MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Nutrisi Ternak Perah serta Laboratorium Biokimia, Fisiologi dan Mikrobiologi Nutrisi, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Waktu pelaksanaan selama 3 bulan dari bulan Februari - Mei 2012. Materi Alat Peralatan yang dipergunakan dalam pengujian fermentatif rumen antara lain neraca analitik, eksikator, tabung gas CO 2, termos, kain penyaring, shaker waterbath, cawan Conway, sentrifus, pompa vakum, labu penyuling, labu Erlenmeyer, oven 105 C, tanur, magnetic stirrer, destilator, buret, kondensor, tabung fermentor, tutup karet, pipet volumetik, cawan porselen. Peralatan yang dipergunakan dalam pengujian populasi protozoa adalah mikroskop dan counting chamber. Bahan Ternak dan Pakan. Cairan rumen sapi yang digunakan diambil dari ternak sapi Peranakan Ongole yang berada di Rumah Potong Hewan (RPH) Kota Bogor, Bubulak, Bogor. Ransum perlakuan adalah ransum komplit A (energi tinggi) dan B (energi rendah) (rasio hijauan : konsentrat masing-masing adalah 40:60 dan 50:50) dan asam fulvat. Komposisi dan kandungan nutrien ransum komplit dapat dilihat pada Tabel 1 dan Tabel 2. Asam Fulvat. Asam fulvat yang digunakan berasal dari produk pupuk cair. Asam fulvat yang digunakan diencerkan dengan konsentrasi 10%, larutan Mc Dougal sebagai pengencernya. Pemberian asam fulvat ini dilakukan sebelum pemberian larutan Mc Dougal di tabung fermentor. Tingkat keasaman (ph) asam fulvat sebesar 9,40. Kandungan mineral produk ini disajikan pada Tabel 3. 11
Tabel 1. Komposisi Bahan Pakan Ransum Komplit Bahan Pakan Jenis Ransum Komplit 1 (%) Ransum A (Energi Tinggi) 2 Ransum B (Energi Rendah) 3 Rumput Gajah 40,00 50,00 Dedak Halus 6,00 8,00 Jagung 20,30 14,32 Pollard 5,80 5,00 Bungkil Kelapa 24,00 18,00 Bungkil Kedelai 2,00 2,86 CaCO 3 1,90 1,83 1 Berdasarkan BK yang disusun menggunakan program Winfeed. 2 Ransum disusun berdasarkan Kearl (1982) untuk sapi dengan bobot badan 350 kg dengan pertambahan bobot badan 1kg/ekor/hari; kebutuhan TDN 66,00%, PK 10,30%, Ca 0,35% dan P 0,25%. 3 Ransum disusun berdasarkan NRC (1988) untuk sapi dengan bobot badan 400 kg dengan produksi susu 15 liter dan kadar lemak susu 4%; kebutuhan TDN 62,19%, PK 13,03%, Ca 0,50% dan P 0,32%. Tabel 2. Kandungan Nutrien Ransum Komplit Kandungan Nutrien 1 Jenis Ransum Komplit (%BK) Ransum A (Energi Tinggi) Ransum B (Energi Rendah) Bahan Kering (%) 90,25 89,94 Abu (%) 10,26 12,68 Protein Kasar (%) 15,63 15,09 Lemak Kasar (%) 3,13 3,35 Serat Kasar (%) 20,27 23,56 Beta-N (%) 50,71 45,33 TDN (%) 2 66,96 62,38 Ca (%) 1,77 2,44 P (%) 0,40 0,63 1 Analisis Proksimat Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, IPB (2012) 2 Berdasarkan perhitungan (Hartadi, 1980) Rumus TDN = 92,464 - (3,338 x SK) (6,945 x LK)- (0,762 x Beta-N) + (1,115 x PK) + (0,031 x SK 2 ) (0,133 x LK 2 ) + (0,036 x SK x Beta-N) + (0,207 x LK x Beta-N) + (0,1 x LK x PK) (0,022 x LK x PK) 12
Tabel 3. Kandungan Mineral Produk Asam Fulvat Mineral Konsentrasi C 12,9% N 0,51% P 0,04% Na 22,19% K Ca Fe Zn 109,90 ppm 8,23 ppm 4,08 ppm 44,85 ppm Sumber: Laboratorium Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian, IPB (2012). Bahan Kimia. Bahan yang dibutuhkan untuk pembuatan 6 liter larutan Mc Dougal antara lain NaHCO 3 (58,8 g), Na 2 HPO 4.7H 2 O (42 g), KCl (3,42 g), NaCl (2,82 g), MgSO 4.7H 2 O (0,72 g) dan CaCl 2 (0,24 g). Bahan yang dibutuhkan untuk uji KCBK dan KCBO antara lain larutan HgCl 2 jenuh, kertas saring, dan aquades. Bahan yang dibutuhkan untuk uji NH 3 antara lain asam borat, Na 2 CO 3 jenuh, dan H 2 SO 4 0,005 N. Bahan yang digunakan untuk uji VFA antara lain NaOH 0,5 N, HCl 0,5 N dan H 2 SO 4 15%. Bahan yang