6 berisi 300 ml air dan diencerkan sampai volumenya 575 ml. Larutan kemudian dipanaskan sampai mendidih dan dibiarkan selama 4 jam dengan api kecil. Volume dijaga tetap dengan menggunakan pendingin tegak, kemudian endapan lignin yang terbentuk dibiarkan mengendap sempurna. Larutan dienaptuangkan dan endapan dipindahkan ke kertas saring yang telah diketahui bobotnya. Endapan lignin dicuci dengan air panas sampai bebas asam (diuji dengan indikator universal), kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 105 C dan ditimbang sampai bobotnya konstan (B). Kadar lignin ditentukan dengan persamaan berikut: B Kadar lignin x 100% A Penentuan Bobot Molekul (Beckman dalam Friedrich 1952) Perhitungan bobot molekul lignin dilakukan melalui perhitungan bobot ekuivalen, yaitu sebanyak 0,5 gram lignin dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml dan dibasahi dengan 5 ml etanol. Campuran tersebut dibubuhi dengan 1 gram NaCl kemudian ditambahkan 100 ml air suling. Larutan tersebut dititrasi dengan NaOH 0,1 N sampai ph 7,5. bobot ekuivalen lignin dapat dihitung dengan persamaan: BE 1000 ml NaOH gram contoh N NaOH Penentuan Kadar Hidroksilfenolik (Goldschmid 1957) Sebanyak 0.1 gram tepung lignin dilarutkan dalam bufer 12 sebagai larutan stok. Larutan alkali lignin dengan konsentrasi 0.04 g/l diperoleh dengan mengambil 2 ml larutan stok, kemudian diencerkan sampai 50 ml dengan larutan bufer 12. Larutan netral lignin dengan konsentrasi yang sama diperoleh dengan mengambil 2 ml larutan stok, kemudian ditambahkan 2 ml H 2 SO 4 0.1 N dan diencerkan dengan larutan bufer ph 6 sampai volume 50 ml. Perbedaan absorbans diukur menggunakan spektrofotometer UV- VIS pada panjang gelombang 280-600 nm dengan larutan netral sebagai blanko. Kadar hidroksilfenolik dapat dihitung dengan persamaan: 17 Kadar hidroksilfenolik = Δa maks x 41 Pencirian Lignin menggunakan FTIR (Nada et al. 2002) Sebanyak 1 mg tepung lignin dicampur dengan 150 mg KBr lalu dibuat menjadi pellet dan dianalisis dengan FTIR. Pengujian Aktivitas Antioksidan (Pan et al. 2006) Lignin dilarutkan dalam campuran dioksana-air (9:1) dan dibuat larutan lignin dengan berbagai konsentrasi 0,001-5,000 mg/ml. Setiap larutan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ke dalam tiap tabung reaksi dimasukkan sebanyak masing-masing 320 µl larutan lignin, dicampurkan dengan 1180 µl larutan DPPH 6 10-5 M pada suhu 25 C selama 16 menit. Absorbans konsentrasi radikal DPPH pada 0 dan 16 menit diukur menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 515 nm. BHT digunakan sebagai kontrol positif. A (0) A (16 ) IP (%) = x 100% A(0) Persentase inhibisi diplot sebagai fungsi konsentrasi lignin. Dari grafik tersebut ditentukan konsentrasi lignin yang dibutuhkan untuk mencapai 50% IP yang diukur sebagai IC 50. HASIL DAN PEMBAHASAN Ciri Lindi Hitam Kraft Ciri lindi hitam yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1 Ciri lindi hitam kraft Pencirian Pengamatan Warna Hitam pekat Bau Telur busuk ph 12.58 Kadar air (%) 84.33 Bobot jenis (g/cm ) 1.11 Padatan total (%) 15.67 Secara visual lindi hitam yang digunakan berwarna hitam pekat (Gambar 5). Sjostrom (1998) menyatakan bahwa warna hitam pekat dari larutan sisa pemasak pulp disebabkan oleh adanya bahan organik dan anorganik yang larut atau tersuspensi dalam larutan setelah proses pemasakan bahan baku. Bahan organik tersebut di antaranya zat ekstraktif dan lignin yang terdegradasi (Fengel & Wegener 1995).
