tidak tersisipi dengan mgh akan berwarna biru. Hal ini dikarenakan vektor pgem-t

21 Easy memiliki marker gen LacZ sebagai gen pelapor (Kobolak & Muller 2003). Selanjutnya Suharsono (2000) mengatakan bahwa dengan penambahan IPTG (Isopropil thiogalaktosida) dan X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolylbeta-Dgalactopyranocide) pada media tumbuh, maka gen LacZ yang mengkode enzim β- galaktosidase dapat menguraikan X-gal menjadi galaktosa dan 5-bromo-4- kloroindigo, sehingga menghasilkan koloni berwarna biru. Namun, apabila terjadi insersi gen (rgh) pada MCS, maka gen LacZ tidak dapat berfungsi untuk menguraikan X-gal menjadi galaktosa sehingga koloni bakteri berwarna putih. T 1 2 3 4 5 T T 1 2 3 4 5 T T 1 2 3 4 5 T pgem-t Easy/El-mGH pgem-t Easy/Og-mGH pgem-t Easy/Cc-mGH 3 kb Gambar 5. Hasil cracking pgem-t Easy/El-mGH, pgem-t Easy/Og-mGH, dan pgem-t Easy/Cc-mGH dari bakteri konstruksi E. coli DH5α. T pada gambar: marka ukuran plasmid pgem-t Easy (3 kb) dan nomor 1-5 adalah nomor sampel klon bakteri. Proses ligasi dan transformasi telah berhasil dilakukan. Hal ini dapat dilihat dari hasil cracking yang menunjukkan bahwa sebagian besar bakteri E. coli tersebut membawa plasmid pt-mgh (Gambar 5). Keberhasilan ligasi ditunjukkan dengan bertambah besarnya ukuran plasmid dibandingkan dengan ukuran pgem- T Easy (T= 3 kb). (Gambar 5). Selanjutnya koloni bakteri konstruksi E. coli DH5α yang positif mengandung plasmid rekombinan GH dikoleksi kemudian diremajakan dan ditumbuhkan pada media 2xYT + Ampisilin untuk diperbanyak secara in vivo (Gambar 6). DH5α: pt/el-mgh DH5α: pt/og-mgh DH5α: pt/cc-mgh Gambar 6. Klon bakteri konstruksi E. coli DH5α yang mengandung pt-mgh.

22 Vektor Ekspresi Protein rgh Isolasi Plasmid Fragmen GH Mature. Hasil elektroforesis plasmid ptmgh (El-mGH, Og-mGH, dan Cc-mGH) terdapat pita yang masing-masing berukuran sekitar 3,5 kb (Gambar 7). Hal ini menunjukkan bahwa plasmid pgem-t Easy yang mengandung fragmen DNA mature berhasil diisolasi dari bakteri konstruksi E. coli DH5α. kb 10,0-5,0-3,0-2,0-1,0-0,5-0,2 - M 1 2 3 M 1 2 3 3 2 1 M pt/el-mgh pt/og-mgh pt/cc-mgh Gambar 7. Isolasi plasmid pt-mgh dari bakteri konstruksi E. coli DH5α. Selanjutnya, masing-masing plasmid pt-mgh dipotong dengan enzim restriksi yang sesuai dengan situs pemotongan yang dipasang diawal pada pembuatan primer. Sehingga, didapatkan hasil pemotongan pada Gambar 8 terdapat dua pita, pita pertama merupakan pgem-t Easy yang berukuran sekitar 3,0 kb, sedangkan pita kedua merupakan fragmen DNA mature (mgh) berukuran sekitar 0,5 kb yang telah terlepas dari plasmid pt-mgh yang dipotong dengan enzim restriksi. 2 1 M 2 1 M 2 1 M kb - 10,0 pgem-t Easy mgh - 3,0-2,0-1,0-0,5 pt/el-mgh pt/cc-mgh pt/og-mgh Gambar 8. Pemotongan pt-mgh dengan enzim restriksi untuk mengeluarkan mgh.