digunakan untuk pengamatan protozoa yaitu TBFS (Trypan Blue Formalin Salin). Prosedur Pengambilan Cairan Rumen Metode Cairan rumen diambil dari rumah pemotongan hewan dengan menggunakan termos. Termos yang akan dipakai terlebih dahulu diisi dengan air panas sehingga suhunya mencapai 39 C kemudian ditutup. Cairan rumen diperas dengan menggunakan kain kasa dan dimasukkan ke dalam termos tersebut. Sebelum digunakan, air panas yang ada di dalam termos dibuang terlebih dahulu. Untuk menjaga agar cairan rumen tetap dalam kondisi anaerob, termos harus segera ditutup rapat dan dialiri gas CO 2 sebelum digunakan. 13
Prosedur Pembuatan Larutan Mc Dougal Dalam pembuatan larutan Mc Dougal sebanyak 6 liter maka sebanyak 5 liter air destilasi dimasukkan ke dalam labu takar yang bervolume 6 liter. Selanjutnya bahan-bahan sebagai berikut NaHCO 3 (58,8 g), Na 2 HPO 4.7H 2 O (42 g), KCl (3,42 gram), NaCl (2,82 g), MgSO 4.7H 2 O (0,72 g) dan CaCl 2 (0,24 g) dimasukkan dan dilarutkan. Kemudian ditambahkan CaCl 2 setelah semua bahan larut. Lalu leher labu dicuci dengan air destilasi hingga permukaan air mencapai tanda tera. Campuran lalu dikocok dengan gas CO 2 secara perlahan-lahan dengan cara melewatkannya sampai ph larutan mencapai 7. Prosedur Fermentasi Pakan. Tabung fermentor yang telah diisi dengan 0,5 g sampel ransum perlakuan ditambahkan 10 ml cairan rumen dan 40 ml larutan Mc Dougal. Tabung fermentor dikocok dengan cara mengaliri gas CO 2 selama 30 detik (ph 6,5-6,9) dan ditutup dengan karet berventilasi. Tabung dimasukkan ke dalam shaker waterbath dengan suhu 39 C, dilakuan fermentasi selama 4 jam untuk sampel VFA/NH 3 dan fermentasi 48 jam untuk sampel KCBK/KCBO. Untuk menghentikan fermentasi tutup karet berventilasi dibuka dan ditetesi 2 tetes HgCl 2 jenuh untuk menghentikan aktivitas mikroba. Prosedur Pengukuran ph Rumen Pengukuran ph dilakukan pada sampel inkubasi 4 jam dengan menggunakan ph meter yang telah dikalibrasi. Nilai ph yang diambil yaitu nilai ph yang konsisten. Prosedur Pengukuran Kecernaan Bahan Kering dan Bahan Organik (Tilley&Terry, 1963) Prosedur Pembuatan Larutan Pepsin. Untuk membuat 1 liter larutan pepsin dibutuhkan sebanyak 2,5 g pepsin yang dilarutkan dalam 800 ml aquades, kemudian pada ruang larutan yang sudah dibuat ditambahkan 17,8 ml larutan HCl 0,2%. Aquades ditambahkan hingga mencapai tanda tera. Prosedur Pencernaan Fermentatif. Sebanyak 0,5 g sampel pakan dimasukkan kedalam tabung fermentor, ditambahkan 10 ml larutan buffer Mc Dougal dan 40 ml cairan rumen lalu diaduk dengan gas CO 2 selama 30 detik dan ditutup rapat. Tabung 14
fermentor ditempatkan pada suhu 39 C dan fermentasi dibiarkan berlangsung selama 48 jam. Setiap 6 jam, tabung diaduk dengan gas CO 2. Prosedur Pencernaan Hidrolisis. Setelah diinkubasi selama 48 jam, ditambahkan 2-3 tetes HgCl 2 jenuh untuk menghentikan aktivitas mikroba. Lalu disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit dan supernatannya dibuang, kedalam tabung ditambahkan 50 ml larutan pepsin HCl 0,2%. Pencernaan enzimatis berlangsung aerob selama 48 jam. Hasil pencernaan hidrolisis (residu) disaring menggunakan kertas Whatman no. 41 yang dibantu dengan pompa vakum. Kemudian residu tersebut dimasukkan kedalam cawan porselen dan dipanaskan di dalam oven suhu 105 C selama 24 jam untuk menentukan BK residu. Selanjutnya residu BK dimasukan dalam tanur selama 6 jam untuk mendapatkan residu bahan organik. Kemudian KCBK dan KCBO dihitung berdasarkan rumus: Prosedur Pengukuran Konsentrasi Volatile Fatty Acids (VFA). Pengukuran konsentrasi VFA dengan menggunakan metode steam destilasi (General Laboratory Procedures, 1966). Pengukuran dengan penggunaan air yang