7 Gambar 5 Lindi hitam Bau lindi hitam kraft seperti telur busuk, hal ini disebabkan oleh adanya senyawa kimia yang mengandung sulfida, seperti metil merkaptan, dimetil sulfida ((CH 3 ) 2 S), dan dimetil disulfida (CH 3 -S-S-CH 3 ). Bau lindi hitam disebabkan adanya reaksi pemutusan ikatan metil aril eter pada salah satu unit penyusun lignin. Selain itu, bau tidak sedap pada lindi hitam juga disebabkan oleh terdegradasinya asam lemak menjadi asamasam lemak berantai pendek, seperti asam butirat, senyawa hasil degradasi karbohidrat, dan terbentuknya asam format dan asam asetat (Gilligan 1974). Derajat keasaman (ph) pada lindi hitam sebesar 12.58. Nilai ph cukup tinggi dan bersifat basa kuat, hal ini dikarenakan adanya penambahan senyawa NaOH dan Na 2 S pada proses pembuatan pulp kraft. Pada keadaan basa, gugus fenol pada lignin terionisasi menjadi gugus fenolat sehingga lignin dapat larut dalam air. Kadar air yang diperoleh pada lindi hitam sebesar 84.30% (Lampiran 3). Kadar air bernilai tinggi karena bahan baku sudah bercampur dengan air. Bobot jenis yang diperoleh pada lindi hitam kraft sebesar 1.11 g/ml (Lampiran 4). Bobot jenis lindi hitam lebih tinggi dari bobot jenis air, hal ini dikarenakan terdapatnya komponen kimia yang terkandung selain air, salah satunya adalah lignin. Padatan total merupakan residu yang diperoleh dari hasil penguapan lindi hitam pada suhu 105ºC (SNI 06-1839-1990). Padatan total yang diperoleh pada lindi hitam sebesar 15.67% (Lampiran 3). Padatan total dihitung untuk mengetahui rendemen lignin hasil isolasi dari lindi hitam. Nilai padatan total pada lindi hitam kraft berbahan baku kayu eukaliptus ini hampir sama dengan padatan total dalam lindi hitam kraft pinus yang dilaporkan Sjostrom (1995), yaitu sekitar 15-20%. Isolat Lignin Kraft Isolat lignin kraft merupakan lignin yang diperoleh dari isolasi lindi hitam. Isolasi lignin dilakukan menggunakan metode gravimetri dengan H 2 SO 4 20% (b/v) pada ph 2 (Kim et al. 1987). Pada ph 2, gugus fenolat menerima ion hidrogen secara maksimum menjadi fenol yang tidak larut dalam air (Gambar 6). Keadaan ini menyebabkan kelarutan lignin dalam air berkurang, sehingga lignin dapat dipisahkan dari senyawaan yang larut dalam air. Lignin yang terlarut dalam limbah cair pulp pada umumnya merupakan garam dari logam-logam alkali, khususnya natrium. Selain itu, menurut Barsinai dan Wayman (1976), penambahan asam kuat pada larutan sisa pulp dapat menyebabkan terjadinya degradasi polisakarida, dekomposisi kompleks lignin-karbohidrat, dan meningkatnya bobot molekul lignin karena adanya reaksi polimerisasi. Gambar 6 Reaksi pengasaman gugus fenolat pada lignin Endapan lignin yang diperoleh dengan pemisahan menggunakan sentrifus dilarutkan kembali dalam NaOH 1 N, hal ini bertujuan memisahkan endapan putih yang ikut mengendap dalam lignin. Endapan putih tersebut merupakan senyawaan organik dan asam organik yang tidak larut bersama lignin ketika ph dinaikkan. Pengendapan dan pelarutan yang dilakukan secara berulang menghasilkan lebih banyak ion natrium pada lignin yang dihasilkan. Efek pemurnian ini dapat diminimalisir dengan mencuci endapan menggunakan larutan H 2 SO 4, sementara anion asam sulfat dikurangi dengan pencucian menggunakan akuades (Kim et al. 1987). Ciri lignin hasil isolasi dari lindi hitam proses kraft disajikan pada Tabel 2. Isolat lignin yang dihasilkan berwarna cokelat, tidak berbau, dan tidak larut dalam air. Lignin tidak larut dalam air karena gugus hidrofobik dalam struktur lignin (Gambar 2) lebih meruah daripada gugus hidrofilik. Sjostrom (1995) mengemukakan bahwa unit fenil propana yang terdapat pada lignin lebih banyak mengandung gugus metoksil daripada gugus hidroksil fenol bebas, sehingga ikatan yang terjadi melalui ikatan-ikatan dengan unit-unit fenil propana yang berdekatan.