23 Preparasi Vektor Ekspresi. Vektor ekspresi yang digunakan adalah pcold 1 DNA merupakan vektor ekspresi yang dapat diinduksi dengan kejutan dingin, berukuran 4,4 kb yang merupakan plasmid DNA sirkular tertutup, sehingga untuk menyambungkan fragmen DNA GH mature ke plasmid tersebut dan menyiapkan tempat ligasi maka plasmid pcold 1 DNA perlu dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan yang digunakan untuk mengisolasi fragmen DNA mgh dari plasmid pt-mgh masing-masing ikan (El-mGH, Og-mGH, dan Cc-mGH). kb M 1 2 3 4 M 10,0-5,0-3,0-2,0-1,0-0,5-0,2 - Gambar 9. Pemotongan vektor ekspresi pcold 1 DNA dengan enzim restriksi. M: marka panjang fragmen DNA; angka 1: pcold 1 yang belum didigesti, angka 2: pcold 1 yang didigesti dengan enzim restriksi BamHI dan SalI, angka 3: pcold 1 yang didigesti dengan enzim restriksi XhoI dan HindIII, dan angka 4: pcold 1 yang didigesti dengan enzim restriksi BamHI dan EcoR. Mobilitas fragmen DNA pcold 1 hasil digesti berbentuk linier dalam gel agarosa sehingga menjadi lebih lambat dibandingkan dengan plasmid pcold 1 berbentuk sirkular (Gambar 9; kolom 1), sehingga ukurannya terlihat lebih besar (Gambar 9; kolom 2, 3, dan 4). Ligasi Fragmen mgh dan Transformasi ke E. coli DH5α. Fragmen DNA mgh yang telah dipotong dan dipurifikasi dari vektor kloning pgem-t Easy kemudian disambungkan dengan Vektor Ekspresi pcold 1 DNA yang juga sudah dipotong dengan enzim restriksi yang sama (Gambar 9). Selanjutnya untuk perbanyakan secara in vivo diintroduksikan ke dalam bakteri E. coli DH5α yang ditumbuhkan pada media 2xYT + Ampisilin. Untuk mengetahui keberhasilan transformasi, dilakukan seleksi koloni bakteri yang mambawa vektor Ekspresi pcold 1 DNA yang mengandung fragmen

24 DNA mgh dengan metode cracking bakteri. Ukuran plasmid yang dihasilkan menjadi lebih besar dibandingkan dengan ukuran plasmid pcold 1. Plasmidplasmid pcold-mgh tersebut selanjutnya disekuensing untuk mengetahui klon bakteri yang membawa mgh dengan sekuens DNA yang menyandikan asam amino lengkap dan sesuai dengan yang dilaporkan peneliti-peneliti sebelumnya. Dari hasil sekuensing, diperoleh 1 klon untuk pcold/og-mgh, 2 klon untuk pcold/el-mgh dan 2 klon untuk pcold/cc-mgh (Gambar 10) DH5α: pcold El-mGH DH5α: pcold Og-mGH DH5α: pcold Cc-mGH Gambar 10. Klon bakteri E. coli DH5α yang mengandung pcold-mgh Isolasi plasmid pcold 1 mgh dan Analisis Urutan Nukleotida. Plasmid pcold 1 yang mengandung fragmen mgh selanjutnya di isolasi dari klon bakteri E. coli DH5α hasil transformasi, kemudian disekuensing untuk menganalisis urutan nukleotida yang telah tersambung pada vektor ekspresi pcold 1 DNA (Lampiran 9 dan 10). Urutan nukleotida yang diperoleh dari hasil sekuensing disejajarkan dengan sekuens mgh dari data Genbank dengan menggunakan program GENETYX version7 untuk melihat kesamaan dan keberhasilan ligasi sekuens mgh ke vektor ekspresi (Lampiran 11 dan 12). Hal ini menunjukkan bahwa urutan nukleotida plasmid pcold 1 yang mengandung mgh ikan kerapu kertang dan ikan mas hasil sekuensing memiliki tingkat kesamaan sekitar 99% dengan sekuens GH mature dari data Genbank. Hal ini menunjukkan bahwa proses ligasi atau penyambungan sekuens mgh ke dalam plasmid pcold 1 berhasil dilakukan. Transformasi ke Bakteri Ekspresi E. coli BL21. Plasmid pcold 1 yang mengandung GH mature hasil isolasi dari bakteri konstrusiksi E. coli DH5α yang telah sekuensing kemudian di transformasikan ke dalam bakteri ekspresi E. coli

