3. METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dimulai pada bulan Januari 2009 dan selesai pada bulan November 2009. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia dan Bioteknologi II, Departemen Teknologi Hasil Perairan (FPIK-IPB), Laboratorium Immunologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Laboratorium Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PAU) IPB. 3.2 Alat dan Bahan Bahan utama yang digunakan pada penelitian adalah ikan bandeng (Chanos chanos, Forskal) dan ikan patin (Pangasius sp.). Ikan patin dan ikan bandeng dibawa dalam keadaan hidup ke laboratorium, dimatikan dan dipreparasi untuk diambil bagian daging, kulit, dan jeroan. Bahan-bahan kimia yang digunakan untuk ekstraksi dan analisis adalah tris base (Applichem), asam sitrat (Applichem), ammonium sulfat ((NH 4 ) 2 SO 4 ), sodium fosfat (Merck), sodium azida (Merck), 2-merkaptoetanol (Sigma), asam trikloro asetat (TCA) (Merck), tirosin (Applichem), folin (Merck), hemoglobin (Sigma), commasive brilliant blue R-250 (Sigma), bovine serum albumin (BSA) (Applichem). Logam-logam yang digunakan untuk mengetahui karakterisasi enzim yaitu CaCl 2 NaCl, MnCl 2 dan CoCl 2 dari Merck. Inhibitor komersial seperti PMSF, EDTA dan pepstatin. Bahan untuk purifikasi digunakan DEAE sephadex A-50 dan sephadex-g100 (pharmacia). Penentuan berat molekul digunakan SDS poliakrilamida (SDS- PAGE), prestained protein marker dengan berat molekul 175-7 kda (NE Biolabs) yang terdiri dari MBP (maltose-binding protein) -β-galactosidase (175 kda), MBP-paramyosin (80 kda), MBP-CBD (chitin binding domain) (58 kda), CBD- Mxe Intein-2CBD (46 kda), CBD-Mxe Intein (30 kda), CBD-BmFKBP13 (25 kda), lysozyme (17 kda), aprotinin (7 kda), Peralatan yang digunakan antara lain spektrofotometer uv-vis (Yamato), sentrifus dingin (Sorvall), inkubator (thermoline), mikropipet (Axygen), pipet tip, alat-alat gelas (erlenmeyer, gelas piala, gelas ukur dan lain-lain), tabung eppendrof, tabung reaksi, timbangan analitik, homogenizer, peralatan elektroforesis termasuk power supply, dan kolom kromatografi.
19 3.3 Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu preparasi bahan baku berupa ikan bandeng dan ikan patin yang diambil dari kulit, daging, dan jeroan. Tahapan selanjutnya, yaitu purifikasi inhibitor katepsin yang meliputi ekstraksi inhibitor katepsin, presipitasi, dan dialisis, pemurnian dengan kromatografi, dan karakterisasi inhibitor. Tahapan metode penelitian dapat dilihat pada Gambar 4. Ikan patin dan bandeng segar Preparasi Kulit, daging, dan Jeroan Ektraksi Tiga Inhibitor katepsin kasar Ammonium sulfat variasi tingkat kejenuhan Pemilihan kantong dialisis Pengukuran aktivitas inhibitor dengan substrat katepsin Inhibitor protease kasar terbaik Pengendapan (presipitasi) Inhibitor semi murni Dialisis Karakterisasi: ph, suhu, stabilitas, ion logam Konsentrasi protein Karakterisasi Aktivitas, ph, suhu, stabilitas Konsentrasi protein Kromatografi Inhibitor Murni Karakterisasi Aktivitas inhibitor Berat molekul (SDS-PAGE) Gambar 4 Diagram alur kerja penelitian pemurnian inhibitor katepsin.