8 Tabel 2 Ciri isolat lignin Pencirian Pengamatan Warna Cokelat Bau Tidak berbau Uji kelarutan dalam air Tidak larut Rendemen (% b/v) 5.95 Rendemen (% padatan total) 28.56 Tingkat kemurnian (%) 81.14 Rendemen lignin terhadap volume lindi hitam atau padatan total berturut-turut adalah 5.95% atau 28.56%. ekuivalen 2010.58). Santoso (1995) menyatakan bahwa bobot molekul lignin Indulin AT (lignin standar) berkisar 1564-1764 (bobot ekuivalen sekitar 782-882), sedangkan bobot molekul Indulin AT berkisar (6714-6732) (bobot ekuivalen sekitar 3357-3336). Selain itu menurut Connors et al. (1980) penentuan bobot molekul dengan menggunakan kolom kromatografi gel didapatkan bobot molekul sekitar 370-44300. Hal ini mengisyaratkan bahwa bobot molekul lignin beragam mengingat lignin merupakan senyawa organik yang sangat kompleks yang terdiri atas sejumlah komponen zat penyusun yang sangat beragam sehingga sulit mendapatkan bobot molekul lignin secara pasti. Hidroksilfenolik Isolat Lignin Kraft Gambar 7 Isolat lignin kraft Kadar lignin dalam lignin isolat ditentukan dengan metode Klason. Pereaksi yang digunakan adalah H 2 SO 4 72% (b/v) yang berfungsi menghidrolisis ikatan eter antara lignin dan selulosa atau produk degradasi selulosa. Pada proses hidrolisis asam ini, selulosa larut sedangkan lignin tidak larut. Proses ini dilakukan karena lignin yang dihasilkan bukan merupakan lignin murni, sehingga diperlukan analisis untuk meningkatkan tingkat kemurniannya. Kadar lignin yang diperoleh dalam isolat sebesar 81.14% (Lampiran 7). Kadar lignin ini sama dengan kadar lignin yang dihasilkan oleh Lubis (2007), yaitu 81.48%. Metode asetil bromida bersifat efektif dalam menentukan kemurnian lignin pada contoh yang tidak seragam dan berjumlah sedikit. Selain itu, asetil bromida dapat melarutkan lignin secara total baik yang larut asam maupun yang tidak larut asam (Lin & Dence 1992). Bobot Molekul Isolat Lignin Kraft Salah satu faktor yang mempengaruhi fungsi lignin adalah bobot molekul. Bobot molekul merupakan salah satu sifat dasar suatu polimer lignin. Perhitungan bobot molekul dilakukan melalui perhitungan bobot ekuivalen (Lampiran 8). Beckman dalam Friedrich (1952) mengemukakan bahwa lignin merupakan senyawa kimia bivalen sehingga bobot molekul lignin adalah dua kali bobot ekuivalennya. Bobot molekul lignin isolat yang dihasilkan sebesar 4021 (dengan bobot Hidroksilfenolik merupakan salah satu gugus fungsi yang terdapat pada lignin. Gugus ini berperan dalam reaktivitas lignin selain dari gugus benzilik dan gugus karbonil. Dizhbite et al. (2004) mengemukakan bahwa komponen fenolik yang terkandung pada lignin berpotensi memiliki aktivitas antioksidan yang diuji dengan metode DPPH. Hasil penentuan kadar hidroksilfenolik menunjukkan adanya struktur fenolik tipe 1 dan 3 (Gambar 3) dengan kadar hidroksilfenolik lignin berturut-turut adalah 2.34 dan 2.38%. Kadar yang dihasilkan lebih rendah daripada kadar hidroksilfenolik lignin yang dihasilkan oleh Ardiansyah (2008), yaitu 2.73 dan 2.50%. Santoso (1995) mengemukakan bahwa kadar hidroksilfenolik pada lindi hitam sekitar 2.0-2.1%, sementara dalam indulin AT sekitar 2.2-2.3%. Adanya gugus hidroksilfenolik menyebabkan terjadinya reaksi antara lignin dan radikal bebas sehingga lignin dapat berperan sebagai antioksidan. Selain itu, gugus hidroksil fenolik juga berperan sebagai pusat penangkapan radikal bebas pada lignin sehingga lignin dapat berperan sebagai antioksidan. Setelah menangkap radikal bebas, gugus hidroksil fenolik akan membentuk radikal fenoksil yang stabil karena terstabilkan oleh resonansi. Stabilitas radikal fenoksil tersebut mempengaruhi aktivitas antioksidan lignin. Struktur fenoksil dengan subtituen yang mampu menstabilkan radikal fenoksil memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinngi (Pan et al. 2006).
