BAB II TINJAUAN PUSTAKA Tuberkulosis atau TB adalah suatu penyakit yang disebabkan oleh bakteri tahan asam (BTA, Mikobakterium tuberkulosa) yang ditularkan melalui udara. Berdasarkan tempat atau organ yang diserang oleh mikobakterium tuberkulosa, maka tuberkulosis dibedakan menjadi tuberkulosis paru dan tuberkulosis ekstra paru. 1. Tuberkulosis Paru adalah tuberkulosis yang menyerang jaringan parenkim paru, tidak pleura(selaput paru 2. Tuberkulosis Ekstra Paru adalah tuberkulosis yang menyerang organ tubuh selain paru, misalnya Selaput otak, kelenjar lymfe, tulang, persendiaan, kulit, usus, ginjal, saluran kencing. Obat yang digunakan untuk penyakit ini dibagi atas 2 golongan besar, yaitu: 3. Golongan I : isoniazid (INH), rifampisin, etambutol, streptomisin, pirazinamid 4. Golongan II : para amino salisilat (PAS), etionamid, kanamisin, sikloserin, kapreomisin dan amikasin (Agoes. dkk. 1994; Dirjen PP&PL, Kemenkes RI. 2011).
2.1 Pirazinamida 2.1.1 Sifat Fisikokimia Rumus Struktur : Rumus Molekul : C 5 H 5 N 3 O Sinonim : Pirazinkarboksamida Berat Molekul : 123,11 Suhu Lebur : Antara 188 0 dan 191 0. Pemerian : Serbuk hablur, putih hingga praktis putih; tidak berbau atau praktis tidak berbau. Kelarutan : Agak sukar larut dalam air; sukar larut dalam etanol, dalam eter dan dalam kloroform. 2.1.2 Farmakologi Pirazinamida adalah suatu obat antituberkulosis yang dibuat secara sintetik dan efektif digunakan bersama-sama dengan isoniazid dan rifampisin. Pirazinamida bersifat bakterisidal terhadap organisme intrasel. Pirazinamida dihidrolisis secara enzimatik menjadi asam pirazinoat yang merupakan metabolit aktif utama dari pirazinamida. Asam pirazinoat selanjutnya dihidroksilasi menjadi 5-asam hidroksipirazinoat oleh xantin oksidase. Metabolit pirazinamida
ini diekskresikan melalui urin. Pirazinamida mudah diserap diusus dan disebarkan ke seluruh tubuh (Mycek, dkk. 2001; Zubaidi. 2007). Pirazinamida adalah salah satu obat garis depan yang ditentukan untuk pengobatan Mycobacterium tuberculosis. Dianggap sebagai prodrug dari asam pirazinoat, yang dipercaya sebagai inhibitor aktif M. tuberculosis. Asam pirazinoat merupakan metabolit aktif utama dari pirazinamida, yang dihasilkan oleh liver mikrosomal deamidase kemudian asam pirazinoat ini selanjutnya dihidroksilasi menjadi 5-asam hidroksipirazinoat oleh xantin oksidase. Jalur metabolit lainnya, pirazinamida dioksidasi langsung menjadi 5-hidroksipirazinamida oleh xantin oksidase. Ketiga metabolit pirazinamida ini terutama diekskresikan dalam urin. Konsentrasi serum 30-50 μg/ml pada 1-2 jam setelah pemberian oral dicapai dengan dosis 25 mg/kg/hari. Pirazinamida dapat dengan baik diserap dari saluran cerna dan secara luas didistribusikan pada jaringan tubuh, termasuk selaput otak yang terinfeksi. Waktu paruhnya adalah 8-11 jam. Pirazinamida merupakan suatu obat fase awal pengobatan yang penting dan digunakan bersama dengan isoniazid dan rifampin dalam pemberian jangka pendek (yaitu 6 bulan) sebagai suatu agen sterilisator aktif untuk melawan sisa-sisa organisme intraseluler yang dapat mengakibatkan kekambuhan (Crofton.2002). 2.1.3 Efek Samping Efek sampingnya yang sering kali terjadi dan berbahaya adalah kerusakan hati dan ikterus (hepatotoksis), terutama pada dosis di atas 2 g sehari. Pengobatan harus segera dihentikan bila ada tanda-tanda kerusakan hati (Tjay dan Rahardja, 2002).