20 3.3.1 Ekstraksi Enzim Katepsin (Dinu et al. 2002) Ekstraksi dilakukan dengan preparasi sampel untuk memperoleh ekstrak kasar protease katepsin. Proses ekstraksi menggunakan ikan bandeng yang sudah post rigor. Daging ikan diambil dan disuspensikan dalam akuades dengan perbandingan daging ikan dan akuades sebesar 1:1, lalu dihomogenisasi pada suhu 0-4 0 C. Skema ekstraksi enzim katepsin dari ikan bandeng dapat dilihat pada Gambar 5. Daging ikan (100 gr) + akuades 1:1 Homogenisasi Pelet 1 600 x g, 10 mnt, 4 o C Supernatan Buffer tris HCl 0,1 M ph 7,4 (100 ml) + Pelet 1 10.000 x g, 10 mnt, 4 o C Supernatan Pelet 1 4.000 x g, 10 mnt, 4 o C Ekstrak protease katepsin Gambar 5 Diagram alir proses ekstraksi enzim katepsin dengan teknik differensial sentrifugasi (Dinu et al. 2002). Ekstrak daging hasil homogenisasi disentrifugasi pada 600 x g selama 10 menit dan supernatan yang diperoleh kemudian disentrifugasi lagi pada 10.000 x g selama 10 menit. Pelet yang dihasilkan dari hasil sentrifugasi kemudian dilarutkan dalam 0,1 M buffer tris-hcl ph 7,4 (lampiran 1) dengan jumlah yang sama seperti jumlah akuades tadi dan disentrifugasi pada 4.000 x g selama 10 menit. Hasil supernatan (ekstrak kasar protease katepsin) yang diperoleh merupakan protein utama dari mitokondria dan lisosom yang siap untuk diteliti aktivitasnya lebih lanjut.
21 3.3.2 Ekstraksi Inhibitor Katepsin (An et al. 1995) Ekstraksi dilakukan masing-masing pada bagian kulit, jeroan, dan daging ikan. Preparasi ikan bandeng dan ikan patin dilakukan saat setelah ikan dimatikan. Sebanyak 100 g sampel dihomogenasi dengan 100 ml akuades dingin (dibawah 4 o C), selanjutnya disentrifugasi dingin pada kecepatan 5.000 x g selama 30 menit. Supernatannya diambil dan ditambahkan buffer McIlvaine s ph 5,5 (dibuat dari 0,2 M sodium fosfat dan 0,1 M asam sitrat (lampiran 1)) dengan jumlah yang sama dengan supernatan. Campuran diinkubasi selama 10 menit pada suhu 60, 70, dan 80 o C, selanjutnya disentrifugasi kembali pada kecepatan 7.000 x g selama 15 menit. Supernatannya diambil dan disimpan suhu dingin. Hasil ekstraksi berupa ekstrak kasar inhibitor katepsin kemudian dianalisis aktivitasnya dan dipilih aktivitas dengan penghambatan tertinggi dari salah satu ketiga sampel (jeroan, kulit, dan daging) sebagai sumber inhibitor katepsin untuk dimurnikan lagi dengan presipitasi dan dialisis. Proses ekstraksi inhibitor enzim katepsin dapat dilihat pada Gambar 6. Sampel (100 gr) + akuades 1:1 Homogenisasi Pelet 1 5.000x g, 30 mnt, 4 o C Supernatan + Buffer Mcllvaine ph 5,5 (0,2 M sodium fosfat dan 0,1 M sitrat) Inkubasi (80 o C) selama 10 menit Pelet 2 7.000xg, 15 mnt, 4 o C Supernatan Ekstrak kasar inhibitor Gambar 6 Diagram alir proses ekstraksi inhibitor enzim katepsin dengan teknik differensial sentrifugasi (An et al. 1995).