9 Ciri Gugus Fungsi Isolat Lignin Isolat lignin diidentifikasi lebih lanjut dengan spektrofotometer FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy). Tujuan dari analisis gugus fungsi adalah mengidentifikasi gugus fungsi yang terdapat pada lignin hasil isolasi dan lignin Aldrich (sebagai pembanding). Spektrum FTIR lignin kraft dan lignin Aldrich disajikan pada Gambar 8. Spektrum FTIR lignin memperlihatkan pita serapan khas lignin (Tabel 3). Tabel 3 Ciri gugus fungsi lignin Bilangan gelombang Lignin Eukaliptus Lignin Aldrich Gugus fungsi 3393.52 3409.74 OH 2928.49 2931.34 C-H metil 1603.64 1596.27 C-C aril 1508.29 1508.65 C-C aril 1459.02 1460 C-H 1216.34 1220.20 ciri lignin guaiasil 1040.96 1042.33 C-H 825.58 850.25 S-O * Lignin Aldrich digunakan sebagai lignin pembanding Pita serapan O-H lignin klason terlihat pada bilangan gelombang 3394 cm -1, sedangkan pada lignin Aldrich pada bilangan gelombang 3410 cm -1. Serapan pada daerah bilangan gelombang 2928 cm -1 menunjukkan uluran C-H metil dan metilena, pada lignin Aldrich pada bilangan gelombang 2931 cm -1. Pita serapan 1604 dan 1509 cm -1 menunjukkan gugus C-C aril, sedangkan pada lignin Aldrich pada serapan 1596 dan 1509 cm -1. Serapan 1459 dan 1041 cm -1 pada lignin Klason dan 1460 dan 1042 cm -1 pada lignin Aldrich menunjukkan gugus C-H. Ciri lignin guaiasil terlihat pada bilangan gelombang 1216 cm -1 pada lignin Klason dan 1220 cm -1 pada lignin Aldrich. Serapan S-O terlihat pada bilangan gelombang 826 cm -1 sebagai hasil reaksi H 2 SO 4 yang mensubstitusi gugus OH alifatik pada proses Klason, sedangkan pada lignin Aldrich terlihat pada bilangan gelombang 850 cm -1. Menurut Fengel & Wegener (1995), pita serapan lignin pada daerah bilangan gelombang sekitar 1510 dan 1600 cm -1 menunjukkan vibrasi cincin aromatik dan antara 1470-1460 cm -1 menunjukkan deformasi C-H dan vibrasi cincin aromatik. Secara kualitatif, isolat lignin yang diperoleh merupakan senyawa lignin. 30.5 30 lignin Aldrich 29 28 27 S-O 26 25 24 23 %T 22 21 OH C-H Vibrasi cincin aromatik 825.58 Lignin Eukaliptus 19 2931.3 18 1508.2 1220.201122.9 3393.52 2928.4 1596.27 1424.1 17 1216.34 Ciri lignin 16 1508.6 guaiasil 1459.0 15 14.5 3409.74 4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 450.0 cm-1 1042.33 C-H Gambar 8 Spektrum FTIR lignin Klason dan lignin Aldrich
10 Aktivitas Antioksidan Lignin Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH. Konsentrasi lignin yang dibuat adalah 25-200 ppm (Lampiran 11). Lignin yang ditambahkan DPPH diinkubasi pada suhu 25ºC selama 16 menit. Suhu tersebut digunakan untuk mengoptimumkan aktivitas DPPH. Serapannya diukur pada panjang gelombang 515 nm. Metode ini berdasarkan pada penangkapan atom H + terhadap radikal bebas yang ditandai dengan tereduksinya warna DPPH. Warna DPPH dalam larutan contoh yang semakin pudar menunjukkan aktivitas antioksidan yang semakin meningkat. Hal ini disebabkan 1,1-difenil-2- pikrilhidrazil tereduksi menjadi 1,1-difenil-2- pikrilhidrazin yang stabil, sehingga