Keamanan penggunaan pada anak-anak belum ditetapkan. Hati-hati penggunaan pada penderita dengan encok atau riwayat encok keluarga atau diabetes mellitus; dan penderita dengan fungsi ginjal tak sempurna; penderita dengan riwayat tukak lambung (Depkes. 2005). 2.1.4 Dosis Dewasa dan anak sebanyak 15-30 mg/ kg BB, satu kali sehari atau 50-70 mg/ kg BB 2-3 kali seminggu. Obat ini dipakai bersamaan dg obat anti tuberkulosis lainnya. 2.1.5 Sediaan Dalam perdagangan pirazinamida tersedia dalam bentuk tablet mengandung 500mg/tablet (ISO, 2009). 2.2 Spektrofotometri Ultraviolet 2.2.1 Teori Spektrofotometri Ultraviolet Spektrofotometri serapan merupakan pengukuran suatu interaksi antara radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia. Teknik yang sering digunakan dalam analisis farmasi meliputi spektrofotometri ultraviolet, cahaya tampak, infra merah dan serapan atom. Jangkauan panjang gelombang untuk daerah ultraviolet adalah 190-380 nm, daerah cahaya tampak 380-780 nm, daerah inframerah dekat 780-3000 nm, dan daerah inframerah 2,5-40 µm (Ditjen POM, 1995).
Sinar ultraviolet dan sinar tampak memberikan energi yang cukup untuk terjadinya transisi elektronik. Transisi-transisi elektronik akan meningkatkan energi molekuler dari keadaan dasar ke satu atau lebih tingkat energi tereksitasi. Jika suatu molekul sederhana dikenakan radiasi elektromagnetik maka molekul tersebut akan menyerap radiasi elektromagnetik yang energinya sesuai. Interaksi antara molekul dengan radiasi elektromagnetik ini akan meningkatkan energi potensial elektron dari tingkat dasar ke tingkat tereksitasi. Apabila pada molekul yang sederhana tadi hanya terjadi transisi elektronik pada satu macam gugus yang terdapat pada molekul, maka hanya akan terjadi satu absorpsi yang merupakan pita spektrum. Terjadinya dua atau lebih pita spektrum diberikan oleh molekul dengan struktur yang lebih kompleks karena terjadi beberapa transisi sehingga mempunyai lebih dari satu panjang gelombang (Rohman dan Gandjar, 2007). Gugus fungsi yang menyerap radiasi di daerah ultraviolet dekat dan daerah tampak disebut gugus kromofor dan hampir semua gugus ini mempunyai ikatan tak jenuh. Pada kromofor jenis ini transisi terjadi dari π π*, yang menyerap pada panjang gelombang maksimum kecil dari 200 nm (tidak terkonyugasi), misalnya pada >C=C< dan C C. Kromofor ini merupakan tipe transisi dari sistem yang mengandung elektron π pada orbital molekulnya. Untuk senyawa yang mempunyai sistem konyugasi, perbedaan energi antara keadaan dasar dan keadaan tereksitasi menjadi lebih kecil sehingga penyerapan terjadi pada panjang gelombang yang lebih besar (Dachriyanus, 2004). Gugus fungsi seperti -OH, -O, -NH 2, dan -OCH 3 yang memberikan transisi n π* disebut gugus auksokrom. Gugus ini adalah gugus yang tidak
dapat menyerap radiasi ultraviolet-sinar tampak, tetapi apabila gugus ini terikat pada gugus kromofor mengakibatkan pergeseran panjang gelombang ke arah yang lebih besar (pergeseran batokromik). Hal hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektrofotometri ultraviolet antara lain: 1. Pemilihan panjang gelombang maksimum Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang dimana terjadi serapan maksimum. Panjang gelombang serapan maksimum, dapat diperoleh dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu. Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan panjang gelombang maksimal, yaitu: Pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang gelombang maksimal tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar. Disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar dan pada kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi. Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang terjadi pada pengulangan akan kecil sekali, karena digunakan panjang gelombang maksimal. 2. Pembuatan kurva kalibrasi Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai konsentrasi. Masing-masing absorbansi larutan tersebut diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi dengan
konsentrasi. Bila hukum Lambert- Beer terpenuhi maka kurva kalibrasi merupakan garis lurus. 3. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer sebaiknya antara 0,2-0,6 karena pada kisaran nilai tersebut, kesalahan fotometrik yang terjadi adalah paling minimal (Rohman dan Gandjar, 2007). 2.2.2 Hukum Lambert-Beer Menurut Hukum Lambert, serapan berbanding lurus terhadap ketebalan sel yang disinari. Sedangkan menurut Beer, serapan berbanding lurus dengan konsentrasi, ini berlaku untuk radiasi monokromatis dalam larutan yang sangat encer. Kedua pernyataan ini dapat dijadikan satu dalam Hukum Lambert-Beer, sehingga diperoleh bahwa serapan berbanding lurus terhadap konsentrasi dan ketebalan sel, yang dapat ditulis dengan persamaan: A= a.b.c (g/liter) atau A= ε. b. c (mol/liter) Dimana: A = serapan a = absorptivitas b = ketebalan sel c = konsentrasi ε = absorptivitas molar Berdasarkan Hukum Lambert-Beer yang menjadi dasar aspek kuantitatif pada spektrofotometri: konsentrasi dapat dihitung dari ketebalan sel dan serapan. Absorptivitas merupakan suatu tetapan dan spesifik untuk setiap molekul pada panjang gelombang dan pelarut tertentu (Day dan Underwood, 1999; Rohman dan Gandjar, 2007).