22 3.3.3. Presipitasi dan Dialisis (Ustadi et al. 2005) Inhibitor katepsin ekstrak kasar dipresipitasi atau diendapkan dengan menggunakan ammonium sulfat ((NH 4 ) 2 SO 4 ) dengan variasi tingkat kejenuhan 30% sampai 80% (w/v). Pengendapan dilakukan dengan menambahkan garam ammonium sulfat ke dalam supernatan (ekstrak kasar inhibitor katepsin) sedikit demi sedikit. Campuran didiamkan selama semalam pada suhu sekitar 4 o C, selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 12.000 x g selama 30 menit. Hasil pengendapan, yaitu presipitat dilarutkan dalam buffer A (buffer McIlvaine s ph 5,5 yang dibuat dari 0,2 M sodium fosfat dan 0,1 M asam sitrat). Konsentrasi ammonium sulfat dalam ekstrak dapat dikurangi dengan melakukan proses dialisis menggunakan kantong dialisis dengan ukuran molecular weight cut off (MWCO) yang sesuai (12 kda). Proses dialisis dilakukan selama 4 jam dengan larutan buffer B yang dibuat dari 20 mm buffer Tris ph 7,5 yang mengandung 10 mm sodium azida dan 10 mm 2-merkaptoetanol. Hasil dialisis, yaitu inhibitor katepsin semi murni kemudian dimurnikan lagi dengan kromatografi. 3.3.4. Pemurnian dengan Kromatografi (Ustadi et al. 2005) Tahap pemurnian pertama dilakukan dengan kromatografi penukar ion dengan bahan pengelusi buffer B. Sedangkan matriksnya menggunakan kolom DEAE sephadex A-50 (3,0 x 30,0 cm) dengan laju aliran 1 ml/menit. Selain itu juga digunakan NaCl bergradien 0-0,7 M. Jumlah volume tiap fraksi ditampung sebanyak 5 ml. Masing-masing fraksi diuji konsentrasi protein dengan spektrofotometer uv λ=280 nm dan diukur aktivitasnya tiap fraksi dengan metode Dinu et al. (2002). Aktivitas inhibitor tertinggi dari tiap fraksi kemudian difraksinasi kembali dengan kromatografi gel menggunakan bahan pengelusi buffer B, sedangkan matriksnya menggunakan sephadex G-100 (1,5 x 40,0 cm) dengan laju aliran 0,5 ml/menit. Jumlah volume tiap fraksi ditampung sebanyak 5 ml. Masing-masing fraksi kemudian diuji kembali konsentrasi proteinnya menggunakan spektrofotometer uv λ=280 nm dan diukur aktivitasnya dengan metode Dinu et al. (2002).
23 3.3.5. Karakterisasi Inhibitor Katepsin Karakterisasi inhibitor katepsin dilakukan terhadap ekstrak kasar dan hasil pengendapan dengan ammonium sulfat. Karakterisasi meliputi penentuan suhu optimum, ph optimum, stabilitas panas dan ph, pengaruh ion logam, serta penentuan bobot molekul. 3.4. Prosedur Analisis Analisis yang dilakukan meliputi aktivitas katepsin, konsentrasi protein, dan aktivitas inhibitor katepsin. 3.4.1 Aktivitas Katepsin (Dinu et al. 2002) Aktivitas proteolitik dari katepsin diuji menggunakan hemoglobin terdenaturasi asam sebagai substratnya. Sebanyak 8% (w/v) hemoglobin dilarutkan dalam akuades dengan perbandingan 1:3. Kemudian ph dibuat menjadi 2,0 dengan HCl 1 N dan konsentrasi akhir hemoglobin dibuat menjadi 2% (w/v) dengan akuades. Prosedur pengukuran aktivitas katepsin disajikan pada Tabel 3. Tabel 3 Prosedur untuk mengukur aktivitas protease katepsin Pereaksi sample (ml) standar (ml) blanko (ml) Buffer tris 0,1 M ph 7,4 0,1 0,1 0,1 Katepsin 0,1 - - Tirosin - 0,1 - Akuades - - 0,1 Hemoglobin 2% 0,5 0,5 0,5 Diinkubasi 37 o C, 10 menit TCA 5% 2 2 2 Disaring dengan kertas saring Filtrat 1 1 1 Folin 1 1 1 Didiamkan pada 37 o C, 20 menit Diukur pada spektrofotometer λ 750 nm Aktivitas enzim katepsin dapat dihitung dengan rumus berikut: (Abs.sampel abs.blanko) UA = (Abs.standar abs.blanko) 1 x P x T Keterangan : UA = jumlah tirosin yang dihasilkan per ml enzim per menit P = faktor pengenceran T = waktu inkubasi (10 menit)