25 BL21 untuk mengekspresikan protein rekombinan hormon pertumbuhan (rgh) ikan kerapu kertang, ikan gurame, dan ikan mas. Selanjutnya untuk menseleksi koloni yang mengandung pcold 1 yang membawa sisipan sekuens mgh dilakukan dengan metode cracking bakteri kemudian dielektroforesis pada gel agarose 0,7%. Pada vektor ekspresi pcold 1 DNA tidak memiliki gen penanda LacZ seperti pada vektor pgem-t Easy, sehingga tidak menyebabkan koloni bakteri hasil transformasi tumbuh berwarna putih-biru, sehingga untuk memastikan gen traget tersambung pada plasmid dan berhasil ditransformasikan maka cracking dilakukan pada bakteri hasil transformasi dengan memilih 16 klon tunggal yang berukuran besar (Gambar 11). kb 10,0-5,0-3,0 - M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 (a) kb 10,0-5,0-3,0 - M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 (b) kb 10,0-5,0-3,0 - M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 (c) Gambar 11. Elektroforesis hasil cracking pcold-mgh dari bakteri E. coli BL21. M: marka panjang fragmen DNA; angka di sebelah kiri: ukuran fragmen DNA marka; angka 1-16 adalah nomor klon bakteri hasil transformasi pcold-mgh; Gambar (a) hasil transformasi pcold/elmgh; Gambar (b) hasil transformasi pcold/og-mgh; dan Gambar (c) hasil transformasi pcold/cc-mgh. Hasil cracking didapatkan sebagian besar klon bakteri E. coli BL21 membawa plasmid pcold-mgh. Selanjutnya PCR dilakukan untuk mengetahui klon bakteri E. coli BL21 yang membawa plasmid pcold-mgh dengan arah ligasi mgh yang benar. DNA produk PCR dengan ukuran sekitar 0,65 kb (sekitar 0,6 kb fragmen DNA mgh dan 0,05 kb fragmen DNA pcold 1) diperoleh pada sampel no. 1, 2, 4, 5 dan 8, yang berarti bahwa klon bakteri tersebut mengandungkan plasmid pcold-mgh dengan orientasi ligasi mgh benar (Gambar 12).

26 kb 1,0-0,5-0,3 - M 1 2 3 4 5 6 7 8 M Gambar 12. Produk PCR dalam uji orientasi ligasi fragmen DNA mgh pada pcold 1. M: marka panjang fragmen DNA; angka di sebelah kiri: ukuran fragmen DNA marka. Dari hasil uji orientasi arah ligasi didapatkan 10 klon untuk pcold/ogmgh, 10 klon untuk pcold/el-mgh dan 6 klon untuk pcold/cc-mgh, selanjutnya klon bakteri E. coli BL21 yang membawa plasmid pcold-mgh tersebut dikultur dan diremajakan untuk memproduksi protein rgh (Gambar 13). BL21 : pcold/el-mgh BL21 : pcold/og-mgh BL21 : pcold/ Cc-mGH Gambar 13. Hasil kultur klon bakteri E. coli BL21 yang telah diseleksi positif mengandung pcold-mgh dengan arah orientasi ligasi mgh yang benar. Produksi Protein rgh Ekspresi dan Analisis Protein rgh dengan Teknik SDS-PAGE. Protein rgh ikan gurame (Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH) dan ikan kerapu kertang (ElmGH) pada bakteri E. coli BL21 menggunakan vektor ekspresi pcold 1 berhasil diproduksi, sebanyak 200 ml media kultur 2xYT cair (+Ampsilin) dapat menghasilkan ±0.93 gram pelet bakteri yang mengandung rgh. Tingkat produksi protein rgh dari ikan kerapu kertang, ikan gurame, dan ikan mas diperkirakan 8-12.04% (diprediksi menggunakan software Totallab TL 120) dari total protein yang dihasilkan sel E. coli BL21. Berdasarkan banyak penelitian melaporkan bahwa ekspresi protein rekombinan hormon pertumbuhan oleh bakteri E. coli BL21 dalam bentuk insoluble protein yang terekspresi 5-10% dari total protein E.