Menurut Roth dan Blaschke (1981), absorptivitas spesifik (A 1 ) juga 1 sering digunakan untuk menggantikan absorptivitas. Harga ini, memberikan serapan larutan 1 % (b/v) dengan ketebalan sel 1 cm, sehingga dapat diperoleh persamaan: A = A 1. b. c 1 Dimana : A 1 1 = absorptivitas spesifik b = ketebalan sel c = konsentrasi senyawa terlarut (g/100ml larutan) 2.2.3 Penggunaan Spektofotometri Ultraviolet Spektrofotometri ultraviolet digunakan dalam analisis senyawa organik yaitu: 1. Analisis kualitatif Secara eksperimental, sangat mudah untuk mengukur banyaknya radiasi yang diserap oleh suatu molekul sebagai fungsi frekuensi radiasi. Suatu grafik yang menghubungkan antara banyaknya sinar yang diserap dengan frekuensi (panjang gelombang) sinar merupakan spektrum absorpsi. Transisi yang terjadi untuk suatu molekul dengan struktur kimia yang berbeda tidaklah sama sehingga spektrum absorpsinya juga berbeda. Dengan demikian, spektrum dapat digunakan sebagai bahan informasi yang bermanfaat untuk analisis kualitatif (Rohman dan Gandjar, 2007). 2. Analisis kuantitatif Penggunaan utama spektrofotometri ultraviolet adalah dalam analisis kuantitatif. Apabila dalam alur spektrofotometer terdapat senyawa yang
mengabsorpsi radiasi, akan terjadi pengurangan kekuatan radiasi yang mencapai detektor. Parameter intensitas atau kekuatan energi radiasi yang diabsorpsi oleh molekul adalah absorban (A) yang dalam batas konsentrasi tertentu nilainya sebanding dengan banyaknya molekul yang mengabsorpsi radiasi dan merupakan dasar analisis kuantitatif. Konsentrasi larutan analit umumnya 10 sampai 20 µg/ l, tetapi untuk senyawa yang nilai absorptivitasnya besar dapat diukur pada konsentrasi yang lebih rendah. Senyawa yang tidak mengabsorpsi radiasi ultraviolet-sinar tampak dapat juga ditentukan dengan spektrofotometri ultraviolet-sinar tampak, apabila ada reaksi kimia yang dapat mengubahnya menjadi kromofor atau dapat disambungkan dengan suatu pereaksi kromofor (Satiadarma, 2004). Analisis kuantitatif secara spektrofotometri ultraviolet dapat dilakukan dengan metode regresi dan pendekatan. 1. Metode Regresi Analisis kuantitatif dengan metode regresi yaitu dengan menggunakan persamaan regresi yang didasarkan pada harga serapan dan konsentrasi standar yang dibuat dalam beberapa konsentrasi, paling sedikit menggunakan 5 rentang konsentrasi yang meningkat yang dapat memberikan serapan yang linier, kemudian diplot menghasilkan suatu kurva yang disebut dengan kurva kalibrasi. Konsentrasi suatu sampel dapat dihitung berdasarkan kurva tersebut. 2. Metode Pendekatan Analisis kuantitatif dengan cara ini dilakukan dengan membandingkan serapan standar yang konsentrasinya diketahui dengan serapan sampel. Konsentrasi sampel dapat dihitung melalui rumus perbandingan C= As. Cb/ Ab
dimana As= serapan sampel, Ab= serapan standar, Cb= konsentrasi standar, dan C= konsentrasi sampel (Holme dan Peck, 1983). 2.2.4 Peralatan Untuk Spektrofotometri Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitans atau serapan suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Spektrofotometer merupakan penggabungan dari dua fungsi alat yang terdiri dari spektrometer yang menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer sebagai alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi (Day dan Underwood, 1999). Unsur -unsur terpenting suatu spektrofotometer adalah sebagai berikut: 1. Sumber radiasi: lampu deuterium digunakan untuk daerah UV pada panjang gelombang dari 190-380 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau lampu tungsten digunakan untuk daerah visibel pada panjang gelombang antara 380-780 nm. 2. Monokromotor: digunakan untuk memperoleh sumber sinar yang monokromatis. Alatnya dapat berupa prisma maupun grating. Untuk mengarahkan sinar monokromatis yang diinginkan dari hasil penguraian. 3. Kuvet (sel): digunakan sebagai wadah sampel untuk menaruh cairan ke dalam berkas cahaya spektrofotometer. Kuvet itu haruslah meneruskan energi radiasi dalam dearah spektrum yang diinginkan. Pada pengukuran didaerah sinar tampak, kuvet kaca atau kuvet kaca corex dapat digunakan, tetapi untuk pengukuran pada daerah ultraviolet kita harus menggunakan sel kuarsa karena gelas tidak tembus radiasi pada daerah ini. Kuvet sinar tampak dan ultraviolet yang khas mempunyai ketebalan 1 cm, namun tersedia kuvet