nilai persen inhibisi dan persen inhibisi (IC 50 ) dapat dihitung. Lignin yang diisolasi dari kayu eukaliptus memiliki nilai IC 50 sebesar 42.68 ppm. Nilai IC 50 dari larutan lignin yang kurang dari 200 ppm memungkinkan adanya aktivitas sebagai antioksidan (Nikolova 2009). BHT digunakan sebagai kontrol positif yang merupakan antioksidan sintetik yang banyak digunakan secara luas dan memiliki mekanisme reaksi yang sama dengan lignin. BHT memiliki jumlah peroksida yang rendah, sehingga BHT mempunyai aktivitas sebagai antioksidan. Nilai IC 50 BHT sebesar 1879.53 ppm. Adanya gugus hidroksilfenolik dan bobot molekul merupakan salah satu faktor yang menyebabkan tingginya aktivitas antioksidan pada lignin. Stabilitas radikal fenoksil dan bobot molekul yang rendah mampu mempengaruhi aktivitas antioksidan pada lignin. Bobot molekul yang rendah disebabkan oleh depolimerisasi lignin akibat pemutusan ikatan eter yang menghasilkan gugus hidroksil fenolik yag baru. Bobot molekul yang lebih rendah menyebabkan lebih banyak gugus reaktif yang terpapar sehingga mampu meningkatkan reaktivitasnya sebagai antioksidan (Pan et al. 2006). Faktor lain yang mempengaruhi aktivitas antioksidan lignin adalah adanya komponen non-lignin seperti karbohidrat. Karbohidrat dapat menurunkan aktivitas antioksidan lignin karena gugus-gugus polar dalam karbohidrat dapat membentuk ikatan hidrogen dengan gugus fenolik lignin (Dizhbite et al. 2004). SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Lignin isolat yang diperoleh memiliki rendemen 6% (b/v) atau 29% per padatan totalnya. Kadar lignin yang diperoleh sebesar 81%. Bobot molekul lignin adalah sekitar 4000 yang ditentukan dengan pendekatan bobot ekuivalen. Pada penentuan kadar hidroksilfenolik dihasilkan tipe 1 dan 3 dengan kadar hidroksilfenoliknya sebesar 2.3-2.4%. Adanya vibrasi cincin aromatik dan deformasi C-H menunjukkan bahwa secara kualitatif isolat lignin yang diperoleh merupakan senyawa lignin. Nilai IC 50 pada larutan lignin kurang dari 50 ppm, yaitu sebesar 43 ppm. Hal ini berarti bahwa isolat lignin mempunyai aktivitas sebagai antioksidan. Saran Perlu dilakukan uji antioksidan secara in vivo untuk menentukan pengaruh aktivitas antioksidan lignin dan aplikasi selanjutnya. DAFTAR PUSTAKA Achmadi SS. 1990. Kimia Kayu. Bogor: Pusat Antar-Universitas Ilmu Hayati IPB. [AAPH]. 2,2-azobis-2-amidinopropana 2HCl. AAPH Description. [terhubung berkala] http://aaph/ chaymanchem. htm. [20 Mar 2009]. Apak R, Gűclű K, Özyűrek M, Çelik SE, Karademir SE. 2004. Novel total antioxidant capacity index for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric ion reducing capability in the presence of neocuproine: CUPRAC method. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52:7970-7981. Ardiansyah IP. 2008. Sintesis dan Pencirian Natrium Hidroksimetilfenol (Lignin Klason) Sulfonat [Skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. [ASTM] American Society for Testing and Material. 1981. Methoxyl Content of Pulp and Wood. ASTM D15120-81.