27 coli, seperti: GH ikan nila (Rantier-Dulue et al. 1989), GH ikan tuna (Sato et al. 1988), dan GH ikan yellowfin progy (Tsai et al. 1995). Selanjutnya hasil visualisai protein rgh ditunjukkan pada Gambar 14. Tingkat produksi rgh (ukuran sekitar 25 kda, ditunjukkan dengan tanda panah) untuk ketiga sumber mgh tersebut relatif sama, meskipun jumlah dan ukuran protein lainnya bervariasi. Sementara itu, protein yang dihasilkan oleh bakteri BL21 yang hanya membawa pcold 1 tanpa fragmen mgh adalah tidak memproduksi protein rgh dan protein yang lainnya seperti halnya pada BL21 yang membawa pcold-mgh. Selanjutnya, ukuran protein rgh seperti ditunjukkan pada Gambar 14 adalah 25 kda, yang terdiri dari 22 kda prediksi ukuran rgh berdasarkan panjang fragmen DNA dan sisanya berasal dari vektor pcold 1, yaitu His-tag dan Factor Xa site. Gambar 14. SDS-PAGE protein rekombinan hormon pertumbuhan (rgh) ikan gurame (Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH) dan ikan kerapu kertang (El-mGH). M: marka ukuran protein (Prestained protein marker, Broad range 7-175; Biolabs-P7708S); angka di sebelah kiri gambar merupakan ukuran marka protein; dan N: protein dari bakteri BL21 yang membawa pcold 1 tanpa fragmen DNA mgh. Uji Bioaktivitas Protein rgh Pada Ikan Nila dengan Cara Injeksi Bioaktivitas protein rgh diketahui dengan membandingkan pertumbuhan ikan nila yang diinjeksi rgh dan ikan kontrol (yaitu ikan yang diinjeksi dengan protein dari bakteri BL21 yang mengandung pcold 1 saja dan yang diinjeksi

Bobot ikan nila (gram) 28 dengan PBS saja). Seperti ditunjukkan pada Gambar 15, pertambahan bobot ikan nila yang diinjeksi dengan rgh lebih tinggi (P<0.1) dibandingkan dengan kontrol (PBS dan pcold 1). Hal ini menandakan bahwa protein rgh yang dihasilkan tersebut ikut berperan dalam meningkatkan pertumbuhan ikan. 50 45 40 35 30 25 20 15 PBS pcold1 Og-mGH Cc-mGH El-mGH 10 1 2 3 4 5 6 7 8 Minggu ke- Gambar 15. Laju pertumbuhan bobot ikan nila per minggu yang disuntik dengan PBS dan pcold 1 (sebagai kontrol) dan protein rgh ikan kerapu kertang (El-mGH), ikan gurame (Og-mGH) dan ikan mas (CcmGH). Pertambahan bobot ikan nila yang diinjeksi dengan rgh El-mGH (20,94%) terlihat sedikit lebih tinggi dibandingkan dengan kedua rgh lainnya (18,09% untuk Cc-mGH dan 16,99% untuk Og-mGH) (Gambar 16). Hal ini diduga karena perbedaan respons ikan nila dalam menerima rgh dari ikan kerapu kertang lebih baik dari rgh ikan gurame dan ikan mas. Pertambahan bobot ikan nila yang diberi perlakuan injeksi rgh terlihat cukup tinggi setelah penyuntikan keempat. Respons yang lambat tersebut diduga terjadi karena reseptor memerlukan faktor intermediet atau waktu untuk mengenali rgh yang diinjeksikan. Selanjutnya, secara umum ikan yang diberi perlakuan rgh menunjukkan peningkatan nafsu makan yang ditunjukkan dengan tingkah laku yang agresif pada saat pemberian pakan. Hal yang sama juga dilaporkan pada ikan mas yang diinjeksikan rgh ikan giant catfish (Promdonkoy et al. 2004).