dengan ketebalan yang sangat beraneka, mulai dari ketebalan kurang dari 1 milimeter sampai 10 cm bahkan lebih. 4. Detektor: Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang. 5. Amplifier (penguat) dan rangkaian yang berkaitan yang membuat isyarat listrik itu dapat dibaca. 6. Sistem pembacaan yang memperlihatkan besarnya isyarat listrik (Day and Underwood, 1999). 2.3 Validasi Validasi adalah suatu tindakan terhadap parameter tertentu pada prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Validasi dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis yang dilakukan akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis (WHO, 1989; Rohman dan Gandjar, 2007). Parameter analisis yang ditentukan pada validasi adalah akurasi, presisi, spesifikasi, limit deteksi, limit kuantitasi, linieritas dan rentang metode (Harmita, 2004; Rohman dan Gandjar, 2007). Akurasi (kecermatan) adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (% recovery) analit yang ditambahkan dan dapat ditentukan melalui dua cara yaitu metode simulasi (spiked placebo recovery) dan metode penambahan bahan baku (standard addition method). Dalam metode simulasi, sejumlah analit bahan murni (senyawa pembanding
kimia) ditambahkan ke dalam campuran bahan sediaan farmasi (plasebo), lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar standar yang ditambahkan (kadar sebenarnya). Dalam metode adisi (penambahan bahan baku), sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa ditambahkan ke dalam sampel, dicampur dan dianalisis kembali. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang diharapkan). Dalam kedua metode tersebut, persen perolehan kembali dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. A B % Perolehan Kembali = x100% C Keterangan: A = konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan baku B = konsentrasi sampel sebelum penambahan baku C = konsentrasi baku yang ditambahkan Presisi dari suatu metode analisis adalah derajat kesesuaian diantara masing-masing hasil uji, jika prosedur analisis diterapkan berulang kali pada sejumlah cuplikan yang diambil dari sampel homogen. Presisi dinyatakan sebagai deviasi standar atau deviasi standar relatif (koefisien variasi). Presisi dapat diartikan pula sebagai derajat reprodusibilitas atau keterulangan dari prosedur analisis. Ada 4 macam ukuran presisi, yaitu: a. Kisaran (range) merupakan selisih hasil penetapan yang paling besar dengan yang paling kecil. Semakin kecil selisihnya berarti hasilnya semakin tepat.
b. Deviasi rata-rata (mean deviation) merupakan deviasi masing-masing hasil penetapan terhadap rata-rata, dengan tidak memperhatikan tanda deviasinya (positif atau negatif) dan dirumuskan sebagai berikut: d = X X N c. Standar deviasi (SD) merupakan akar jumlah kuadrat deviasi masing-masing hasil penetapan terhadap mean dibagi dengan derajat kebebasannya yang dinyatakan dalam rumus berikut: ( X X ) SD = n 1 2 Keterangan: X = nilai dari masing-masing pengukuran X = rata-rata (mean) dari pengukuran n = frekuensi penetapan n-1 = derajat kebebasan d. Standar deviasi relatif (relative standard deviation, RSD) merupakan ukuran ketepatan relatif dan umumnya dinyatakan dalam persen. RSD dirumuskan dengan persamaan: SD RSD = x100% X Keterangan: RSD = Relative Standard Deviation (%) SD = Standard Deviation X = Kadar rata-rata sampel Kespesifikan dari suatu metode analisis adalah kemampuannya untuk mengukur kadar analit secara khusus dengan akurat, disamping komponen lain yang terdapat dalam matriks sampel.
Batas deteksi (limit of detection) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat terdeteksi. Batas deteksi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: 3xSB Batas deteksi = Slope Batas kuantitasi (limit of quantitation) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. 10xSB Batas Kuantitasi = Slope Kelinieran suatu metode analisis adalah kemampuan untuk menunjukkan bahwa nilai hasil uji langsung atau setelah diolah secara secara matematika, proporsional dengan konsentrasi analit dalam sampel dalam batas rentang konsentrasi tertentu. Rentang suatu metode analisis adalah interval antara batas konsentrasi tertinggi dan konsentrasi terendah analit yang dapat ditentukan dengan presisi, akurasi dan kelinieran (Rohman dan Gandjar, 2007; Satiadarma, 2004).