24 Sebanyak 0,5 ml dari larutan substrat diinkubasi dengan 0,1 ml larutan enzim pada 37 ºC selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 2 ml TCA 5% (w/v). Campuran disaring dan hasil reaksi yang dapat larut ditambah dengan 1 ml pereaksi folin. Campuran kemudian diukur dengan spektrofotometer pada λ=750 nm. Selain itu, dilakukan pula pengukuran untuk larutan blanko dan larutan standar dengan prosedur yang sama seperti larutan sampel, hanya untuk larutan blanko dan larutan standar enzimnya digantikan dengan akuades dan tirosin. Setiap sampel yang dianalisis harus disertai dengan blanko dan standar. 3.4.2 Uji Aktivitas Inhibitor katepsin (Dinu et al. 2002) Uji ini ditentukan dengan mengukur derajat penghambatan dari aktivitas katepsin menggunakan substrat hemoglobin (lampiran 2). Uji ini di mulai dengan mereaksikan ekstrak inhibitor 0,1 ml dengan katepsin 0,1 ml selama 30 menit pada suhu inkubasi 37 o C. Selanjutnya ditambahkan 0,5 ml dari larutan substrat hemoglobin 2% (w/v) dan diinkubasi kembali pada 37 ºC selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 2 ml TCA 5% (w/v). Campuran disaring dan hasil reaksi yang dapat larut ditambah dengan 1 ml pereaksi folin, kemudian campuran diukur dengan spektrofotometer pada λ=750 nm. Prosedur pengukuran inhibitor protese katepsin dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 Prosedur pengukuran aktivitas inhibitor katepsin Pereaksi sample (ml) standar (ml) blanko (ml) Buffer tris 0,1M ph 7,4 0,1 0,1 0,1 Katepsin 0,1 - - Inhibitor 0,1 0,1 0,1 Tirosin - 0,1 - Akuades - - 0,1 Preinkubasi 37 o C, 30 menit Hemoglobin 2% 0,5 0,5 0,5 inkubasi 37 o C, 10 menit TCA 5% 2 2 2 Disaring kertas saring Filtrat 1 1 1 Folin 1 1 1 Didiamkan pada 37 o C, 20 menit Diukur pada spektrofotometer λ 750 nm
25 Selain itu dilakukan pula pengukuran untuk larutan blanko dan larutan standar dengan prosedur yang sama seperti larutan sampel hanya untuk larutan blanko dan larutan standar, enzim katepsin digantikan dengan akuades dan tirosin. Setiap sampel yang dianalisis, harus disertai dengan uji aktivitas katepsin tanpa penambahan inhibitor. Aktivitas inhibitor dihitung berdasarkan perbedaan aktivitas enzim katepsin dengan inhibitor dan yang tanpa inhibitor. Aktivitas enzim katepsin dapat dihitung dengan rumus berikut: (Abs.sampel abs.blanko) UA = (Abs.standar abs.blanko) 1 x P x T Keterangan : P = Faktor pengenceran; T= waktu inkubasi (aktivitas katepsin dengan inhibitor) (aktivitas katepsin tanpa inhibitor) Persentase penghambatan = ( 1 x 100% ) Satu unit inhibitor katepsin adalah jumlah inhibitor katepsin yang mampu menghambat aktivitas protease katepsin sebesar 50% pada kondisi pengujian. 