29 a ab abc bc c Gambar 16. Pertambahan bobot (g) ikan nila yang disuntik protein rgh ikan gurame (Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH) dan ikan kerapu kertang (El-mGH). Protein total dari 1 µg bakteri per gram ikan nila disuntikkan sekali seminggu selama 4 minggu, dan pertumbuhan ikan diukur setiap minggu selama 2 bulan. PBS kontrol: ikan nila disuntik dengan PBS; dan pcold 1: ikan nila disuntik dengan protein dari bakteri BL21 yang mengandung plasmid pcold 1 tanpa fragmen DNA mgh. Banyak penelitian tentang pemanfaatan rgh ikan untuk memacu laju pertumbuhan ikan budidaya seperti rgh ikan giant catfish oleh Promdonkoy et al. (2004), rgh ikan yellowfin porgy oleh Tsai et al. (1997) dan yang lainnya menyatakan bahwa sintesis protein rgh di dalam bakteri E. coli yang diuji akttivitas biologinya mempunyai potensi yang sama dengan GH alami yang dimiliki oleh spesies tersebut, walaupun kita belum mampu membandingkan aktivitas rgh yang kita cobakan dengan hormon alaminya. Namun dari hasil penelitian ini menunjukkan bahwa rgh yang diproduksi di dalam bakteri E. coli mempunyai aktivitas biologi, sehingga dapat diaplikasikan dalam kegiatan budidaya perikanan secara luas. Pada penelitian ini, deliveri rgh dilakukan menggunakan metode injeksi. Dengan pertimbangan teknis dan efisiensi aplikasi rgh dalam budidaya ikan, penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui metode pemberian rgh yang cocok serta apakah bioktivitas rgh yang diberikan mulai pada fase larva. Hasil penelitian Tsai et al. (1997) menunjukkan peningkatan laju pertumbuhan hingga 60% pada juvenil ikan kakap hitam yang diberikan rgh melalui pakan.

30 Selain itu hasil penelitian Acosta et al. (2007) pada ikan nila merah menunjukkan respons yang sangat signifikan (lebih dari 100% dibandingkan kontrol) dengan memberikan rgh dari ikan nila melalui perendaman pada larva. Pemberian rgh melalui pakan yang dicampur rgh serta melalui perendaman larva dalam media mengandung rgh secara teknis lebih praktis untuk diaplikasikan dibandingkan dengan metode injeksi. Banyak penelitian tentang pemanfaatan rgh ikan untuk memacu laju pertumbuhan ikan budidaya seperti rgh ikan giant catfish oleh (Promdonkoy et al. 2004), rgh ikan yellowfin porgy oleh (Tsai et al. 1997) dan yang lainnya menyatakan bahwa sintesis protein rgh didalam bakteri E. coli yang diuji akttivitas biologinya mempunyai potensi yang sama dengan GH alami yang dimiliki oleh organisme tersebut, walaupun kita belum mampu membandingkan aktivitas rgh yang kita cobakan dengan hormon alaminya. Namun dari hasil penelitian ini menunjukkan bahwa rgh yang diproduksi didalam bakteri E. coli mempunyai aktivitas biologi, sehingga dapat diaplikasikan dalam kegiatan budidaya perikanan secara luas.