dididihkan terlebih dahulu dan air dialirkan ke kondensor atau pendingin. Kemudian dimasukkan 5 ml sampel dan 1 ml H 2 SO 4 15% ke dalam alat destilasi. VFA yang dihasilkan ditangkap dengan 5 ml NaOH 0,5 N yang dimasukkan dalam labu erlenmeyer. Cairan ditampung hingga mencapai 250-300 ml setelah itu ditambahkan dengan indikator PP (Phenolpthaline) sebanyak 2-3 tetes dan dititrasi dengan larutan HCl 0,5 N sampai warna titrat berubah dari merah jambu menjadi tidak berwarna. Produksi VFA total yang dihasilkan, dihitung dengan rumus : Produksi VFA = [(ml titran blanko-ml titran sample) x N HCl x 1000/5] mm Prosedur Pengukuran Konsentrasi Amonia (NH 3 ). Pengukuran konsentrasi NH 3 menggunakan metode Mikrodifusi Conway (General Laboratory Procedures, 1966). Sebelum digunakan bibir cawan Conway diolesi dengan vaselin. Supernatan yang dihasilkan dari proses fermentasi dengan inkubasi 4 jam diambil 1 ml, kemudian 15
ditempatkan pada salah satu ujung alur cawan Conway, pada ujung satunya dimasukkan 1 ml Na 2 CO 3 jenuh. Antara supernatan dan Na 2 CO 3 tidak boleh bercampur. Larutan asam borat berindikator sebanyak 1 ml ditempatkan dalam cawan kecil yang terletak di tengah cawan Conway, kemudian cawan Conway langsung ditutup rapat hingga kedap udara. Setelah itu cawan Conway digoyang-goyangkan hingga supernatan dan NaCO 3 tercampur rata, dan dibiarkan dalam suhu ruang selama 24 jam. Setelah 24 jam asam borat berindikator dititrasi dengan H 2 SO 4 0,005 N sampai terjadi perubahan warna dari biru menjadi merah. Kemudian konsentrasi NH 3 dihitung berdasarkan rumus: Konsentrasi NH 3 = [ml H 2 SO 4 x N H 2 SO 4 x 1000] mm Prosedur Perhitungan Populasi Protozoa. Populasi protozoa dihitung dengan menggunakan counting chamber dan larutan TBFS. Tahapan perhitungannya yaitu sampel hasil fermentasi 4 jam dicampur larutan TBFS dengan perbandingan 1:1. Sampel cairan tersebut diteteskan pada counting chamber dengan ketebalan 0,2 mm, luas kotak terkecil 0,0625 mm 2 dan terdiri dari 16x16 buah kotak. Populasi protozoa diamati dengan mikroskop pada perbesaran 400x. Populasi protozoa dihitung dengan rumus: Keterangan: C = jumlah koloni yang dihitung Fp = faktor pengencer Rancangan Percobaan dan Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Kelompok (RAK) faktorial 2x5 dengan 3 ulangan. Faktor pertama adalah jenis ransum (ransum energi tinggi dan ransum energi rendah) dan faktor kedua adalah taraf suplementasi asam fulvat (0%; 2,5%; 5%; 7,5%; 10%). Ulangan berdasarkan waktu pengambilan cairan rumen. Peubah yang diamati adalah nilai derajat keasaman (ph) rumen, kecernaan bahan kering, kecernaan bahan organik, konsentrasi VFA dan NH 3 serta populasi protozoa. Adapun rancangan percobaanya disajikan pada Gambar 5. 16
0% Asam Fulvat 2,5% Asam Fulvat Ransum A (Energi Tinggi) 5% Asam Fulvat 7,5% Asam Fulvat 10% Asam Fulvat Ransum Komplit 0% Asam Fulvat 2,5% Asam Fulvat Ransum B (Energi Rendah) 5% Asam Fulvat 7,5% Asam Fulvat 10% Asam Fulvat Gambar 5. Diagram Rancangan Percobaan Model matematik dari rancangan adalah sebagai berikut : Y ijk = µ + i + j + i j + k + ijk Keterangan : Y ijk : nilai faktor A ke-i, faktor B ke-j, dan pengamatan kelompok ke-k µ : rataan umum i j i j k ijk : pengaruh faktor A (jenis ransum komplit) : pengaruh faktor B (taraf suplementasi asam fulvat) : pengaruh interaksi faktor A ke-i dan faktor B ke-j : pengaruh kelompok (waktu pengambilan cairan rumen) ke-k : galat perlakuan faktor A ke-i, faktor B ke-j dan kelompok ke-k Data yang diperoleh dari penelitian dianalisa menggunakan analisis ragam (Analysis of Variance, ANOVA) dan dilanjutkan dengan Uji Duncan. Analisis data menggunakan software statistik SPSS 17. 17