3.4.3 Pengukuran Konsentrasi Protein (Bradford 1976) Konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Bradford dengan bovine serum albumin sebagai standar. Persiapan pereaksi Bradford dilakukan dengan cara melarutkan 5 mg coomassie brilliant blue G-250 dalam 2,5 ml etanol 95% (v/v), lalu ditambahkan dengan 5 ml asam fosfat 85% (v/v). Jika telah larut dengan sempurna, maka ditambahkan akuades hingga 250 mililiter dan disaring dengan kertas saring Whatman#1 dan diencerkan 5 kali sesaat sebelum digunakan. Konsentrasi protein ditentukan dengan menggunakan metode Bradford dengan cara 0,1 ml enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan sebanyak 5 ml pereaksi Bradford, diinkubasi selama lima menit dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Demikian pula untuk larutan standar dilakukan sama seperti larutan sampel dengan konsentrasi antara 0,1 1,0 mg/ml. Tahap berikutnya adalah membuat kurva standar dengan absorbansi sebagai ordinat (sumbu y) dan konsentrasi protein sebagai absis (x)
26 (lampiran 3). Berdasarkan kurva tersebut dapat ditentukan konsentrasi protein dalam sampel. Tabel komposisi volume larutan dengan pembuatan larutan standar dengan konsentrasi 0,01-0,3 mg/ml dari larutan stok BSA konsentrasi 2 mg/ml disajikan pada Tabel 5. Tabel 5 Pembuatan larutan standar BSA konsentrasi 0,01-0,3 mg/ml Konsentrasi BSA (mg/ml) Volume BSA (ml) Volume akuades (ml) 0,00 0,00 10,00 0,01 0,06 9,94 0,02 0,10 9,90 0,03 0,15 9,85 0,04 0,20 9,80 0,05 0,25 9,75 0,06 0,30 9,70 0,08 0,40 9,60 0,10 0,60 9,40 0,20 0,10 9,00 0,30 1,50 8,50 3.4.4 Penentuan Berat Molekul dengan SDS-PAGE Metode SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) yang dikerjakan dalam penelitian ini menggunakan 4 % stacking gel dan 10% gel akrilamida (lampiran 4). Metode ini menggunakan matriks dari gel yang disusun oleh akrilamida dan N,N -metilen-bis-akrilamida yang berpolimerisasi melalui mekanisme radikal bebas dengan bantuan katalisator N,N,N,N,-tetramethylene-diamine (TEMED) dan inisiator ammonium persulfate (APS) (Rosenberg 1996). Komposisi pembuatan gel penahan dan pemisah SDS- PAGE dapat dilihat pada Tabel 6. Tabel 6 Komposisi gel penahan dan pemisah SDS-PAGE Komponen Gel pemisah (8%) Gel penahan (4%) Larutan stok akrilamida 2,66 ml 0,67 ml Buffer gel pemisah 2,50 ml - Buffer gel pengumpul - 1,25 ml Akuades 3,18 ml 3,00 ml Ammonium persulfat 10% 50,00 µl 50,00 µl TEMED 5,00 µl 5,00 µl
27 Konsentrasi akrilamida yang digunakan dalam analisis ini adalah 10% (w/v). Pewarnaan yang digunakan adalah pewarnaan perak. Deteksi SDS-PAGE dilakukan dengan melepaskan gel hasil elektroforesis dari cetakan dan diukur jarak migrasi bromphenol blue. Gel tersebut dicelup dan direndam dalam larutan fiksasi (25% methanol + 12% asam asetat) selama 1 jam sambil digoyang konstan. Kemudian direndam dalam 50% (v/v) etanol selama 20 menit, kemudian diganti dengan 30% (v/v) etanol selama 2x20 menit. Larutannya diganti dengan larutan pengembang kemudian dicuci dengan akuabidestilata. Setelah dicuci ditambahkan larutan perak nitrat selama 30 menit kemudian dicuci lagi dengan akuabidestilata 2x20 detik dan ditambahkan larutan campuran Na 2 CO 3 dan formaldehida dan terakhir dengan larutan fiksasi (lampiran 5).